腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

要約

このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。

要約

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

概要

プライマリ乳腺腫瘍からの腫瘍細胞の播種は、マクロファージおよび内皮細胞を含む間質細胞だけでなく、腫瘍細胞を含むが、ホストすることが示されています。さらに、腫瘍血管系は、透過性の増大¹で異常です。したがって、腫瘍細胞、マクロファージ及び内皮細胞が原発腫瘍微小環境における血管透過性と腫瘍細胞の血管内を媒介することがどのように相互作用するかを決定することは理解転移のために重要です。血管透過性の動態を理解すること、腫瘍微小環境における腫瘍細胞の血管内および多細胞相互作用の根底にあるシグナル伝達機構は、抗癌治療の開発および管理に重要な情報を提供することができます。

インビボでの腫瘍血管透過性を研究するための主要な手段は、エバンスブルー^2、高分子量デキストラン（155 kDaの）などの血管外色素の測定されています色素の注入後の一定の時点での³およびフルオロフォアまたは（アルブミンを含む）放射性トレーサー共役タンパク質^4。顕微鏡の進歩は、動物モデルおよび蛍光色素は生体顕微鏡⁵を介して細胞プロセスと生きた動物における血管透過性の可視化を有効にしています。

いくつかの時点にわたる静止画像の取得、または短い時間経過配列とライブ動物イメージングは、腫瘍微小環境^6,7の動的なイベントを完全に理解することができません。確かに、24時間にわたって静止画像の取得は、腫瘍血管が漏出性である、しかし、血管透過性のダイナミクスは^6を観察されなかったことを実証しました。このように、12時間まで延長し、連続タイムラプスイメージングは​​、腫瘍の微小環境における動的なイベントの動態をキャプチャします。

このプロトコルは、拡張タイムラプスmultiphotの使用が記載されています生体顕微鏡で腫瘍微小環境における動的な多細胞事象を研究します。腫瘍微小環境中の複数の細胞型は、注射可能な色素または蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物を用いて標識されます。血管色素またはタンパク質は、撮影開始後に注入することができる尾静脈カテーテルを使用して、腫瘍微小環境における多イベントの運動データを取得します。ライブセルイメージングのために乳腺腫瘍は、皮膚弁の外科的準備を介して公開されます。画像は複数の光電子増倍管（PMT）検出器⁸を備えた多光子顕微鏡を用いて12時間まで取得します。適切なフィルタを使用することにより、減算アルゴリズムは、腫瘍の微小環境を同時に⁹の5の蛍光信号を取得するために4 PMT検出器を可能にします。高解像度の多光子生体顕微鏡検査は、より良好につながる、腫瘍微小環境において腫瘍 - 間質相互作用の単細胞解像度画像を捕捉するU血管透過性および腫瘍細胞の血管内^10-13のnderstanding。具体的には、拡張された生体内イメージングは^13（転移、TMEM ¹⁴の腫瘍微小環境として定義される）、腫瘍細胞、マクロファージおよび内皮細胞間の相互作用の部位で選択的に発生する高度に局在化、過渡血管透過性のイベントを明らかにしました。さらに、腫瘍細胞の血管内のみTMEMで発生し、空間的及び時間的に血管透過性¹³と相関しています。これらのイベントのダイナミクスの単一細胞の解像度は、腫瘍微小環境内の蛍光標識された細胞の拡張タイムラプス多光子顕微鏡を使用することによって可能になりました。

プロトコル

記載されているすべての手順は、医療制度動物実験委員会のアルバート・アインシュタイン大学の事前承認を含む、脊椎動物の使用のためのガイドラインと規則に従って行われなければなりません。

1.生成蛍光標識腫瘍および腫瘍関連マクロファージ

1. マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復は、蛍光レポーターでトランスジェニックマウスを用いてポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMT）を駆動する自発的な、土着、遺伝子操作されたマウス乳腺癌モデル[ すなわち、強化緑色蛍光を交配することによって蛍光標識された腫瘍細胞を生成しますタンパク質（EGFP）、強化シアン蛍光タンパク質（ECFP）またはDendra2] ^8,9。
2. 骨髄性細胞とマクロファージ特異的蛍光の記者と遺伝子操作されたマウスモデルを交配することにより、蛍光標識された腫瘍細胞とPyMT動物における蛍光ラベルマクロファージ[ すなわち、MacGrEEN ¹⁵またはMacBlueマウスCSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16]。
3. あるいは、蛍光標識されたPyMT腫瘍細胞（同系）、ヒト乳癌細胞株または初代ヒト患者由来の腫瘍（異種移植片^）11,17の同所移植を介して蛍光標識された腫瘍を発生させます。
   1. インプラント蛍光蛍光標識された腫瘍細胞および骨髄細胞¹³を有する動物を生成するために、蛍光タンパク質で標識した骨髄細胞を同系マウスにPyMT腫瘍細胞を標識しました。
4. 開始2時間前に蛍光ラベルのマクロファージへのヒト細胞株または患者由来の原発性腫瘍の異種移植腫瘍と重症複合免疫不全（SCID）マウスに10 mgの静脈内（iv）の尾静脈による/ kgの蛍光70 kDaのデキストランの100μLを注入します生体内イメージングの。

2.顕微鏡のセットアップおよびイメージングの準備

注：この手順では、セットアップについて説明します多光子顕微鏡⁸での生体内イメージングのため。

1. 二光子レーザーおよび検出器を含むすべての顕微鏡とレーザーのコンポーネントをオンにします。
2. ステージを事前に温めるために30℃に加熱ボックスをオンにします。このステップでは、動物の生理的な温度を維持するために重要です。
3. 倒立顕微鏡で使用するための顕微鏡ステージ上のカスタムメイドステージインサートを配置します。カスタムインサートは、イメージングのための中央に貫通孔直径「ステージ挿入空間にと1と合うように機械加工厚のアルミニウム「1/8のシートです。
   1. 70％エタノールと空気乾燥して顕微鏡ステージとステージインサートを拭いてください。
   2. カバーガラスと光学的に接触を維持するために、20X、1.05 NA顕微鏡対物レンズ上の水の大きな低下を置きます。
   3. 顕微鏡ステージインサート上のイメージングポートを介してカバーガラス（＃1.5厚さ）を配置します。ラボテープで所定の位置に固定します。
   4. 2センチメートル×2センチの穴をパンチ穴パンチを使用します柔軟性のあるゴム製のパッドとカスタムステージインサートの穴に合うパッドの穴と顕微鏡ステージ上のラバーパッドを配置します。

イメージング中に注射用尾静脈カテーテルおよび試薬の調製

1. ポリエチレン（PE）管の長さ30cmをカット。
2. それはプラスチック製フィッティングのオフに破断するまで鉗子を使用して、前後に31 G針の金属針を動かします。
3. 鉗子を使用して、PEチューブ内に切り離され、針の平滑端を挿入します。
4. PEチューブのもう一方の端に31 G針を挿入します。
5. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1ccの注射器を記入し、31 G針に挿入し、PBSでチューブと針のうち、すべての空気をフラッシュします。 PBSは、水和および血液浸透圧^9,18を維持するために使用され、ただし、等張食塩水を使用してもよいです。
6. 3ミリグラム/ 155 kDaのデキストランテトラメチルkgの（TMR200μlで1ccの注射器を埋めます）または血管標識のための量子ドット。
7. このような氷の上1ccの注射器と場所における血管内皮増殖因子A（VEGFA _165）の165アミノ酸アイソフォームなどの任意の他の注射のタンパク質を準備します。 0.05 mg / mlでの濃度を0.2mg / kgのVEGFA ₁₆₅ ^19を注入^します 。

留置尾静脈カテーテルの挿入4

1. キャリアガスとしてO _2、5％イソフルランで誘導チャンバーを用いて麻酔下で動物を置きます。
2. それは完全に麻酔され、つま先のピンチに応答しない一度手術用プラットフォームにマウスを転送します。
3. オープンイソフルラン麻酔ライン手術用プラットフォームに、誘導室に麻酔ラインを閉鎖し、動物の鼻の上にノーズコーンを配置します。 2.5％に5％からイソフルランを減らします。
4. 麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの眼に眼軟膏を適用します。
5. 加熱ランプの下で動物を加熱循環が深い麻酔で遅くなるように尾部に循環を高めるために、さらに2分間。
6. 70％エタノールでマウス尾静脈を滅菌。
7. 動物の外側尾静脈に3章で構成されたカテーテルから31 G針の先端を挿入し2-3 mm単位で針を押し込みます。
8. 尾静脈内に配置されたカテーテルを確保し、血を見るために、注射器を後方に引いて。
9. 尾の長さに沿って静脈に代わり平行に針を保持するために、針の上に配置され、ラボのテープの長さ1cmを使用してください。

5.皮弁外科的手順は、乳腺腫瘍を公開します

1. 外科的なプ​​ラットフォーム上の動物で、腫瘍および70％エタノールで腹面を綿棒。注：記載されているように、この手順は、完全に無菌的に行われません。感染が交絡因子になることができます長いイメージングセッションでは、適切な無菌技術を使用することをお勧めします。
2. steriを使用しましたル鉗子、腹側皮膚や滅菌ハサミで持ち上げは、長さが腹側正中約1cmに沿って皮下切開を行います。切開中に腹膜を穿刺しないでください。
3. 静かに乳腺腫瘍を露出するように離れて腹膜から乳腺腫瘍を取り付ける結合組織を切断します。
4. 腫瘍脈管構造の完全性を維持し、出血を最小限に抑えながら、はさみ及び鉗子を使用して、穏やかに腫瘍の露出面から筋膜および脂肪を除去して切り取ります。このステップでは、腫瘍の腫瘍構造と血管系の供給を維持する上で重要です。

顕微鏡6.動物の準備

1. イメージングのための顕微鏡の対物レンズを介してステージインサート上にカバースリップ上に配置された露出した腫瘍で予熱した撮影台に動物を転送します。針を除去しないように動物で穏やかに尾静脈カテーテルを転送するように注意してください。
2. 目を配置します3％のイソフルランに麻酔セットを維持するために、動物の鼻の上に電子麻酔ノーズコーン。
3. 腫瘍はゴムパッドの穴に置かれ、カバーガラスと接触するように動物を配置します。
4. 穏やかな場所に腫瘍を保持し、画像収集中に移動を低減するために、ラボテープで顕微鏡ステージにそれらを修正するために、2つのゴム製のパッドを使用してください。
5. 水和組織を維持し、カバーガラスと光学的接触を維持するためにPBSでゴム製パッドから室を埋めます。
6. パルスオキシメータプローブを用いて動物のバイタルサインの監視を開始します。動物の大腿部にクリップセンサーを取り付けます。あるいは首にフィットするように構成されたカラーを使用することができます。
7. 30°C ^20を維持するために、動物を介して加熱ボックスを配置します。
8. ゆっくり麻酔を維持し、血流を維持するために、0.5-1％のイソフルランのレベルを低下させます。

7.画像取得とFluorescの注射ENT染料および注射用タンパク質

1. 腫瘍の表面上の蛍光腫瘍細胞の顕微鏡接眼レンズの焦点を使用。
2. 血管を流れるとの領域を見つけることによって、関心領域を選択します。血管を流れると関心領域の選択は、腫瘍の脈管構造を評価するために重要です。
3. 関心領域は、選択された後、多撮影モードに顕微鏡を切り替えます。
4. Zシリーズの上限と下限を設定します。希望の開始位置に対物レンズを移動するフォーカス調整を使用し、Z位置「トップ」ボタンをクリックしてのzシリーズの上限を設定します。第二高調波発生（SHG）チャネルにおける腫瘍の表面でコラーゲン線維ネットワークを可視化しない細胞だけコラーゲン線維が表示されていないときに観察することにより、Zシリーズの上限を決定します。
   1. （typica所望のイメージング深さに対物レンズを移動させることにより、Zシリーズの下限値をLLY 50から150ミクロン）とZ位置「下」ボタンをクリックします。
   2. ステップサイズフィールドに目的の値を入力して、ステップサイズを設定します。解像度と取得時間のための考慮事項に基づいて、ステップサイズを決定します（通常は2ミクロンはそうでない場合は、高解像度の3D再構成し、5μmのために使用されます）。
5. タイムラプスパネルに切り替えて、タイムラプスフィールドに希望の経過時間を入力することにより、タイムラプス間隔を設定します。最適な時間分解能のために連続撮影のために0秒に時間間隔を設定します。注：長いタイムラプスイメージングのためには、客観的な浸漬液を補充する買収の間に10秒の時間間隔を設定することをお勧めします。
6. イメージングのためのパラメータが決定されると、ゆっくりと155 kDaのデキストランTMRを注入します。
   1. 尾静脈カテーテルをPBSで注射器を取り外し、李に気泡を導入しないように注意しながら155 kDaのデキストラン-TMRを含む注射器と交換ね。
   2. ゆっくりと200μlの最大容量で、マウスに155 kDaのデキストラン-TMRを注入し、PBSを含む注射器で注射器を交換してください。重要なステップ：ゆっくり注入を行い、静脈の外のソリューションを避けるための予防措置をとってください。
7. それらを押下するZ-スタックとタイムラプスボタンをクリックし、録音ボタンをクリックして、Zスタックタイムラプスイメージングの取得を開始します。
8. 他の蛍光デキストラン、 すなわち 、10kDaのデキストラン-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、またはタンパク質、 すなわち 、VEGFA _165は 、予め用意されている場合、0 =で分開始のための画像取得を開始した後にそれらを注入します。
   1. 尾静脈カテーテルをPBSで注射器を外し、ラインに気泡を導入しないように注意しながら10 kDaのデキストランFITCまたはVEGFA _165を含むシリンジと交換してください。
   2. ゆっくり尾静脈カテーテルを介してマウスに注射剤を注入しますおよびPBSを含む注射器と注射器を交換してください。
9. すべての30-45分は、ゆっくりと動物の水和を維持するために、PBSまたは生理食塩水を50μlを注入します。

8.安楽死

1. 画像取得の終了時に、動物を安楽死させます。
   1. 5パーセントにイソフルランを増やします。
   2. それは呼吸と段階から動物を除去するために停止した後、30秒まで5％イソフルランの下で動物を保​​管してください。
   3. 完全な安楽死を確実にするために頸椎脱臼を実行します。

9.画像処理

1. 各時点での各チャンネルのために16ビットのTIFFファイルでの画像を取得し、順次保存します。
2. ImageJの⁹で確立された方法を用いて、スペクトルの重複（ すなわち、GFPおよびCFP）、XYドリフトの除去とタイムラプス配列からの映画の世代の分離を行います。高解像度画像¹³の3次元表面再構成を実行します。

結果

拡張タイムラプス生体顕微鏡は、腫瘍の微小環境における多細胞プロセスの単一細胞分解能イメージングを可能にします。蛍光標識腫瘍細胞、マクロファージ、血管領域、及び第二高調波発生信号を使用してコラーゲン繊維ネットワークを可視化することにより、腫瘍微小環境内の複数の区画を同時に撮像中に追跡されます。 Dendra2（ 図1A）で標識された...

ディスカッション

腫瘍微小環境で自然に発生する細胞間相互作用は、腫瘍細胞の運動性と血管内に変化をもたらすことができます。生きた腫瘍組織の高解像度の生体内イメージングは、非常に過渡^10,13,24であることができる多細胞ダイナミクスの可視化を可能にします。離散時間点で取得ビボアッセイまたはタイムラプス画像内のエンドポイントは、腫瘍微小環境内のプロセスの分子メカ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch