EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

要約

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

要約

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

概要

胸腺は、獲得免疫系の機能に必須である病原体反応、自己寛容T細胞の多様な集団の生成を担う主要なリンパ器官です。それは、胸腺細胞の開発、リンパ球前駆細胞として骨髄から移住動的な器官である、胸腺間質のスポンジ状の三次元（3-D）マトリックスを通って移動し、系統仕様と分化を起こし、最終的にのように移住します成熟T細胞。このよくプログラムされたプロセスの成功は、移行胸腺細胞や住宅胸腺上皮細胞（TECを）、胸腺微小環境の整合性を確立し、維持するために必須である胸腺間質の優勢な集団間のクロストークに大きく依存します。

その解剖学的位置とユニークな機能に基づいて、TECのは、2つのサブセットに分けることができます。皮質でのTEC responある（cTECs）^1,2- T細胞（正の選択）を制限し、自己MHC（主要組織適合遺伝子複合体）を選択するためのsible、および自己反応性T細胞を除去するために不可欠である髄質（mTECs）中のTEC（負の選択）。多くの要因（ 例えば 、老化、感染症、放射線照射、薬物治療）は妥協適応免疫が得られ、胸腺上皮に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。多くの試みにもかかわらず、胸腺機能を回復することは、胸腺微小環境を再現する難しさに挑戦してきました。 2次元環境で培養のTECが急激胸腺形成^3,4のための重要な遺伝子の発現を減少させる一方、特に、胸腺三次元（3-D）の構成は、のTECの生存および機能に重要です。

EAK16-II（AEAEKAKAEAEAKAK）およびそのC末端histidinylatedアナログEAKIIH6（AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH）は低分子量であり、脱イオンWATEに可溶性である両親媒性オリゴペプチドRが、20mMのNaClを（ヒト体液中の正常な塩濃度は、154 mMで）より高いイオン強度に曝されたとき、β原線維を形成するためにゲル化を受けます。この環境応答性は、3D構造を形成するように多目的なビルディングブロックを作ります。複合タンパク質薬物および他の生体分子を固定するためのアダプタとして機能することができる（：EAKII-H6上のHisタグは、ドッキング機構を、これにより抗HisのIgG / Fc結合組換えタンパク質A / G（PA / GはαH6）提供します例えばヒドロゲル複合^5-8に、抗体）。

我々は以前に、ヒドロゲルに固定蛍光標識されたIgG分子は、最大13日間⁹のための注入部位に保持することができることを実証しました。 αH6時更に、抗CD4 IgGを用いて固定PA / GアダプタがEAK16-II / EAKIIH6（EAK）ヒドロゲルに添加し、CD4 + T細胞を特異的に^10を捕捉しました。同様の技術を使用して、我々は最近のTEC Cの3-Dの凝集を実証しています（：PA / G：αEpCAMαH6）TEC-特定の抗EpCAM抗体を運ぶアダプター複合体とEAKハイドロゲルに昇格するウルド。ヌードマウスの腎臓カプセル下に移植した場合、EAKハイドロゲルに埋め込 ​​まれたTECクラスタが効果的に生体内^11,12に機能的なT細胞の開発を支援することができます。

ここでは、迅速かつ効果的に蛍光活性化細胞選別（FACS）でのTECを浄化し、EAKハイドロゲルシステムと3次元TEC凝集体を生成するために、我々の方法を示します。

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プロトコル

実験で使用した全ての動物は、アレゲニー健康ネットワーク/アレゲニーシンガー研究所の施設内動物管理使用委員会によって審査および承認されたプロトコルの下でアレゲニー・シンガー研究所の動物施設に収容しました。

1.コラゲナーゼで胸腺を消化

1. 収穫胸腺。
   1. 胸腺を収穫するために、二酸化炭素（CO _2）チャンバー内で3-5週齢のC57BL6 / Jマウスを安楽死させます。具体的には、3〜5分間、CO ₂の誘導の下でチャンバー内にマウスを置き、心臓や呼吸停止を検証することによって、死亡を確認。
   2. その裏に死体を置き、70％エタノールで体を濡らします。皮膚を通してその腹部に鋭い、ストレート解剖ハサミで小さな水平切開を行います。それは裏返しされるように両端（頭部と脚）の皮膚を引きます。
   3. すぐ下に解剖ハサミで水平カットを作ります最低リブとは、横振動板をカット。ピンセットで剣状突起を持ち、両側にまで進んリブの真ん中を切りました。胸腺がはっきり見えるように肋骨/胸骨を引き上げます。
      注：胸腺、心臓の上に直接位置する2葉からなり、白色半透明色のものです。
   4. 湾曲した鉗子を使用して、静かに（材料のリストを参照してください）​​洗浄液中の結合組織および転送のオフ胸腺ローブをスクープし、引き出します。
2. 9mLのRPMI-1640（ロズウェルパーク記念研究所培地-1640）、0.025 mg / mlで精製されたコラゲナーゼ、10mMのHEPES [4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸]、および0.2 mg / mlで混合することにより、消化液を調製50ml遠心管中のDNase I。使用するまで37℃の水浴中で消化溶液を保管してください。
   注：準備消化溶液の量は、1 5ミリリットルポリスチレン丸で一緒にインキュベートすることができる最大5つの成体マウスの胸腺、のために十分です下部チューブ。
3. 5〜6ミリリットルRPMI-1640を含む60ミリメートルの組織培養皿に胸腺を転送します。
4. リンパ球が流出できるように小片（約1mm ³の正方形）に28 Gインスリン注射針で胸腺を解剖。
5. ガラスパスツールピペットでペトリ皿で​​あるRPMI-1640と胸腺の作品をすすぎます。皿を傾け、胸腺断片が底に沈殿してみましょう。ゆっくり吸引し、ガラスピペットを用いて、RPMI-1640上清を捨てます。解決策はあまり不透明になるまで、ガラスピペットを用いて4-5回5〜6ミリリットルRPMI-1640でこのすすぎ工程を繰り返します。
   注：胸腺断片は、胸腺組織の過剰な損失をもたらす、プラスチックに固執する傾向があるので、ガラスピペットは、この段階で推奨されています。残りの手順については、プラスチック製のピペットを使用しています。
6. ステップ1.5で説明したように最後のすすぎの後、上清を捨てます。 3ミリリットルの消化溶液を追加し、5ミリリットル丸底Pに胸腺片とソリューションを転送olystyreneチューブ。
7. チューブ回転にチューブを置き、12回転の回転速度で6分間37℃でインキュベートします。
8. インキュベーション後、胸腺断片は、重力によって、チューブの底に沈殿してみましょう。パスツールピペットを用いて上清を回収し、洗浄溶液10mlと50mlの遠心管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、上清を捨て、10mlの洗浄溶液で細胞を懸濁します。氷の上に保管してください。
9. 繰り返しは、5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに胸腺断片に二回1.6から1.8を繰り返します。同じ50ミリリットルチューブに上清をプール。
   注：遠心分離は、第2および第3の洗浄のための必要はありません。
10. 50mlの遠心管にチューブ、転送中の任意の残りのフラグメントを打破するために、最終的な消化の後、アップピペットと2ミリリットルのプラスチック血清学的ピペットを用いてダウン。
11. 5分間、300×gで遠心分離50ミリリットルチューブ、上清を吸引、洗浄ブフェの10ミリリットルで再懸濁100μmのセルストレーナーを通してrおよびフィルタ。氷の上に保管してください。

不連続密度勾配でのTECの2濃縮

1. 2.4ミリリットルの密度勾配培地（水中のイオジキサノールのw / vの60％）と9.6ミリリットル洗浄溶液を混合することにより、21％密度勾配溶液を調製します。
2. 2.5ミリリットル洗浄緩衝液中で5分間再懸濁し、300×gでステップ1.11から50ミリリットルコレクションチューブに解離した胸腺細胞を遠心します。
3. 細胞懸濁液に20ミリリットルRPMI-1640培地を追加します。
4. 電子ピペッターで10ミリリットル血清学的ピペットで21％密度勾配液の12ミリリットルを記入してください。細胞を含有する50mLの遠心チューブの底に血清学的ピペットの先端を配置し、重​​力を介してチューブの底に排出するための密度勾配溶液を可能にします。
   1. 穏やかに異なる密度の二層を生成終了するピペットからの密度勾配溶液を排出。
5. 600×gでFOで遠心分離スイングバケットローター中で、室温で20分rは。最も遅いレベルでの減速度を設定します。
6. 新しい50ミリリットルチューブにトップ層との界面を転送します。
   注：のTECのほとんどは界面に保持されます。リンパ球は、遠心分離後、チューブの底に沈殿します。これらの細胞は、他の目的に使用する場合、3回20mLの洗浄溶液でペレットを洗浄。洗浄緩衝液10ml中に細胞を再懸濁。
7. 4℃で6分間、400×gでステップ2.6および遠心機でチューブに40ミリリットルに洗浄液を追加します。ピペットで上清を、吸引を削除します。
8. ステップ2.7で説明したように洗浄し、吸引2回繰り返します。
9. 洗浄液の2ミリリットル中に再懸濁し、血球計数器で細胞をカウント。

FACS 3.分離のTEC

1. 洗浄液や転送に1×10 ⁶細胞/ 100μlの濃度でステップ2.9から細胞を調整します（フローソーターの指示により推奨されるように、ポリプロピレン、ポリスチレン、）5ミリリットル丸底チューブに細胞。
2. 1×10 ⁶個^の細胞当たり2μlの抗Fc受容体のIgGを添加し、4℃で10分間インキュベートします。
3. （：150希釈、サンプルあたり10μlの1）および抗EpCAM（1：100希釈、サンプルあたり10μl）を抗体および以上4℃で20分間インキュベート抗CD45を追加します。
4. 4℃で6分間、400×gで2ミリリットルの洗浄液と遠心で細胞を洗浄します。ピペットで上清を吸引除去します。
5. 1ml中の細胞1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁します。
6. 100μmのストレーナーを通して濾過。
7. 仕分け機器に細胞を適用します。その後、側方散乱光（SSC）/前方散乱光（FSC）パネル（死細胞^）、13をソート^するためCD45-のEpCAM +のために選択された集団にゲート上の最小のセルを除くリンパ球とTEC人口を選択します。

4. GTEC / EAK骨材のeneration

注：試薬調製と層状フードの下で混合セルを伴う手順を実行します。

1. 滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブ中の抗HisタグIgGの4μlの、抗EpCAM IgGの8μlのとPA / Gの2.6μLを混合することにより、PA / Gアダプター複合体を準備し、そして室温で5分間インキュベートします。
2. 洗浄溶液、およびピペット低蒸発、96ウェル丸底組織培養プレートの1ウェルに100μlの5×10 ⁴細胞/ mlにステップ3.7からソートのTECを調整します。細胞に14.6μlのPA / Gアダプター複合体を追加します。 4℃で20分間ロッキングプラットフォーム上でプレートを置きます。
3. 200μlの洗浄液で1回洗浄。 6分間400×gでプレートを遠心。マイクロピペットで上清を捨てます。
4. 200μlの10％スクロース溶液で1回洗浄します。 6分間400×gで遠心分離します。マイクロピペットで上清を捨てます。
5. 30μlの10％s内の細胞を再懸濁しウェルあたりショ糖ソリューションterile。
6. EAKIIH610μlの（7.5ミリグラム/ ml）を加え、室温で5分間インキュベートします。
7. TEC混合物にEAK16-II（10mg / ml）の20μlのを追加します。
8. ゲル化を開始するために、システムへの完全培地100μlを加えます。室温で15〜20分間プラットフォームシェーカー上でプレートを置きます。
9. 37℃のインキュベーターでプレートを置き、5％CO _2。 2-4時間後、完全培地の別の100μlのを追加します。
10. 使用時まで一日おきに培地交換。
    1. 吸引除去し、表面からの培地100μlのマイクロピペットを用いてゲルを乱すことなく、ゆっくりとでは、ウェルの壁にピペットチップを配置することによって、予め温めた培地100μlを追加します。

TEC / EAK骨材の5キャラクタリゼーション

1. in vivoでの TEC / EAK凝集体の機能を調べるために、無胸腺ヌードの腎臓被膜下O / N培養と移植後のTEC / EAKヒドロゲルを収集以前に記載された手順^11,14を用いて、マウス、。
2. 4-6週間は、抗CD4、-CD8のカクテルで-CD45を移植し、汚れを投稿ヌードマウスからEDTA含有採血管に50〜100μlの血液サンプルを採取することにより末梢におけるT細胞の発生を監視します、および-CD3 ^12は抗体。
3. 単一細胞解析ソフトウェア^12を使用して、フローサイトメトリー（FCM）で末梢血白血球におけるTリンパ球の割合を分析します。

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結果

CD45-間質細胞を濃縮するために密度勾配分離プロトコルを使用しての有効性を調べるために、インタフェースと沈殿リンパ球ペレットの両方から採取した細胞を、抗CD45及び抗EpCAM抗体で染色しました。抗ULEX Europaeusアグルチニン1（UEA1）および抗MHCクラスII抗体の両方がさらにCTECとMTECサブセットを識別するために、染色カクテルに含まれていました。 図1?...

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ディスカッション

TECは、胸腺間質の優勢な集団であると胸腺の構造と機能のために重要な役割を果たしているが、それらは、総胸腺細胞充実の約0.1から0.5パーセントを表します。彼らはまた、細胞死の高いパーセンテージは時折すなわち 、治療は、細胞外マトリックス（ECM）からのTECを解離するために、コラゲナーゼ消化後に観察されている脆弱な細胞です。その希少性（マウス胸腺あたり200,000）お?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701(1 Gallon)	Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Graefe forceps, straight	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Washing solution			1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)	Gibco	10010-023
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Invitrogen	15575-038
Digestion solution			9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	referred as "purified collagenase"
1 M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube	Corning	430290
60 mm tissue culture dish	Falcon	353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G	Becton Dickinson	329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube	Falcon	352058
5 ml glass pipet	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator	Miltenyi	130-090-753
100 µm Cell strainer	Falcon	352360
Density gradient medium: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube	Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx	BD Biosciences
Single cell analysis software	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G	Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile	Fisher Healthcare	05-402-24B	referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid	BD Falcon	353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% sucrose	Sigma	S0389	Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11150	Heat inactivated before use
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x	Gibco	11140-050
1 M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	model: USBDbo