急性心筋梗塞の豚モデルにおける主要アウトカム評価

要約

信頼できる正確なアウトカム評価は、臨床治療への臨床前治療の翻訳のための鍵です。現在の用紙は、ブタ急性心筋梗塞モデルにおける心機能および損傷の3つの臨床的に関連する主要な結果パラメータを評価する方法を説明します。

要約

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

概要

西部の世界¹の人々の2％ -の減少駆出率（HFrEF）と心不全は、推定1に影響を与え、すべての心不全症例の約50％を占めます。その最も一般的な原因は、急性心筋梗塞（AMI）です。 AMI後の急性死亡率が増加による認識と改善された治療選択肢に大幅に減少しているように、重点はその慢性後遺症の方にシフトしています。最も顕著なのはHFrEF ^2,3です。一緒に医療費^4の増加^に伴って、心不全の成長流行は、以前^5に記載^{されている}よう^に 、AMI後の有害なリモデリングの高度に並進ブタモデルで試験することができる新規な診断および治療の必要性を強調しています。

どちらも、決定（ 例えば、梗塞サイズ）と有害なリモデリングの機能評価（ 例えば 、心エコー検査）は、多くの場合、RELの必要性を示す、新たな治療法の有効性試験のために使用されていますiableと比較的安価な方法。現在の論文の目的は、急性心筋梗塞のブタモデルにおける有効性試験のための重要かつ信頼性の高いアウトカム指標を導入することにより、このニーズに対処することです。これらは、リスク（AAR）の領域に関連した梗塞サイズ（IS）、3D経食道心エコー検査（3D-TEE）と詳細なアドミッタンスベースの圧力 - 容積（PV）ループ取得を含みます。

梗塞サイズは、AMI ⁶の後に不利なリモデリングおよび生存の主要な決定因子です。虚血性心筋のタイムリーな再灌流が可逆的に負傷した心筋細胞を回収し、梗塞サイズが制限される場合がありますが、再灌流自体は、酸化ストレスと不均衡な炎症反応（虚血再灌流障害^{（IRI））7}の世代を通じて追加の損傷を引き起こします。したがって、IRIは、有望な治療標的として同定されています。梗塞サイズを減少させる新規治療薬の能力は関連して梗塞サイズを評価することによって定量化されますリスク領域（AAR）へ。より大きなAARが大きく、絶対梗塞サイズにつながるとしてAARの定量化は、動物モデルの冠状動脈の解剖学における個体間変動を補正することが必須です。梗塞サイズは、心臓の性能や心筋の収縮に直接関係しているので、AARの変動にかかわらず治療法⁸の研究のアウトカム指標に影響を与えることができます。

三次元経食道心エコー検査（3D-TEE）は、心機能を非侵襲的に測定するための臨床応用可能な、最も重要なのは、安全で信頼性が高く、安価な方法です。経胸壁心エコー図（TTE）画像は、ブタ⁹ 2D胸骨傍の長短軸のビューに制限され、一方、3D-TEEは、左心室の完全な3次元画像を得るために使用することができます。したがって、そのような変更されたシンプソンのルール¹⁰と左心室（LV）ボリュームの数学的な近似を必要としません。後者は、CORRを下回りますectlyによる円筒形状¹¹の不足のためにLVリモデリング後のLV容積を推定します。それが本モデル¹²における心臓保護効果を発揮することが観察されている外科的介入を必要としないようにまた、3D-TEEは、心外膜の心エコー検査上好ましいです。心筋機能の評価のための2D-TEEの使用が^13,14の前に記載されているが、心室の幾何学的形状に関する制限は、2D-TTEで観察されたものと類似しており、LVリモデリングの程度に依存します。したがって、より大きな梗塞（したがって、心不全の可能性が高い）、より多くの可能性が高い2次元測定が不正確な幾何学的な仮定による不良になっおよび3D技術に対する高い必要性。

それにもかかわらず、ほとんどのイメージングモダリティは、心筋の固有の機能的特性を評価する能力が制限されています。 PVループは、関連する追加情報を提供し、その取得はことです以下に詳細に説明。

プロトコル

全ての動物実験は、大学医療センターユトレヒト（オランダ、ユトレヒト）の動物実験に関する倫理委員会によって承認され、「実験動物の管理と使用に関する指針」に準拠しました。

注：クローズド胸のバルーン閉塞を実行するためのプロトコルは、現在の原稿の一部ではなく、他で詳細⁵に記載されています。要するに、豚（60〜70キロ）が左前下行枝（LAD）の中央部の75分腔的バルーン閉塞に供されます。

両方の三次元経食道心エコー検査（3D-TEE）および圧力 - 体積（PV）ループの測定は、ベースライン、短期および長期のフォローアップで行うことができます。これらの測定値は、この段階での頻繁な不整脈に起因する心筋梗塞後の最初の数時間に信頼性がないとみなされることに注意してください。梗塞サイズ（IS）とエリア・アット・リスク（AAR）の測定はpreferablあります微小血管系および二次心筋瘢痕間伐の変化が少なく信頼性の高い結果に終わるので、 - （72〜24時間^）15,16 yは短期的なフォローアップで評価しました。梗塞サイズの染色は非常に再現性が比較的安価と考えられている2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）（注意、刺激）を用いて行われます。 TTCは無色生理食塩水に溶解する白色の粉末です。様々なデヒドロゲナーゼと接触すると、それは赤レンガ色に変換されます。これにより、実行可能な（赤）と死んだ心筋組織（白）とを区別する。両方の侵襲性および非侵襲性の梗塞サイズの決意の概要については、読者はこの主題¹⁷の包括的な見直しに向けられています。

図1は、麻酔、外科的な準備と本研究で用いた主要な結果の測定を含むタイムラインを示しています。

1.薬や麻酔

1. 動物が食べていないことを確認しますか手順の前に少なくとも5時間飲みます。前治療、麻酔および術後疼痛の治療プロトコルは、他の場所で詳細⁵に記載されています。
2. 要するに、日手術前buprenorfineパッチ（5μgの/時）7日間術後疼痛を制限するためにアクティブになっている皮膚に適用されます。 0.4ミリグラム/キログラムミダゾラム、10mg / kgのケタミンおよび0.014ミリグラム/キログラムアトロピンの筋肉内注射による手術の日に、落ち着いた豚。 15分 - 約10のを待ちます。耳静脈のいずれかで18 Gカニューレを挿入し、麻酔を誘導するためには5mg / kgのチオペンタールナトリウムを投与します。
3. 気管内チューブ（ - 70キロ60の豚用サイズ8.5）を使用して豚を挿管。必要に応じて、バルーン換気（周波数12 /分）を行い、手術室に豚を運びます。
4. 手術室で到着すると、のFiO ₂ 0.50、10ミリリットル/ kgの一回換気量と連続を使用して、12 /分の頻度で機械的陽圧換気を開始カプノグラフィー記録。
5. ミダゾラムの組み合わせ（0.5ミリグラム/ kg /時間）、スフェンタニル（2.5μgの/ kg /時間）およびパンクロニウム（0.1ミリグラム/ kg /時間）の連続静脈内注入によってバランス麻酔を開始します。
6. 角膜反射をテストし、呼吸パターンを監視することにより、麻酔を確認し（ 例えば 、人工呼吸器との組み合わせで自発呼吸が不完全な麻酔を示しています）。動物が麻酔下にある間に乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。

2. 3D経食道心エコー（TEE）

1. 心拍数の監視とデータ収集を可能にするために、5に動物を接続すると、心エコー検査機にECGをリードしています。
2. 右側臥位で動物を置きます。プローブは、操作片のロックを解除することにより、先端をまっすぐかつ柔軟であることを確認してください。
3. 豚の口を開き、慎重に食道エコープローブを挿入します。必要に応じて、visua用喉頭鏡を使用しますlization。ツェンカー憩室^18に似^ている、正常な解剖学的咽頭嚢で終わるしないように注意してください。
4. （鼻の先端から測定）60センチメートル - 50のためのプローブを挿入します。ゆっくりとプローブを回転させ、心臓（ 図2A - B）を可視化するための左の前外側の位置に頭を曲げます。すべての壁がはっきりと見えることを確認してください。
5. そして、「FVオプトボリューム」を選択することによって取得されているセクターの幅を最大化D - 。図2Cに示すように、左心室の2垂直画像を表示するために心エコー検査機のディスプレイに「3Dフルボリューム 」オプションを使用します。フルボリュームの測定値を得るために、一時的に機械換気を押し、「獲得」をオフにすることで換気を一時停止します。
6. エコー買収後、先端が操作片のロックを解除することにより、柔軟であることを確認してください。そして、ゆっくりと動物からプローブを削除します。
   注：番目のままにしないでくださいそれは十分な意識を取り戻した電子動物無人まで胸骨横臥位を維持します。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
7. 以前¹⁹記載されているように、検証ソフトウェアを使用してオフラインで分析を実行します。

3.入場ベースの圧力 - 体積ループ獲得

1. 実験²⁰の間に適切な水分補給と最小限の基準圧力ドリフトを保証するために、20分の最低0.9％生理食塩水（37℃〜室温）で7 F四極性アドミタンスカテーテルのセンシングチップを事前に浸します。
2. セクション1で説明したように薬や麻酔を管理します。
3. 外科手術の準備を行い、先に⁵説明したように血管アクセスを得ます。
   1. 要するに、剃ると首をきれいに。ヨウ素の2％で手術領域を消毒し、滅菌外科用ドレープと豚の非滅菌部分をカバーしています。
   2. 作ります首の内側切開は、頸動脈と内頸静脈を露出させます。頸静脈に頸動脈と9 Fシースに8 Fシースを挿入します。
4. 頸静脈9のFシースを通してスワンガンツ（SG）カテーテルを挿入し、カテーテルの先端部にバルーンを膨張させることにより、小さな肺動脈の中にウェッジ。肺の周辺部での十分な配置した後、バルーンを収縮させます。外部心臓出力デバイスにSGを接続します。
5. 最も近位の狭い所から広い所に出ることで内腔に接続する注入口に0.9％滅菌生理食塩水を含む20 mlシリンジを取り付けます。 5ミリリットル0.9％生理食塩水（室温）の急速注入により心拍出量を測定し、一回拍出量（SV）を計算するために心拍数を得ます。この手順を3回繰り返し、平均SVを計算します。
   注：心拍出量は（自動的に）スチュアート - ハミルトン熱希釈式を用いて計算され、温度の変化に基づいています室温の生理食塩水²¹の注入時の肺動脈。
6. SGカテーテルを取り外します。下大静脈内頸静脈および位置にそれを9 Fのシースを通して8 Fフォガティカテーテルを挿入します。
7. 先端が0.9％生理食塩水のまま、「 コース 」と「 ファイン 」ボタンを使用して、PVループカテーテルの圧力信号を調整します。そして、入力システムに測定SV。
8. X線透視下で左心室（LV）で頸動脈と中央に8 Fのシースを通って先端をPVループカテーテルを進めます。
9. 圧力信号に対する生のコンダクタンス信号をプロットすることにより、最大適切に配置され、セグメントを選択します。圧力コンダクタンスループは長方形の形状であることを確認してください。位相信号は、3と5度の間の値を持つ洞トレースを示すことが期待されます。換気を一時停止し、ボリュームへのコンダクタンスを変換するためのベースラインスキャンを実行します。
   1. ベースラインデータを受け入れることにより、信号が（なし不整脈）安定しているとき、「 続行 」を押すと、心拍数が十分にシステム²⁰によって検出されるECGまたは圧力導出心拍数と収縮末期（ES）/拡張末期（ED）コンダクタンスに等しいです。
      注：後者は、圧力信号に対する生コンダクタンス信号をプロットし、リアルタイムのコンダクタンスにスキャン基準由来のES / EDコンダクタンス値を比較することによって確認することができます。上記の要件のいずれかが満たされない場合は、手順を繰り返します。
10. 換気を一時停止することにより無呼吸の間に12個の連続拍 - 10を記録することにより、ベースライン圧 - 容積ループを取得します。
11. 上記のように12個の連続拍 - プリロードを削減し、10を記録するために透視下でフォガティカテーテルを膨らませます。測定を妨害60mmHgで、ノー不整​​脈>収縮期血圧が残っていることを確認します。
12. フォガティとPVループカテーテルを取り外します。動脈pressurを記録してください前とPVループカテーテルの除去中の電子は、圧力ドリフト（ すなわち、ex vivoで前および術後のベースラインの圧力差）を補正できるようにします。
    注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
13. 幾何学的な測定と検証ソフトウェア²²との機能パラメータのオフライン解析を実行します。

4.リスク領域（AAR）および梗塞サイズ（IS）の定量

1. 50ミリリットル0.9％生理食塩水で1.00グラムエバンスブルー（注意^23、毒性）を溶解、それぞれ20ミリリットルと2％エバンスブルー溶液30mlで2 50ミリリットルルアーロックシリンジを充填し、室温で保管してください。
   注：ヒュームフード中の作業と接触frのを防止するために、有害な粉塵や使用手袋と保護メガネへの露出を制限するために、防塵マスクを着用オム皮膚や目。
2. 同様の予防措置を取って、37℃、0.9％生理食塩水で1％の2,3,5-トリフェニルtetrazoliumchloride（TTC）（注意、刺激性）を溶解し、37℃で維持します。
3. 外科的に両方の頸動脈に血管アクセスを得るために動物を準備します。 in vivoでのエバンスブルー点滴⁵の効果の直接的な可視化を可能にするために胸骨切開を行います。
4. 7 Fとそれぞれの頸動脈内8 Fの導入シースを挿入します。また、一つの頸動脈の両方で導入器シースを挿入するか、または両方の案内カテーテルの1のために大腿動脈のいずれかを使用します。
5. それぞれカテーテルをガイド7 F JL4と8 F JL4に2標準のYコネクターを接続します。大腿アプローチのために、左冠動脈主幹部（LCMA）、右冠動脈（RCA）のためのJR4とJL4を使用しています。両方のY-コネクタに10cmの拡張子を持つ追加の三方活栓を接続します。
6. 100 IU / kgのヘパリンを管理します。 CA位置案内8 F JL42イントロデューサシースのうちの1つを介してLMCAの口でtheter。
7. 0.014 "ガイドワイヤを使用して、LCMAカテーテルを通して冠動脈拡張カテーテルを進め、冠動脈閉塞がMIの誘導の間に実施されたサイトでバルーンを配置。まだ膨らませないでください。
8. 第二の導入シースを介して、RCAの口で第8 F JL4ガイディングカテーテルを配置します。
9. 前後とLAO 30°ビューを使用して、冠状動脈の両方のガイディングカテーテルおよびバルーンの正確な位置決めを確認するために、X線透視下で造影剤を注入することにより冠動脈造影（CAG）を実行します。
10. 30ミリリットル（LCMA）とガイディングカテーテル上をYコネクタに接続され、それぞれの三方タップに20ミリリットル（RCA）2％エバンスブルーを含む2 50ミリリットルの注射器を取り付けます。
11. バルーンを膨らませると、CAGにより、冠状動脈の閉塞を確認します。場合にのみ、バルーンが完全に遮断し、任意の造影剤の通過を、エバンスブルーDを注入両方のガイドカテーテル（5ミリリットル/秒）を介してがたバルーンが膨張されます。
12. 直接エバンスブルーの注入が完了した後、心臓の非梗塞部分に9 Vバッテリーを配置することによって、心室細動を誘発します。
13. 圧力を解放し、吸引装置は、血液の排出を可能にするために利用可能であることを確認するために大静脈血管を切開。
14. 、バルーンを収縮させる両方のガイドカテーテルと一緒にそれを撤回し、周囲の膜を解剖することによって心臓を外植。大血管（ すなわち 、大動脈、肺動脈/静脈）を切って横には、完全な植を可能にします。急速に外面上に0.9％の生理食塩水を使用して、心臓の空洞内に血液や余分な染料を洗い流してください。
15. 慎重に左心室を分析し、房室（AV）の溝に平行な面で、ベースとなる頂点から5同じ10ミリメートルの厚さの切片にカットを行います。
16. 、周囲光条件下で別々にすべての5つのスライスの両面を撮影可能なエバンスブルーウォッシュアウトは、その後の工程で発生する可能性があります。キャリブレーションのために、ルーラーは、画像内に存在することを確認してください。
17. 同等の染色のために5分後に周りのセクションを回し、37℃で1％TTC溶液中で10分間インキュベートします。
18. この場合も、別途周囲光条件の下ですべての5つのスライスの両側を撮影し、定規は、キャリブレーション用の画像で可視化されていることを確認します。
19. すべてのスライスを秤量します。分析⁵に適したソフトウェアを使用してください。 ImageJの（バージョン1.47）を使用する場合、「直線」ボタンをクリックします。さて、画像（ 例えば 、5センチ）に定規を使用して既知の距離と直線を引きます。 >「スケールの設定」とボックスに距離を入力し、「既知の距離」 - 「分析」をクリックしてください。この手順では、長さのSI単位への距離（ピクセル単位）のキャリブレーションを可能にします。
20. 「多角形選択」ボタンを使用して、現在のIMでのLV心筋に相当する総面積を選択測定値を取得する> "メジャー" - 年齢、「分析」をクリックします。心筋の各スライスの両側に、この手順を実行して、スライス当たりの平均。
    1. すべての5つのスライスの総重量に比例したスライスの重量を掛け、全てのスライスについてこれらの測定値を平均します。
21. （AAR）および梗塞サイズ（IS）リスク領域について同様の測定を行います。除算は/ AAR、AAR / LVおよびIS / LV ISおよびそれぞれのアウトカム測定値^5を得るために^、100％を掛けます。

結果

3D経食道心エコー

3D経食道心エコー検査（3D-TEE）は、グローバルな心臓機能の評価のために使用することができます。 AMI後、世界的な心機能は、健康的なベースライン値とは異なります。具体的には、左室駆出率（LVEF）は、再灌流の1週間（N = 10）（GPJバンハウト、2015年）後37±6％への59±4％から減少し?...

ディスカッション

心臓リモデリングは、主に心筋梗塞サイズおよび心筋梗塞修復^6,26の品質に依存します。標準化された方法で、前者を評価するために、本原稿が検証され、広範囲に^{8,16,27,28を}使用されてきたex vivoでの TTC染色と組み合わせたエバンスブルーのin vivo注入のエレガントな方法を提供します。この方法は、AAR ¹⁶に関連するリスク（AAR）の領域の定量および梗塞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-dimensional Transesophageal Echocardiography
iE33 ultrasound device	Philips	-
X7-2t transducer	Philips	-
Aquasonic® 100 ultrasound transmission gel	Parker Laboratories Inc.	01-34	Alternative product can be used
Battery handle type C (laryngoscope handle)	Riester	12303
Ri-Standard Miller blade MIL 4 (laryngoscope blade)	Riester	12225
Qlab 10.0 (3DQ Advanced) analysis software	Philips	-
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure-volume loop acquisition
Cardiac defibrillator	Philips
0.9% Saline	Braun
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
9 F Radifocus® Introducer II Standard Kit	Terumo	RS*A90K10SQ	Alternative product can be used
8 F Fogarty catheter	Edward Life Sciences	62080814F	Alternative product can be used
7 F Criticath™ SP5107H TD catheter (Swan-Ganz)	Becton Dickinson (BD)	680078	Alternative product can be used
Ultraview SL Patient Monitor and Invasive Command Module (external cardiac output device)	Spacelabs Healthcare	91387	Alternative product can be used
ADVantage system™	Transonic SciSense	-
7 F Tetra-polar admittance catheter (7.0 VSL Pigtail / no lumen)	Transonic SciSense	-
Multi-channel acquisition system (Iworx 404)	Iworx	-
Labscribe V2.0 analysis software	Iworx	-	Alternative product can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Infarct size / area-at-risk quantification
Diathermy	-		Alternative product can be used
Lebsch knife	-		Alternative product can be used
Hammer	-		Alternative product can be used
Bone marrow wax	Syneture		Alternative product can be used
Klinkenberg scissors	-		Alternative product can be used
Retractor	-		Alternative product can be used
Surgical scissors	-
7 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08703	Alternative product can be used
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
7 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34357-662	Alternative product can be used
8 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34358-662	Alternative product can be used
COPILOT Bleedback Control Valves	Abbott Vascular	1003331	Alternative product can be used
BD Connecta™	Franklin Lakes	394995	Alternative product can be used
Contrast agent	Telebrix
Persuader 9 Steerable Guidewire 9 (0.014", 180 cm, straight tip), hydrophilic coating	Medtronic Inc.	9PSDR180HS	Alternative product can be used
SAPPHIRE™ Coronary Dilatation Catheter (PTCA balloon suitable for the size of the particular coronary artery (2.75 - 3.25 mm))	OrbusNeich	103-3015	Alternative product can be used
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-100G	Toxic. Alternative product can be used
2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	T8877-100G	Irritant. Alternative product can be used
9 V Battery	-	-
Ruler	-	-
Photocamera	Sony	-
ImageJ	National Institutes of Health	-	Alternative product can be used