Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

要約

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

要約

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state¹ and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish^2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

概要

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days³. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede⁴, KiGR⁵, mEos2⁶, PS-CFP2 or Dendra2⁷ and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry⁸, PAGFP⁹ or PATagRFP¹⁰). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice².

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

プロトコル

1. H2B-PSmOrange mRNAのin vitro転写およびmRNAの精製

1. 製造業者の指示に従ってNotI制限酵素を用いてPCS2 +プラスミドを含むH2B-PSmOrangeを線形。
   注：mRNAの汚染や劣化を防ぐために、手袋や白衣などの適切な保護を使用して、次の手順を実行します。
2. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはフェノール - クロロホルムベースの方法を使用して線状化DNAを精製します。
3. 製造元の指示に従ってSp6の-mRNA転写のための線形化の鋳型DNA1μgのを使用してください。
4. 37℃で10-20分間、1.0 UのRNaseフリーのDNアーゼIを添加することにより、DNAを削除します。
5. RNAを製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップを使用したmRNAをクリーンアップします。
6. mRNAの純度および濃度を増加させるために、6μlの酢酸ナトリウム（3.0 M、pH5.2）を150μlの96％エタノールを添加することにより、mRNAを沈殿させます。メートルをインキュベート少なくとも30分間、および24時間まで-20℃でixedソリューション。
7. 4℃で45分間18.407×gで紡糸溶液により、mRNAを収集します。液体を捨て、150μlの70％エタノール中のmRNAを懸濁します。混合し、4℃でさらに15分間この溶液を遠心分離。 、液を捨て、氷上で5分間ペレットを乾燥し、20μlの超純RNaseを含まない水でのmRNAを懸濁します。
8. 100のmRNA希釈（99μlの超純RNaseを含まない水に1μlのmRNAの）：1の測光によるmRNAの濃度および純度を評価します。
9. 短期保存の場合、-20℃でのmRNAのソリューションを維持します。長期保存の場合、-80℃でのmRNAを保ちます。

ゼブラフィッシュ胚に2 H2B-PSmOrange mRNAのマイクロインジェクション

1. TG（foxD3：GFP）を使用して、注入前の交配ペア夜を設定します。 TG（FLH：GFP）ダブルトランスジェニック魚（または任意の他のGFPトランスジェニック魚）。スペーサーを配置することによって分離された魚を残しますそれらの間の交配の時間を制御します。
2. 注射の午前中にスペーサーを取り外し、20分間の魚の伴侶をしましょう​​。
3. 時間を交配時には、130頁の最終濃度にH2B-PSmOrangeのmRNAを希釈/ NLとmicroloaderチップを用いたマイクロインジェクションキャピラリーへの転送6μlの注射液（RNaseを含まない水で）。較正されたスライドガラスに注入量を確認してください。 2 NL mRNAの溶液（260頁）を注入する射出圧力を調整します。
4. 1xの胚（E3）培地を含む滅菌プラスチックペトリ皿に卵を収集します。
5. プラスチック製パスツールピペットを用いて射出皿に20〜30の胚を転送します。
6. 1細胞期¹¹で卵黄への細胞の細胞内へのまたはちょうど下の溶液を含む2 NLのmRNAを注入します。
7. 1×E3培地を含むペトリ皿に移す注入された胚は、未受精か正常に発達した胚を除去し、28℃でそれらを成長させます。
   注：ライトプロテクトO胚fを実験を通して必要とされていません。
8. 1×E3媒体にゼブラフィッシュの胚を高め、色素沈着を抑制するために、原腸形成した後、0.2 mMのPTU（1-フェニル2チオ尿素）を追加します。細菌汚染の危険性を最小限にするために1日2回培地を変更します。

3.胚の埋め込み

1. GFP（緑色）とPSmOrange（赤/オレンジ）蛍光ランプ及び適切な発光フィルターを装備した双眼顕微鏡を用いて共発現胚を選択します。 1×E3媒体を含む滅菌ペトリ皿に正の胚を移します。
2. 鉗子^12を用いて、実体顕微鏡下Dechorionate胚。
3. カット先端ピペット（P200）を用いて、超純水中で調製予め温めておいた1.0％低融点アガロース（LMA）の1.0ミリリットルを含む1.5ミリリットルチューブに1胚を転送します。注：80°CにLMAを温め、胚を埋め込む前に、室温で3〜5分間クールダウン。
4. 150μlのLMAに胚を移し微細なプラスチックチップを用いて、カバーガラスをチャンバー反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +（または他の任意の適切な顕微鏡）について記載した実験においてダウン、例えば背側の胚の向きを調整します。 LMAが重合されると、麻酔のために0.2 mMのPTUと0.02％の3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）を含む魚の水でチャンバーを埋めます。
5. サンプルを画像化する前に、トリカインの効果を確認するために15分を待ちます。麻酔は、明視野照明を装備した実体顕微鏡を使用してモニターすることができる胚の動きを、防ぐことができます。
   注チャンバは、二回再利用することができます。

4. PSmOrange光変換

1. 共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、それぞれGFPとPSmOrangeを画像化するための488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してphotoconvertする領域を特定するために、検体をスキャンします。
   注：反転STAに反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +を使用GE顕微鏡イメージングソフトウェアによってTiEcontrolledと488 nmの、561 nmおよび光電およびイメージングのための640nmのレーザーを装備。しかし、アプリケーションが確実であれば変換し、イメージング用のレーザラインが利用可能であるように、この顕微鏡に限定されるものではありません。
   1. 所定の場所に（NA：0.75; WD：1.0ミリメートル; FOV：0.64 X 0.64ミリメートル）20X空気目標を置きます。
   2. 客観上記の焦点面で測定された0.74ミリワット、561 nmのレーザー：光変換前PSmOrangeタンパク質を検出するために、次の顕微鏡の設定を使用します。
      注：これは、このシステム上の40％に相当する（焦点面で測定することが効果的なパワーを決定する唯一の方法です）。 H2B-PSmOrange注入の効率などの実験の必要に応じてレーザパワーを調整し変更することができます。
   3. 関心領域を強調するためにズーム倍率を追加します。高い倍率は、画像取得時間、したがって、光毒性を減少させます。
2. 被覆構造zスタックを取得488 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-> 4）で561 nmのレーザーを使用して、関心の秒。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。
3. サンプルをスキャンし、関心領域をphotoconvertにエリアをハイライトする（ROI）ツールを選択します。刺激領域としてROIを修正しました。写真アクティベーション/漂白モジュールを選択し、それぞれのチェックボックスをオンにして、488 nmのレーザーを活性化し、80％（客観的に測定された1 mWのレーザパワー）に488nmレーザーを設定します。 0.5秒/フレームへのスキャン速度を設定します。
4. 光変換ユーティリティ（ND刺激）を開き、光変換設定を指定します。
   1. 光変換プロトコルを指定するには、「追加」コマンドをクリックします。
   2. 「取得/刺激」メニューの「取得」の「フェーズ」1に設定し、画像の数が「ループ」メニュー内の光変換前に取得することを示しています。
   3. セント "に設定し、「フェーズ」2imulation「刺激イベントの数を入力するには、実行されます。
   4. 調整 "フェーズ" 3 "相" 1.オプションで説明したように、画像取得の最後のラウンド前に待機する時間を入力して、「フェーズ」2後の待機「フェーズ」を挿入します。
   5. すべてのパラメータを設定したら、刺激の設定を適用し、光変換を実行します。
      注意：レーザーパワーを、光変換の各ラウンドのためのスキャンおよび反復回数の周波数が変動し、胚から胚に異なる場合があります。で開始する設定を表1に示します。
5. 488 nmの、561 nmおよび上記のように設定を適用する640 nmのレーザーを使用して、最終的なzスタックを取得します。 （4.5 mWまで）高いレーザパワーを使用して、変換PSmOrangeを可視化するために640 nmのレーザーを設定します。

LMAから5.ディスマウント胚

1. 顕微鏡からチャンバーを含む胚を削除してください。慎重にアガロースのuから胚を削除鉗子を歌います。
2. 新しい滅菌プラスチックペトリ皿にまたは1x E3および0.2 mMのPTUを含む滅菌6ウェルプレートに胚を移します。開発の所望の段階まで、28℃で胚をインキュベートします。

6. Photoconverted PSmOrangeタンパク質発現細胞の運命を分析

1. ポイント3.3と3.4で説明したように、胚を再埋め込みます。
2. 共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、関心のGFPトランスジェニック構造（488 nm）の中でphotoconverted細胞（640 nm）を識別するための試料をスキャンします。
3. 488 nmの、561 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-> 4）で640 nmのレーザーを使用して、関心の構造をカバーzスタックを取得します。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。
4. これは共発現GFPとphotoconvertedタンパク質、細胞を同定するために、次のいずれかの方法を使用します。
   1. カスタム作られた自動フィジーイメージJマクロ³
      1. コンボリューション「GaussianBlur」プラグインを使用して、元のスタック（→プロセス→GaussianBlur→フィルター）と「画像電卓」プラグイン（→プロセス→イメージ電卓）を使用して、元からのスムーズなスタックを引きます。関心の構造を視覚化し、分析のための計算時間を短縮するために、この手順を使用します。
      2. photoconvertedセルを強調表示するために、緑と遠赤チャンネルに特定のしきい値を適用します（→イメージ→→しきい値を調整します）。適切な設定で、閾値領域を検出するために、「粒子の分析」ツールを使用します（→粒子を分析→分析）。
      3. 「イメージ電卓」プラグインを開き、黄色（→プロセス→イメージ電卓）に緑と遠赤​​のチャンネルに重複の関心領域を表示します。
   2. 3Dデータ評価のための顕微鏡イメージング・ソフトウェア
      1. スタックを表示しますショーのボリュームビューオプション（→3Dビジュアライゼーションメニュー→表示ボリュームビュー）を使用して3D。 、緑、赤と遠赤色のチャンネルを選択明るさとコントラストを調整し、photoconvertedエリア（ 図1）を強調するために3Dスタックをトリミングするグラフィックインターフェースを使用してください。
         注：データを分析するための同様の方法は、画像解析のための一般的なソフトウェアのほとんどで利用可能です。

結果

図1は、PSmOrange光変換システムの一例を示す図です。松果体複合体は、脊椎動物の背側間脳に保存された構造です。多くの他の脊椎動物のように、この複合体は、間脳の中心部にある松果体器官および左側parapineal細胞で構成されています。エレガントが、時間のかかるアンケージング実験はparapineal細胞が松果体臓器¹³の前部に由来することを示し...

ディスカッション

蛍光レポーターを有するトランスジェニック胚は、胚の発達を理解するために根本的に貢献しています。しかし、特定の構造の特定の視覚化を容易にするプロモーターに必須の必要性が依然として存在します。彼らの不在下では、研究者が興味のある構造の起源と発展について調べるために、このような蛍光タンパク質の光変換などの技術に依存しています。これにより、その発達に関与す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Purification Kit	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit	Qiagen	74204
Plastic Pasteur	alpha laboratories	LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid	Addgene	31920	The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector	Eppendorf	5247 000.013
Forceps (5 Inox)	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number