開発<em&gt;インビトロ</em&gt;眼プラットフォームはコンタクトレンズをテストします

要約

コンタクトレンズ（のCL）および他の眼関連のアプリケーションを評価するための現在のin vitroモデルは厳しく制限されています。提示眼のプラットフォームは、生理的な涙の流れ、涙ボリューム、空気暴露と機械的摩耗をシミュレートします。このシステムは、非常に汎用性とのCLで分析インビトロで種々に適用することができます。

要約

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,^1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.⁷ The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

概要

コンタクトレンズ（CL）アリーナ内の関心のある二つの重要な領域は、不快感や小説CLアプリケーションの開発が含まれています。 CLの不快感を根底にあるメカニズムを解明することは、新規の開発^8。何十年もの間、フィールドの目を逃れている問題であるような薬物送達デバイス^1,3,9およびバイオセンサーなどの機能の^{CL、10月12日には、}関心の領域ですかなりの潜在的な市場と。両方の状況では、 インビトロモデルにおける高度な開発フェーズの間、適切なレンズ材料又は設計特性を選択することを支援するための関連情報を提供するであろう。残念ながら、のCLおよび他の眼関連のアプリケーションを評価するためのin vitroモデルの電流は比較的原油と洗練されていないです。伝統的に、涙液層の堆積または薬物送達を評価するin vitroでのCLの研究は、固定された流体体積を含む静的な、大容量のバイアル中で行われるのGreATLY生理量を超えています。さらに、この単純なモデルは、自然の涙流れ成分と点滅反射を欠いている眼の環境の要因を定義しているどちらも。

洗練されたの開発は、生理学的に関連の眼」モデルは、「学際的なアプローチを必要とし、実質的なin vivoでの検証が必要になります。これらの理由から、私たちのin vitro眼モデルのための基本的な枠組みは、モデルが継続的に将来のアップグレードおよび変調によって改善することができるように、汎用性の高いです。現在までに、モデルは、涙液量、涙液の流れ、機械的摩耗及び空気曝露をシミュレートすることが可能です。その目的は、in vivoおよびex vivo観察中に予測し、無料で意味のある結果を提供するin vitroモデルを作成することです。

プロトコル

すべての実験は、大学のウォータールーの動物実験倫理委員会によって概説関連するすべてのガイドラインに従っやコンプライアンスに完成しました。ウシ目が寛大に地元の食肉処理場から寄贈されています。

1.アイモデル

1. 金型¹³の設計と製作
   1. ヒト成人の目の平均生理寸法に従って目のモデルを設計します^。13
   2. 眼球と眼球モデルのまぶた片間250μmのギャップを残します。コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、それぞれの金型を設計します。
   3. AutoCADのか、SolidWorksの持つ新しい.CADファイルまたは.sldprtファイルを作成します。人間の眼球/まぶたの3Dモデルを作成します。モデルの金型を作成し、.STLファイルとして金型を保存します。
   4. 3Dプリンタソフトウェアにインポート.STLファイル（replicator2用など、makeware）。印刷のパラメータ（位置、まばら、スケール、向き、滑らかさ、 などを指定します の^）13。
   5. 読むために3Dプリンタ用のGコードファイルとしてファイルを保存します。このようなPLA（ポリ乳酸）、ABS（アクリロニトリルブタジエンスチレン）、PC（ポリカーボネート）、またはそれらの組み合わせのような選択の材料は、金型^13を印刷します。
   6. 選択の材料の所望のフィラメントをインストールします。読むために3DプリンタにGコードファイルをインポートします。金型を印刷します。
      注：眼モデルに滑らかな表面が望ましい場合あるいは、コンピュータ制御の数値（CNC）マシンを使用して目の型を作り出します。 CNC金型製造のために、金型の材料は、もはや熱プラスチックに限定されないが、金属、セラミックス、およびポリテトラフルオロエチレンなどの化学的抵抗性ポリマーに延びています。
   7. 切削ドリルに接続されたCNCソフトウェアのインターフェイスを開きます。前面、上面、側面、および制御ソフトウェアインターフェイスで以前に構成された眼球/瞼モデル金型の斜視図に従って3次元金型を構築します。以下のための適切なパラメータを選択します加工（ビットサイズ、基板材料、材料の厚さ）と、金型を切断するために進みます。
2. PDMSを用いた接眼レンズの合成
   1. 注射器を使用して、PDMS（ポリジメチルシロキサン）ベースの10ミリリットル体積を測定し、15〜50ミリリットルの遠心管にそれを埋めます。 PDMSの全重量のエラストマー溶液のw / vの10％を追加します。攪拌棒を使用して、よく溶液を混合。
   2. 眼球とまぶたの型にPDMSソリューションを注ぎます。 PDMSは、重合を開始し、気泡がポリマーの外に溶解することを可能にするRT O / N（または少なくとも12時間）で安定することを可能にします。
      注：上昇または展開されますPDMSに残って気泡がないことを確認します。
   3. その後、1時間、または5分間150°C（302°F）、75℃（167°F）のオーブンに型を入れました。より柔らかいゲルについては、PDMSが完全に重合するために、少なくとも48時間室温で放置します。
   4. 数分間冷凍庫にサンプルを置きます。これは、PDMSを縮小し、簡素化されます金型からのサンプルを除去します。薄いへらを使って型から接眼レンズを抽出します。
   5. 眼球とまぶた片の間の空間への溶液の送達のために、1月16日「同等の脚カプラチューブコネクタと1/16 "×1/8"ポリテトラフルオロエチレンチューブを接続し、チューブの穴でまぶた片にそれを添付。
3. アガロースを使用した眼球ピースの合成
   注：眼球片は、アガロースのような他のポリマーを用いて合成することができます。以下の手順は、例えば、PDA（ポテトデキストロース寒天）またはSDA（サブローデキストロース寒天）寒天タイプの様々な眼の部分を生成するように改変することができます。
   1. 2％（2グラム/ 100ミリリットル）ゲル、メジャーアガロースの2グラムを生成し、超純水100mlと混合します。アガロースが完全に溶解するように沸騰（100ºC）に対する解決策をもたらします。溶液を5分間クールダウンしてみましょう。
   2. 眼球の金型への溶液を注ぎ、溶液を3のために冷却することができますRTで0分。スパチュラで眼球の部分を削除します。 -20で眼球寒天を保存 後で使用するために℃の冷凍庫。微生物学研究のために、オートクレーブ処理および/またはUV照射による眼球型を滅菌します。
4. PDMS眼球上のウシ角膜の取り込み
   注：このプロトコルは、Parekh らから適応されています^14。
   1. 層流フードの下で無菌状態のウシ角膜の解剖と取り込みを実行します。目を取得し、同じ日に、それらを分析。
   2. 使用前に10分間のフローフードを回して、70％エタノールアルコールで消毒します。すべての材料と器具が273°F / 45分間133℃でオートクレーブで滅菌され、および流フードの入り口から無未満4インチを位置付けていることを確認してください。
   3. 2分間の希釈ポビドンヨード溶液の入ったビーカーに牛の目を浸し。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）Pを含有するビーカー中に眼をすすぎますH 7.4。鉗子を使用すると、静かにガラスシャーレ、角膜顔アップに目を配置します。
   4. 平滑末端解剖ハサミで強膜付着点で切断することにより、過剰な筋肉と脂肪組織を削除します。動物の排泄物に指定された無菌ビーカーに過剰な組織を処分。
   5. マイクロはさみを使用して、眼から結膜を削除します。角膜輪部から1cm以上の距離を維持し、滅菌ガーゼで目を包みます。
   6. 下にある脈絡膜および硝子体の侵入を避けるためにメスを用いて、強膜に表面的に縁領域とから約2mmの切開。慎重にその自然な湾曲から角膜を変形させることなく、メスや解剖ハサミを使用して360°だけ切開部を拡張します。
   7. 細かい鉗子で、目から角膜を削除します。鉗子を使用して、慎重に任意の付着ブドウ膜組織を除去し、PBSで角膜をすすぎます。
   8. 文化と滅菌容器に31ºCで角膜を保存培地（培地199など）組織の水分および細胞栄養を維持するために、3％ウシ胎児血清を含有します。
   9. 実験に先立ち、PDMSの眼球の摘出した角膜を休ま、および特殊なクリップオンと一緒に2枚をクランプします。

2.点滅プラットフォーム

1. ブリンク・プラットフォームの設計と製作
   注：眼（セクション1で説明した）モデル、ギアシステム、および電子システム：点滅プラットフォームは、3つの機能部品で構成されています。
   1. 眼モデル（セクション1.1）のために記載したのと同様のCADや3Dプリントを使用して、点滅プラットフォームを設計・製造しています。それは接眼レンズの横方向と回転運動にモータの単純な回転を変換するようなギアシステムを設計します^。15
   2. ピニオンギア機構を用いて、瞼の部分に接続されたピニオンの横方向の運動にステッピングモータの回転運動に変換します。
   3. 使い方共役ギアシステム、三つの異なる眼球片のための3つ（またはそれ以上）の回転運動にステッピングモータから一方の回転運動を増幅します。
   4. 2間の距離が一定になるように、2ギアシステム、まぶた用と眼球のための1つを合わせます。マイクロコントローラ、モーターシールド、および二つのモータと電子システムを組み立てます。
      注：点滅運動にギアシステムによって翻訳された回転モータを、提供するために、2つのステッピングモータを使用してください。
   5. マイクロコントローラ上に積層モーターシールドからなるシステムを持つ2つのステッピングモータを接続します。オープンソースソフトウェア製品で動作するように電子部品を接続して設定します。
   6. このような毎分ラウンド（RPM）、前方ラウンド数、後方ラウンド数、および旋回スタイルとしてモータパラメータを制御するためのシステムをプログラム。
      注：詳細については、補足「Arduinoのコードファイル」を参照してください。
   7. ミリアン​​ペアからシステムソフトウェアをダウンロードnufacturersのウェブサイト。
   8. ソフトウェアをインストールし、それを開きます。所望の形状にステッピングモータを制御するためのコードを記述します。研究者によって定義されるようにモータが所望の方法で移動するように電子システムに電力を供給するために、ソースをシステムに接続します。
      注：補足「Arduinoのコードファイル」を参照してください。
2. マイクロフルイディクス（人工涙液）との組立
   1. 合成された眼球とまぶたのピースを取ると目をモデルに、それらに対応するクリップオンにそれらをスリップ。注射器で参加し、まぶたピース（セクション1.2.5）を持つマイクロ流体ポンプ上に配置されたチューブを接続します。テストは、プラットフォームを実行し、一貫性のある動きをチェック。
   2. プライムチューブと人工涙液（ATS）の安定した流れを確認してください。 ATSのレシピは、以前に報告されている^。16
   3. 手動で、水平面上で一緒に目をモデル部品を移動させるように眼球と目蓋は接触しています。所望の値にマイクロ流体ポンプの流量を設定します。 1〜1.5μL/ minに生理的な流量を設定します^。17
   4. 実験を開始するために、ポンプとアクチュエータを起動します。薬物送達実験のために、眼球片に薬剤を含有するコ​​ンタクトレンズを置きます。
   5. フロースルー液を12ウェルプレートに滴下することを可能にします。所望の設定時間間隔で、例えば、紫外可視分光法または蛍光などの一般的な検出方法を使用して、分析物または薬物濃度を定量する^。1,4,18
   6. コンタクトレンズ上の涙成分の沈着を評価する研究については、「眼球」片にコンタクトレンズを配置します。廃棄することができるフロースルー液を、収集します。
   7. 所望の時間間隔の後、眼球片からコンタクトレンズを除去し、そのような共焦点顕微鏡などのさらなる分析のためのレンズを準備します。

結果

機械工場から3-D印刷から得られる合成目の鋳型は、 図1に示されている。これらの型は、所望の特性を有する接眼レンズを製造するために、例えば、アガロースPDMSとのようなポリマーの様々な使用することができます。マイクロ流体シリンジポンプと眼モデルプラットフォームの合図アセンブリは、図2に示されている。プラットフォームは?...

ディスカッション

設計と製造の金型（1.1節）、プラットフォームアセンブリ（セクション2.2.1-2.2.3）、および実験操作を監視する（セクション2.2.4-2.2.7：特別な注意を必要とするプロトコル内の3つの重要なステップがあります。 ）。カビ（セクション1.1）の設計と生産の面では、眼球の作品は、人間の角膜の寸法に応じて設計されるべきです。眼球片が完全に商業コンタクトレンズ（CL）に収まるように作成?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)	Adafruit	50	Board
Stepper motor	Adafruit	324	Motor and Motor shield
Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16"	VWR	CA11009-280	50 pcs of tube connector
Tubing PT/SIL 1/16"x1/8"	VWR	16211-316	Case of 50feet
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation
Agarose, Type 1-A, low EEO	Sigma-Aldrich	A0169-25G
PHD UltraTM	Harvard Apparatus	703006	MicroFluidic Pump
Bovine cornea	Cargill, Guelph/ON
Soldidworks	Dassault Systemes		Software
3-D printing	University of Waterloo - 3D Print Centre
Dissection tools	Fine Science Tools		General dissection tools
Medium 199	Sigma-Aldrich		Culture medium storage for cornea
Fetal bovine serum	Thermo Fisher		Add to culture medium, 3% total volume