IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング

要約

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

要約

好中球は人間の血液循環中で最も豊富な白血球であるとすぐに炎症部位に補充されます。プライミングは、好中球の貪食機能を強化し、重要なイベントです。広範な研究は、感染や傷害の間に好中球のプライミングの存在と重要性を発表しているが、 生体内でこのプロセスを可視化する手段が使用できなくなっています。蛍光結合抗リンパ球抗原の注入によって達成- 2）in vivoでの好中球の標識をプライミングの尺度として使用- 1）のDsRedレポーターシグナル：提供されたプロトコールは、3の方法論を組み合わせることにより、生きている動物にプライミング好中球のダイナミックなプロセスの監視が可能6G（Ly6G）モノクローナル抗体（mAb）、3）生体内共焦点画像化。いくつかの重要なステップは、このプロトコルに関与している：オキサゾロン誘発性マウス耳皮膚の炎症、動物の適切な鎮静、抗Ly6G mAbの反復注射、および前へ撮影時の焦点ドリフトのention。いくつかの制限は、1つのマウスでの連続撮影時間（〜8時間）の限界とフルオレセインイソチオシアネート - デキストラン炎症状態の血管からの漏出として、観察されているが、このプロトコルは、生体内イメージングのための基本的なフレームワークを提供します簡単にマウス炎症モデルにおける他の免疫細胞の検査に拡大することができる下塗りされた好中球の挙動と機能、。

概要

好中球は、循環中で最も豊富で短命白血球です。彼らは急速に彼らは抗菌ペプチドおよびプロテアーゼ^1を含有する顆粒と一緒に活性酸素の放出および窒素中間体を介してプロの食細胞として機能し、感染または損傷の部位に動員されます。彼らの募集時には、好中球は炎症²の部位での到着時に顕著に強化された食細胞の機能で、その結果、微生物製品、化学誘引物質、および炎症性サイトカインを含む種々の薬剤によって「プライミングされた"されています。好中球のプライミングのメカニズムが広く試験管 ^3,4 に研究されています。しかしながら、 インビボでのプロセスの動的監視は、これまで不可能でした。

近年、生体内イメージングは​​、生体内の生物学的プロセスの細胞動態を可視化し、定量化するための重要な技術となっています。 Intraviタル画像は、従来の一光子励起顕微鏡（ 例えば、共焦点）を介して行うことができ、または多顕微鏡^5に近づきます。時間が経つにつれて、かなりの改善が増加画像解像度、改善されたイメージング深さを可能にするこの技術で達成された、組織の光損傷、および強化された防振^6,7を減少^させ^ました 。時間をかけて細胞移動および相互作用の動的可視化を可能にする独自の能力を考えると、生体顕微鏡は広く免疫学⁸に研究の多様な分野に適用されています。生体内イメージングは​​、よりよい生きている動物モデルの両方の細胞および分子レベルでの免疫応答を理解し、文脈する免疫学者を可能にします。

最近のトランスジェニックの進歩だけでなく、ノックインレポーターマウスは、生​​きている動物に好中球の動的挙動を監視するための有用なツールを提供してきました。リゾチームMプロモーター駆動強化緑色蛍光タンパク質ノックインマウスは広く溢出、細菌感染、および無菌性炎症^9-15を含む種々の炎症性プロセスの間、好中球、単球、およびマクロファージの運動性を特徴づけるために使用されています。さらに、細胞質の蛍光共鳴エネルギー転移のバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスは、炎症性腸¹⁶内の好中球細胞外調節さマイトジェンキナーゼおよびプロテインキナーゼAの ​​活性を研究に使用されています。好中球における蛍光発現のための高い特異性を有するマウスモデルは、それ自体がリンパ球抗原^{6G（Ly6G）17}の発現に結合された蛍光タンパク質tdTomato、ならびにCreリコンビナーゼを生成キャッチアップノックインマウス、です。このモデルを介したLy6G欠損好中球の可視化は、これらの細胞が生体内の炎症のコンテキストでの滅菌または感染の様々な通常の機能を発揮することが実証されています。 DsRedの蛍光​​Pを発現するトランスジェニックマウス好中球、炎症性単球、および活性化マクロファージを含むと考え - - （IL-1β）プロモーター（pIL1-DsRedの）はIL-1β産生細胞の運動性挙動を可視化するために利用されているinterleuikin-1βマウスの制御下に遺伝子をrotein新興炎症を起こした皮膚の^18インチ

in vivoでの標識は、炎症を起こした組織中の好中球の細胞および分子の挙動を追跡するための代替的なアプローチとして機能することができます。蛍光標識した抗GR-1モノクローナル抗体（mAb）の低用量の静脈内注射した後、GR-1 ⁺好中球の動員カスケードは、 黄色ブドウ球菌 ¹⁹を感染させたマウスの皮膚病変で可視化されてきた。ストレプトアビジンを含む結合体のインビボ投与コンジュゲートさ705 nmの量子ドットおよびビオチン化抗Ly6G mAbが特異的に循環好中球^20にラベル^を付けます。 neutrophへのそのようなコンジュゲートのまた、エンドサイトーシスIL小胞間質への移行の好中球で高速小胞輸送の追跡を可能にする。P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）、L-セレクチン（CD62L）に対する蛍光標識抗体とのin vivo標識、インテグリンαM（CD11bのTNFα誘導性炎症モデルにおける）およびケモカイン（CXCモチーフ）受容体2（CXCR2）は、初期の炎症の²¹時に遊んで調節機構を解明しました。偏好中球は、CD11bおよびCXCR2の再分配が生じ、活性化血小板上のCD62Lの存在と対話するためのPSGL-1に富んだuropods、好中球遊走を駆動し、炎症を開始する受容体を突出しています。

IL-1βは、下塗りされた好中球²²に上昇しているシグネチャー遺伝子の一つです。 pIL1-DsRedのレポーターマウスにおいて、DsRedの蛍光シグナル（ すなわち 、IL-1βプロモーターの活性化）正にIL-1βmRNAの発現及びIL-1βタンパク質産生と相関します。 ^{18は、好中球のプライミングのプロセスを監視するには、生体顕微鏡法は、蛍光結合抗Ly6G mAbによる好中球のin vivo標識次pIL1-DsRedのマウスモデルにおけるオキサゾロン（OX）で皮膚の炎症の誘導を伴う開発されました。このモデルを介して、様々な疾患および障害の動物モデルにおいて好中球プライミングの動作及び機能を研究することが可能です。}

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プロトコル

全ての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実行し、トレドの大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。

pIL1-DsRedをマウスの1表現型

注：子孫は、野生型（WT）C57BL6マウスとヘテロ接合pIL1-DsRedのマウスを交配することによって生成されます。 3〜4週齢の仔は、表現型の準備と考えられています。マウスの顎下出血は、わずかな修正²³で確立されたプロトコルに準拠しています。

1. マウス子犬の全血からの白血球の分離
   1. 各1.5ミリリットルマイクロチューブにヘパリン20μlのを追加します。
   2. ケージから1子犬を取得します。子犬の識別タグを記録します。顎下静脈から採血する前に子犬を麻酔するために必要とされていません。
   3. 首の首筋によって子犬を持ち、目に顎下静脈を貫通5ミリメートルのランセットを使用して電子の頬袋。血の滴が浸透の点から発散するように、小さな穿刺を作成するために十分な力を適用します。各子犬のための新しい針を使用してください。
   4. ヘパリン含有マイクロチューブに子犬あたりの血液の5滴 - 3を収集します。穿刺部位をきれいにし、止血を容易にするための圧力を適用します。
   5. 新しいケージに子犬を入れて、動物施設にケージを返す前に30分間観察します。
   6. 正および負の対照として知られている表現型の成体マウスから血液を採取します。
   7. 各チューブ、ボルテックスチューブに赤血球溶解緩衝液500μlを追加し、5インキュベート - 氷の上で10分。
   8. 各管中の細胞懸濁液の下にウシ胎児血清（FBS）を500μl - ゆっくりと400を追加します。明確なインターフェースは、上位層の細胞懸濁液及びFBSの下位層との間に観察することができます。
   9. 5分間1500×gでキャップチューブと遠心分離機サンプル。
   10. 毛皮に1.1.9 - を繰り返して、1.1.7の手順THER赤血球を除去。溶解が初めて十分であれば繰り返さないでください。ペレットを遠心分離した後に識別することは困難であるべきです。
2. リポポリサッカライド（LPS）刺激と文化
   1. 完全なロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地200μlで細胞を再懸濁し。
   2. フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液を転送します。
   3. 完全RPMI 1640培地の990μlのLPSストック溶液10μl（1mg / ml）を混合して使用液をLPSを行います。
   4. 細胞懸濁液の200μlに作業溶液を10μg/ mlのLPSの20μLを加えます。
   5. キャップチューブを緩くし、5％CO ₂で37℃で4時間サンプルをインキュベートします。
3. フローサイトメトリー分析
   1. フローサイトメトリーのためのデータ取得プログラムを開きます。前サンプル取得に取得テンプレートを設定します。
   2. ツールパレットのドットプロットツールをクリックします。 FOを描きます側方散乱（SSC）プロット対rward散乱（FSC）。リニアスケールにFSCとSSCの電圧パラメータを設定します。
   3. サイトメーターによって許可されたFSCとSSCの最低のしきい値を選択します。それぞれ、FSCとSSCのしきい値200と50を適用します。
   4. SSCプロット対FSC内、破片、赤血球およびリンパ球、単球、顆粒球、および樹状細胞を含み、かつ除外ゲートG1を描きます。
   5. ツールパレットのヒストグラムツールをクリックします。 FL2（赤色蛍光チャネル）ヒストグラムを描画します。すべてのDsRed陽性事象を含めるようにゲートを描画するFL2信号のベースラインと陽性対照サンプルを設定するには、陰性対照試料を使用してください。
   6. サイトメーターの流体工学コントロールパネルで、「HI」（約60マイクロリットル/分）に「RUN」への流体モードと流量を設定します。各サンプルについて10,000事象を獲得します。
   7. G1のゲートからのDsRed陽性細胞の割合を測定することにより、子犬の表現型を決定します。

2。 pIL1-DsRedをマウスにおける皮膚の炎症の誘導

1. 100mg / kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン、および1mg / kgのアセプロマジンを含む麻酔薬カクテルの腹腔内（ip）注射によりマウスを麻酔。適切に麻酔したマウスは、つま先のピンチに後足の撤退を示しません。
2. マウスの両耳の背側表面に脱毛クリームを適用します。 1分30秒を待ちます。水湿らせたコットンで耳の表面を拭き、風乾させます。
3. マイクロメーターを使用して、耳の厚さを測定し、別々のケージにマウスを交換します。 （ - 30分〜15）麻酔から回復するまで観察します。脱毛製品によって誘発される皮膚の炎症を解決するために、さらなる実験が行われる前に、マウスは3日間休むことができます。
4. 1ミリリットルのアセトンにOXの16.7ミリグラムを溶解し、オリーブオイル250μlのOX /アセトン溶液750μLを混合することにより、1.25％（w / v）のOXを準備します。 250とアセトンの750μLを混合することにより、車両のソリューションを準備＃181;オリーブオイルのリットル。
5. 麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射による再麻酔マウス。以前のように耳の厚さを測定します。
6. 右耳の各側に1.25％OXの12.5μLを適用します。左耳のそれぞれの側にアセトン/オリーブオイルビヒクル溶液12.5μlのを適用します。
7. 完全に元のケージにマウスを交換し、動物飼育施設に戻り、その後、他のマウスがその耳に侮辱を防ぐために回復するまでマウスをケージメイトとは別に保管してください。
   注：脱毛は、耳の厚さの変化により、以下の軽微な皮膚の炎症を引き起こすことがあります。このマイナーな炎症は3日後に、通常の耳の厚さによって確認解決されます。 24時間局所適用した後、OX-処理された耳は有意な（P <0.01）と比較ビヒクル溶液のみで処理した耳膨潤を示します。

pIL1-DsRedをマウスにおける好中球の3ラベリング

注：低用量Fで好中球のin vivo標識luorescence共役好中球特異的mAbは、最近開発されたプロトコル^19に従います。眼窩後注射は、いくつかの変更²⁴で確立されたプロトコルに従って行われます。

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の90μlの0.5 mg / mlでアレクサフルオロ647結合抗Ly6Gモノクローナル抗体（クローン1A8）の10μLを希釈することにより抗Ly6G mAbのワーキング溶液を調製します。
2. 28ゲージの針を持つU-100インスリン注射器に抗Ly6G mAbのワーキング溶液（50μg/ mlの）の100μlのを転送します。
3. 先に説明した麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射により大人pIL1-DsRedをマウスを麻酔。クリーンな作業ボードに麻酔マウスの腹部を下に置きます。
4. 部分的にソケットから眼球突出する1つのマウスの眼に優しい下方皮膚背に圧力と腹を適用します。
5. 慎重に眼窩後に内側眼角で約30°の角度で、ダウンベベル、針を置きます洞。
   注：オペレータが洞に針を挿入一度圧力、浸透とホッと抵抗を感じることができます。
6. ゆっくりとスムーズマウスに抗Ly6G mAbの100μlのワーキング溶液（5μgのモノクローナル抗体/マウス/注射）を注入します。すぐに針を外します。出血少量の成功した注入を示唆しています。
7. すぐに右と左のマウスの耳の上に1.25％OXと車両のソリューションを適用します。
8. 8時間後、同じマウスに眼窩後部注射を介して新たに調製した抗Ly6G mAbのワーキング溶液（5μgのモノクローナル抗体/マウス/注射）の100μLを管理します。
9. 血管を可視化するために、すぐに撮影する前に、30 mg / mlでフルオレセインイソチオシアネート（FITC）の管理100μlを眼窩後部注射によってデキストラン（150kDaのを）抱合しました。

pIL-1-DsRedをマウスにおける好中球プライミングの4生体内イメージング

1. 麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射でマウスを麻酔。0;しばらくイメージングのための麻酔下で乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を適用します。
   1. 等量のPBSで元の麻酔薬カクテル500μlの希釈して1ミリリットル半用量の麻酔薬カクテルを準備します。
   2. 蝶27ゲージの針で1ミリリットル注射器に半用量の麻酔薬カクテルを転送します。
   3. 腹腔内にマウスの腹部に蝶の針を挿入し、テーピングによって腹部に蝶の羽を修正。
2. 撮影台の中心にカバーガラスを置きます。所定の位置に保持するためにカバースリップの端をテープで固定します。
3. マウスの耳の腹側表面上だけでなく、カバースリップ上でPBSのドロップを置きます。
4. 位置は、カバーガラスの上に、その耳で、マウスを麻酔しました。また、テープを介して、所定の位置に保持カバーガラスとスライドガラスとの間に耳を挟むことによって、ダウン耳の先端、背側をマウントします。
5. マルチレーザ蛍光共焦点顕微鏡および関連するすべての電子をオンにしますquipment。周囲光の露出を最小限にするために部屋の照明をオフにします。
6. 画像取得ソフトウェアを開きます。色素一覧メニューの蛍光色素の検出のためのレーザー・チャネルを選択します。
7. 接眼レンズを通してのDsRed ⁺細胞から血管や赤の信号から緑色の信号を観測することによって炎症を起こした耳皮膚にフォーカスを調整します。
8. スキャン2マイクロ秒/ピクセルの速度と512×512ピクセルの解像度で高速スキャンを実行します。ライブビューメニューの各チャンネルの擬似カラーを選択します。最後に設定し、スキャンの場所を開始するために、フォーカスノブを調整します。
9. 8マイクロ秒/ピクセルと800×800または1024×1024ピクセルの解像度 - スキャン4の速度でゆっくりとスキャンを実行します。高電圧を調整し、ゲイン、及び彩度（赤ピクセル）を回避しながら、信号の強度を最大化するために各チャンネルのオフセット。各チャンネルで唯一の少数の赤色画素があるはずです。
10. 目をスキャンすることによって三次元画像セットを作成電子の耳皮膚、635ミクロン×635ミクロン×30ミクロン（20X対物レンズ）、または1270ミクロン×を角質層に表面的に始まり、X、Y、317ミクロン×30ミクロン（対物レンズ40倍）×317ミクロンのZボリューム下方に進んで2ミクロンのzの手順で1270ミクロン×50ミクロン（10×対物レンズ）。
    注：角質層は、表皮の最も外側の層であり、容易にその強い自家蛍光信号に基づいてローカライズすることができます。
11. タイムラプスイメージング実験では、レコードの3次元画像を最大8時間ごとに2または4分。
12. 蝶の針を介して半用量の麻酔カクテル10μlの - マウスが麻酔から回復し始めると断続的に、5を管理し、けいれんウィスカーの観察に基づいて指摘しました。
    注：麻酔用量の注意が必要 - 過剰摂取がマウスの死を引き起こす可能性があります。また、瓶内吸入麻酔は、短期的な麻酔およびAのマウスに適用することができますノーズコーンは、長期的画像化のために使用することができます。
13. イメージングが完了した段階から麻酔マウスを削除します。テープを外し、マウスの腹部から翼状針を取り除きます。動物飼育施設内の別々のケージにマウスを返します。
    注： - 3時間の短期イメージング（<1時間）のために、マウスは完全に1に迅速に麻酔から回復します。 16時間 - 長期イメージング（〜8時間）のために、マウスは、12の一般的な回復期間で、ゆっくりと回復します。したがって、経口水投与は重度の脱水症を防ぐために、回復期間中に少なくとも数回をお勧めします。
14. 処理画像データセットは、個々の細胞を追跡遊走経路を生成し、画像解析ソフトウェア^25を使用して細胞移動の方向と速度を算出します。

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結果

pIL1-DsRedのマウスのスクリーニングを、フローサイトメトリーを使用して、末梢血白血球によって産生される表現型のDsRed蛍光シグナルに基づいて行われます。 LPS刺激は、好中球、単球、および樹状細胞を^26〜28を含む骨髄細胞におけるIL-1βの産生を誘導することが知られています。したがって、単離された白血球は、フローサイトメトリー分析の前に4時間、L...

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ディスカッション

本研究の目的は、まだ現在利用可能な技術によって満たされていない生きている動物における好中球のプライミングのプロセスを監視するための技術を開発することです。この目標を達成するために、3つの確立された方法が実行される：IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスの皮膚炎症の1）誘導プライミングの尺度として、蛍光結合抗Ly6Gの低用量での好中球の2）in vivo標識モ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging