腸管虚血 - 再灌流傷害のマウスモデル

要約

ここでは、フィールド全体でこの技術の標準化を促進するために死亡することなく、再現性の傷害をもたらすマウスにおける腸管虚血再灌流の詳細な手順を説明します。腸管虚血再灌流障害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。

要約

腸管虚血は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、低血圧、壊死性腸炎、腸移植、外傷および慢性炎症などの臨床症状の広い範囲に関連した生命を脅かす状態です。腸管虚血再灌流（IR）傷害は、腸の損傷をもたらす、腸間膜血管を介して不十分な血流によって引き起こされる、急性腸間膜虚血の結果です。再灌流後の虚血は、さらに腸の損傷を悪化させることができます。 IR損傷のメカニズムは複雑であり、十分に理解されています。したがって、実験小動物モデルは、IR傷害の病態生理学及び新規治療法の開発を理解するために重要です。

ここでは、死亡することなく、小腸の再現可能な損傷を与える急性腸IR傷害のマウスモデルを記述しています。これは、時間的にオクルディンによって回腸遠位部の領域における虚血を誘導することによって達成されます。グラム微小血管クリップを使用して、60分間の上腸間膜動脈の末梢と端末側副枝。 1時間の再灌流、または組織学的分析によって調べ腸の再現可能な損傷で傷害の結果の後に2時間。微小血管クリップの適切な位置は、手続きのために重要です。したがって、ビデオクリップは、この技術の詳細な視覚的なステップバイステップの説明を提供します。腸IR傷害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。

概要

腸は、虚血及び上皮損傷の原因となる血流の遮断に非常に敏感です。虚血後再灌流は、組織の再酸素化を提供し、さらに病状を促進することができます。したがって、腸管虚血および再灌流傷害は、壊死性腸炎、小腸移植における同種移植片拒絶反応、腹部大動脈瘤手術、心肺バイパス、および炎症性腸疾患^1,2の合併症を含む病態の広範な、関連付けられています。腸IR傷害、特に急性腸間膜虚血は、罹患率および死亡率³で ​​得られた生命を脅かす状態です。

十分に理解するが、腸の虚血再灌流（IR）傷害は、腸内微生物叢ならびに活性酸素種と、炎症性サイトカインおよびケモカイン^1,4-6の生産における変化と関連すると考えられています。これは、両方の活性化につながりますネイト炎症および組織損傷の^1,7,8を促進適応免疫機構。

彼らは簡単にgain-と機能喪失の遺伝的実験を可能にするように動物モデルは、IR傷害のメカニズムを理解するために重要です。 IRのいくつかの動物モデルは、完全な血管閉塞、低流量虚血を含むが開発、および（最近の包括的なレビュー⁹にまとめた）血管閉塞をセグメント化されています。上腸間膜動脈（SMA）の完全な血管閉塞によって引き起こされる腸管虚血は、大型動物やげっ歯類^9-11のIRの簡単で一般的に使用されるモデルです。しかし、腸の異なる領域は、損傷に対して異なる感受性を持っています。また、麻酔薬、鎮痛薬、動脈閉塞技術、ならびに傷害の可変度における虚血性損傷と回復結果の期間における矛盾の多様な範囲は、複数のstudie全体のIRの生物学の我々の理解を混乱させるsである。 表1は、ネズミのIR研究におけるこれらの不整合を示しています。短い虚血時間（30-45分）を使用してからの最大の欠点は、症例と対照の間に識別可能な差異が観察できる時に回復のウィンドウをターゲットにしています。上皮の軽度の損傷は、再灌流後の時間を解決することができるので、専門の病理学的指標は、上皮反発の違いを見つけることが必要になることがあります。対照的に、過度の損傷は、虚血性傷害の100分から見た死亡率、および回復時間を増大させる、復元がもはや不可能である上皮の完全denudementもたらし得ます。そこで、ここでは私たちのフィールド全体でこの技術の標準化を促進するために死亡することなく、再現性の傷害をもたらすマウスにおける腸IRの詳細な手順を説明します。腸IR傷害のこのモデルは、損傷および再生の細胞および分子メカニズムを研究するために利用することができます。

プロトコル

動物研究は、健康ガイドラインの国立研究所に従って行われ、動物実験によって承認されたとトルドー研究所の委員会を使用しています。 8-12週齢のC57BL / 6マウスを研究に使用しました。

外科1.準備

1. 準備と手術器具を滅菌します。
2. ノーズコーン、および加熱パッドでイソフルランベースの麻酔システムを準備します。加熱されたパッドが（<39ºC）を過熱されていないことを確認してください。
3. イソフルランガス掃気キャニスターがブロックされたり、任意の方法で閉塞されていないキャニスターの底部に排気口を確保するために正しく配置されていることを確認してください。キャニスター上の手続きや書類の重量の前に掃気キャニスターを計量。キャニスターの重量が累積重量（〜12時間）の50グラムを超えたときにキャニスターを捨てます。

2.麻酔

1. 誘導室中の3％イソフルランでマウスを麻酔（1 L /分O _2）。
   1. 意図的な随意運動、瞬目反射の消失、筋弛緩、および反射刺激（事務所の圧力でつま先や尾ピンチ）に対する応答の損失の直立し、損失を維持することができないことによって麻酔深度を評価します。
   2. 胸壁と腹部の動きを観察することによって、呼吸速度およびパターンを評価します。最適な麻酔下、呼吸数は、毎分〜55-65呼吸でなければなりません。
   3. 誘導チャンバーからマウスを外し、すぐにマウスの腹部領域を剃ります。
2. 角膜の乾燥を防ぐために、目に当たり障りのない眼軟膏を配置します。
3. 加熱されたパッドの上にマウスを置き、麻酔システムにノーズコーンを介して接続します。ラテックスノーズコーンの膜がしっかりとマウスの頭の上にフィットし、イソフルランのない漏れがないことを確認してください。
4. 1.5パーセントにイソフルラン率を低下させ、ブプレノルフィン（0.1ミリグラム/キログラム）と痛み-カスケードのワインドアップを防止するために、ケタミン（10mg / kgの）皮下注射します。
5. 目を拭きベタジン外科的な解決策を染み込ませた滅菌綿棒で操作エリアのEの皮膚を70％エタノールに続きます。

3.手術

1. オペレーティングハサミで正中線3〜5センチメートル開腹術を行います。生理食塩水で湿らせた無菌の非接着パッドで操作エリアをカバーしています。盲腸および回腸を分離し、食塩水で湿らせた綿棒を使用して、上腸間膜動脈を露出させます。
2. 適用するクリップを容易にするために、優しくドレッシング鉗子で腸を高め、目的のクリップ位置（ 図で上腸間膜動脈の両側に腸間膜をカットし、微細なアイリスを使用して、上腸間膜動脈の周囲の腸間膜の小さなニックはこれを行うscissors.To作ります1A）。その後、クリップを適用する前に、目的のクリップ位置の領域に滅菌生理食塩水を数滴を追加します。
   注：偽手術を実行するには、3.2のステップに外科手術をフォローアップ。クリップを適用しないでください。その代わりに、追加された暖かいsが湿った組織を維持1時間3.6で説明したようにアリーン。その後、4.1に進み、
3. 盲腸（ 図1B）に隣接した虚血性回腸5-7センチの領域を作成するために、クリップアプライヤーを使用して、微小血管クリップ（70グラム力）と上腸間膜動脈の一次枝を閉塞します。血管の位置は保守的ではあるが、（ 図1上の例を参照）マウスとの間にわずかな変動があるかもしれません。したがって、2または3クリップが通常必要とされている（ 図1A、D、E、黒矢印上のクリップの位置を参照）。
   注意：高品質の容器クリップを使用してください。高圧クリップは、血管を損傷し、完全に血液の流れを遮断しないことがあり、低圧クリップ（<30グラム）に対し、再生を防ぐことができます。
4. 虚血性腸の領域（ 図1）マーキングを解除、船舶全体で2微小血管クリップを用いて腸（40グラムの力）を介して側副血流を遮断します。側副血管の閉塞をすることが要求されます隣接する血管から血液供給を防止する（ 図1A、D、E、緑の矢印上のクリップの位置を参照）。
5. オプション：血液凝固を防止するためにヘパリン溶液（6 USP単位/ ml）を、追加します。滴下は、単離された腸にヘパリン溶液の0.5ミリリットルを追加します。
6. 生理食塩水で湿った無菌の非接着パッド繊細なワイプは、37℃にあらかじめ温め、手術領域に適用されます。ワイプは、全手順の間に濡れたままであることを確認してください。
7. 全体で1から1.5パーセントイソフルラン麻酔を使用して、60分間の虚血を維持します。虚血手順が正しく実行されている場合は、虚血領域は、約30分間で色がワインレッドに変わります。成功した閉塞を示す虚血（ 図1、右パネル）の間に拡大されたクリップの位置から遠位その血管に注意してください。
8. 密接に虚血段階でマウスを監視します。手術部位をカバーする非接着パッドに食塩水を適用し続けます。
9. マーク組織にGill`s 3ヘマトキシリン20μlのをピペットにより虚血領域のエッジが（ 図1E、右パネル）を比較のために同じマウスからの虚血組織と隣接する健康な組織を採取容易にします。

4.再灌流ステー​​ジ

1. 虚血の終わりにクリップ領域に生理食塩水を数滴を追加し、静かにクリップアプライヤーで微小血管クリップを削除します。そして、静かに生理食塩水湿らせた綿のヒントを使用して戻って腹腔への腸を押してください。非接着パッドを取り外し、9ミリメートルのステンレス鋼創傷クリップを使用して腹壁と皮膚を閉じます。再灌流を3時間よりも長く実行された場合は、皮膚に創傷クリップを適用する前に、腹壁を閉じるには、吸収性ビクリル縫合糸を使用しています。
2. 再灌流相の所望の時間（30分、60分、120分、または180分）のために加熱された清潔なケージにマウスを維持します。
3. 動物に安定性を確保するために、少なくとも30分ごとに確認してください。

5。剖検および小腸の収穫

1. 再灌流後所望の時間に頸椎脱臼に続いてCO ₂過剰投与によりマウスを安楽死させます。
2. 腹腔を開き、さらなる分析のために、虚血性腸組織を収集します。傷害に任意の全身反応のためのアカウントへの内部コントロールとして、傷害を受けた組織に隣接ハーベスト健康で正常な組織。
   注：このコントロールは、偽手術マウスは、IR誘導性の損傷に対する全身反応を受けないため、偽の対照マウスを操作するよりも、より適切です。
3. 生理食塩水で満たされ、その後、縦方向に腸を切っ添付胃管栄養針を30ミリリットルの注射器を使用して、腸の内容物を洗浄します。腸のサンプルを遺伝子発現分析に必要とされる場合は、縦方向に1.5ミリメートルの断片を切断し、組織学的分析のために残りの部分を使用します。
4. 組織学的分析のために、INTESTをロールピンセットを使ってロールケーキを準備INE。
5. ロール状を維持するために、組織カセット（ 図2）に生検フォームパッド間の腸のピースを置きます。 10％緩衝ホルマリン中にカセットを置きます。
6. 少なくとも24時間ホルマリンで組織を修正しました。さらに24時間、70％エタノールでホルマリンを交換してください。室温で無期限の70％エタノールに保管組織。
7. パラフィンに埋め込 ​​み、5μmの切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンは、標準的なプロトコル（図3）を用いて染色。

6.得点

1. 表2にまとめたように、マウス虚血-再灌流傷害のスコア。適切な採点方法を選択します。
2. オプション：損傷の重症度は、セクション全体で変化するため、4つのセクションに視野を分割します。
3. 盲目的に得られたスコアから各セクションの平均等級を計算します。
4. 例と対照との間だけでなく、目に損傷組織のグレードを比較eはダンの多重比較検定に続いてクラスカル・ウォリステストを、使用して組織を無傷。

結果

我々は、マウスにおける回腸の再現性のIR誘導性の傷害を得るために、IR手術の実験プロトコルを最適化しました。代表的な結果は、このセクションで実証されています。

図1は、回腸の虚血を誘導するために、微小血管クリップ位置の例を示しています。黒の矢印は、上腸間膜動脈の一次枝を閉塞メインクリ...

ディスカッション

腸IR傷害のマウスモデルの開発は非常に組織損傷のメカニズムの理解を改善し、組織損傷^7,9,11,34を最小限にするために潜在的な治療戦略の開発を支援しています。このプロトコルの重要なステップは、微小血管クリップの適切な位置決め、IR傷害の虚血と適切な組織学的評価の正しいタイミングです。

虚血の持続時間は、その後の上皮傷害のために重要です。実?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline