関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

要約

ここでは、フィーダー細胞なしでレンチウイルス系を用いて、患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導された多能性ヒト幹細胞を生成するためのプロトコルを説明します。

要約

成熟した体細胞を再プログラミング因子の定義されたセットを使用して、多能性幹細胞のような状態に反転させることができます。 Oct4、Sox2、Klf4及びc-Myc：多くの研究は、4つの山中転写因子を形質導入することにより、様々な体細胞型から誘導され、多能性幹細胞（性IPSC）を生成しています。性IPSCの研究は、生物学的および臨床研究の最先端に残ります。 iPS細胞は、任意の個々の組織から誘導することができるので、特に、患者特異的iPS細胞は、疾患の病理生物学の研究のための先駆的なツールとして使用することができます。関節リウマチ（RA）は、関節内の軟骨および骨の構造の破壊によって分類慢性炎症性疾患です。滑膜過形成は、RAにおけるこれらの結果につながる主な理由や症状の一つです。線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は過形成滑膜における主成分細胞です。関節内のFLSSは限りなく、最終的に隣接cartilに侵入、増殖します年齢や骨。現在、過形成性滑膜は、外科的処置によって除去することができます。削除された滑膜は、関節の炎症状態を反映する材料として、RAの研究のために使用されます。 RAの病因における主要なプレーヤーとして、FLSSは、RA患者の性IPSCを生成し、調査するための材料として使用することができます。本研究では、iPS細胞を生成するために、RA患者のFLSSを使用しました。レンチウイルス系を用いて、我々は、FLSSがRA患者固有のIPSCを生成することができることを発見しました。 FLSSから生成されたiPS細胞は、さらに、将来のRAの病態生理学を研究するためのツールとして使用することができます。

概要

多能性幹細胞は、様々な臨床的および生物学分野における次世代プラットフォームです。それらは、疾患モデル、薬物スクリーニング、および再生医療の治療に用いることができる有望なツールです。ヒト胚性幹細胞（hESC）は、主に研究し、多能性細胞を理解するために使用しました。しかしながら、ヒト胚盤胞の破壊により単離し、ヒトES細胞は、いくつかの倫理的な問題と関連しています。 2007年には、博士山中伸弥と彼のチームは、セルプログラミングプロセスを逆転し、ヒト成体の体細胞^1,2から幹細胞を開発しました。したがって、ヒトES細胞とは異なり、誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）は、倫理的なハードルを回避し、成熟した体細胞から生成することができます。

Oct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc：通常、性IPSCは、4つの外因性遺伝子の送達によって生成されます。これらの山中因子は、もともとレンチウイルスおよびレトロウイルス系を使用して配信されます。最初のiPS細胞は、マウスの体細胞cから誘導されましたells ^3。その後、技術は、ヒト皮膚線維芽細胞^1,2に適用しました。その後の研究に成功し、尿^4、血液^5,6、ケラチノサイト^7、およびいくつかの他の細胞型など、さまざまなソースからのiPS細胞を、生成されました。しかし、いくつかの体細胞再プログラミングに使用されていない細胞、および疾患状態の特定の組織からの種々の細胞型の再プログラミング能力のスクリーニングがあり、依然として必要とされています。

関節リウマチ（RA）は、すべての関節を打つと他の臓器における自己免疫疾患につながる可能性疾患です。 RAは、先進国で成人の約1％に影響を与えます。それはむしろ一般的な疾患であり、その発生率は毎年⁸増加します。しかし、RAは、初期の段階で特定するのは困難であると破壊onceboneダメージを回復することができない治療法がありませんが発生します。また、薬物の有効性は、患者に、患者は異なり、衛生兵を予測することは困難です必要とされるINE。したがって、薬物スクリーニング方法の開発が必要とされ、RAの状況を反映することができる細胞材料が必要とされます。

線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は、RA ^9,10の病因における積極的なセルラー参加しています。 FLSSはまた、滑膜と呼ばれる関節包とキャビティとの間滑膜内膜ライニング、中に存在します。関節の構造を支持し、周囲の軟骨に栄養を提供することにより、FLSSは通常、関節機能と維持に重要な役割を果たしています。しかし、RAのFLSSは、浸潤性の表現型を持っています。 RA FLSSは、最終的に無限増殖¹⁰によって周囲の骨を破壊し、癌様の表現型を持っています。このユニークな特性を有する、FLSSはRAの病理生物学を反映することができる有望な材料として用いることができます。しかし、これらの細胞はほとんど生産されず、細胞がin vitroでのいくつかの通路を通って行くように細胞表現型を変更します条件。したがって、患者の状態を表すことができるツールとしてRA FLSSを使用するために複雑になることができます。

理論的には、RA患者由来のiPS細胞（RA-性IPSC）は、薬物スクリーニング、さらなる研究のための理想的なツールになることができます。生成されたiPS細胞は、自己再生能を有し、 インビトロで維持し、拡張することができます。多能性と、これらの細胞は、RAおよび他の骨関連疾患¹¹の特定の研究のための細胞物質の寄与することができる成熟した軟骨細胞及び骨細胞系統へ分化させることができます。

本研究では、外科的に除去滑膜からFLSSを分離し、展開する方法を示し、そしてどのように山中因子を含むレンチウイルスを用いて、FLSSからRA-iPS細胞を生成します。

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プロトコル

倫理に関する声明：本研究プロトコルは、カトリック大学校（KC12TISI0861）の施設内倫理委員会によって承認されました。

1.滑膜細胞の単離と拡大

1. 滑膜細胞の単離
   1. 手術用はさみの2組と鉗子の1ペアを滅菌します。
   2. 100mmディッシュに滑膜組織を移し、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで洗浄します。
   3. 黄色がかった脂肪組織および骨残基を切断。 6ウェルプレートのウェルにトリミングされた組織を移し、20％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を5ml加えます。
   4. 作品は使い捨てピペットを貫通するのに十分に小さくなるまでハサミで組織をみじん切りに。
   5. 50ミリリットルコニカルチューブに組織含有培地を転送します。 6ウェルプレートに20％FBSを含むDMEMの5ミリリットルを追加することで、残りの材料を収穫した後、チューブに移します。
   6. 氷上で解凍コラゲナーゼ。 0.01％の最終濃度にコラゲナーゼを追加し、パラフィルムでチューブを密封します。 4時間振とうしながら37℃の水浴中でインキュベートします。
   7. 全量を10分間300×gで、室温で50 mlの遠心分離になるまでインキュベートした後、20％FBSを含むDMEMでチューブを満たします。
   8. ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットを再懸濁するためにメディアの40ミリリットルを追加します。
   9. 繰り返しは1.1.10-1.1.11を繰り返します。
   10. 20％のFBSを含むDMEM 25mlにペレットを再懸濁し、底に沈むする組織の大きな塊を待ちます。
   11. 100ミリメートル皿に上清を移し、14日に5％CO ₂中で37℃でインキュベートします。
2. 滑膜細胞維持・拡大
   1. プレートから使用されているメディアを捨て、PBS 5mlで細胞を洗浄。
   2. 1mlのPBS / 1mMのEDTAを添加し、2分間、5％CO ₂中、37℃でインキュベートします。
   3. 静かに皿とtransfeをタップしますR 15 mLコニカルチューブに細胞。 2分間、250×gでRTを、細胞を遠心します。
   4. ペレットを乱すことなく上清を除去し、20％FBSを含むDMEM 30mlにペレットを再懸濁。
   5. 目に見える残りの材料を残すことなく、3×100mm皿に細胞を移します。
   6. 新鮮な培地3日毎に培地を交換してください。 1mlのPBS / 1mMのEDTAを用いて80％の密集度で細胞を分割します。使用前に継代3まで維持します。すべての分割で3皿に細胞の各皿を割ります。
      注：通路3に達した後、すぐに使用するつもりはありません細胞を凍結することができます。

レンチウイルスをコードする山中因子を使用して2再プログラミングFLSS

1. トランスダクション（D0）
   1. 増殖培地中の種子6ウェルプレートのウェルあたり3×10 ⁴細胞（DMEM 500mlを、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）。 5％CO中37℃で細胞O / Nインキュベート2。
   2. 4℃で冷凍庫と解凍からのOct4、Klf4の、Sox2の、およびc-Mycの次の日、4山中因子を含むレンチウイルスの1つのバイアルを取り外します。注：レンチウイルスは、我々の以前の研究¹¹に記載した手順で製造しました。
   3. ウイルスを解凍しながら、10 / mlのヘキサジメトリン臭化および50μg/ mlのアスコルビン酸を含有するFLSの増殖培地（DMEM、20％FBSを加えた抗生物質）にメディアを変更します。
   4. メディアを変更した後、細胞にレンチウイルスの30μlを添加し、穏やかに混合します。感染症を改善するために、30分間680×gで、35℃でプレートを遠心します。
   5. 遠心分離後、5％CO ₂中37℃で細胞をインキュベートします。
2. メンテナンス再プログラミングが表示されるまで
   1. 3日のために、0.1 mMの酪酸ナトリウムおよび50μg/ mlのアスコルビン酸を含有するFLSの増殖培地で毎日メディアを交換。
   2. 翌日、FLSの増殖培地の混合物を用いてメディアを交換し、IPSC培地：0.1mMの酪酸ナトリウムおよび50μg/ mlのアスコルビン酸を含有する（1：1の比）。
      注：IPSC媒体の成分は、材料/機器リストに記載されています。
3. コロニー形成のために細胞を分割
   1. ビトロネクチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。
      1. Ca ²⁺およびMg ²⁺なし6ミリリットルのPBSに60μlのビトロネクチンを追加します。各ウェルに混合物の2ミリリットルを入れ、少なくとも1時間RTでインキュベートします。注：ビトロネクチンの作業濃度は5μg/ mlのです。
   2. D5で、PBSで細胞を洗浄。
   3. 細胞を剥離し、2分間、37℃、5％CO ₂でインキュベートし1mlのPBS / 1mMのEDTAを追加します。
   4. 2分間、250×gでRTを細胞や遠心分離機を収穫。
   5. 別の集密度を達成するために、3つの異なる比（9：3、1：6、および1 1）で細胞を分割します。細胞ペレットを再懸濁へのメディアの900μlのを追加します。 、300を追加し150、及び6-ウェル当たりの細胞混合液100μlそれぞれ、9：3,1：6、および1ウェルプレート1の比を達成します。
   6. コロニーが出現するまでIPSCメディアで毎日メディアを交換してください。コロニーは約D18の後に表示されます。注：この段階では、IPSCのコロニーは、非再プログラムFLSSと共存。
4. コロニーピッキング
   1. ウェルに500μlのビトロネクチンを追加することにより、48ウェルのビトロネクチンでコーティングされたプレートを用意し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。
   2. クリーンベンチに顕微鏡を置き、インキュベーターから6ウェルプレートを取り外します。
   3. 48ウェルプレートからビトロネクチン溶液を除去し、10mMのRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤を補った500μlのIPSCのメディアを追加します。
   4. 10Pピペットチップを使用して、コロニーの周囲に切断します。 48ウェルプレートの1ウェルに選んだコロニーを転送します。
   5. いくつかのコロニーを採取した後、37°C​​、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。
   6. コロニーが大きいENOになるまで細胞を維持ぐふ転送のため。注：100X倍率で見た場合、コロニーは、顕微鏡の可視フィールドの外に取得するときに我々は通常、細胞をこぼしました。

3.免疫蛍光染色

1. 細胞調製
   1. 12ウェルプレートに、滅菌18ミリメートルのカバーガラスを置きます。
   2. カバーガラスを冷却し、すすぐために1mlのPBSを追加します。
   3. 10μg/ mlのビトロネクチン溶液1mlと交換してください。
   4. 少なくとも室温で1時間プレートをインキュベートします。
   5. 毎日メディアを変え、37℃、5％CO ₂で7日間ビトロネクチンでコーティングした12ウェルプレートと文化の中でビトロネクチン液とプレートiPS細胞を捨てます。
2. 細胞染色
   1. 培養培地を捨て、PBSで一回細胞を洗浄します。
   2. RTで30分間、0.4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定してください。
   3. RTで5分間、0.1％トリトンX-100で細胞を透過性。
   4. 透過性を削除しますPBSを室温で30分間、2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する溶液とブロック。
   5. 表1に記載の2％BSAを含むPBS中の抗体を希釈する。室温で2時間一次抗体で細胞をインキュベートします。
   6. 二次抗体（希釈1：200）を追加し、光を避け、室温で1時間、細胞をインキュベートします。
   7. 10分間の1μL/ mLのDAPIで細胞を処理します。
   8. 退色防止試薬とスライドガラスの上にカバーガラスを配置し、光を避け、室温で24時間インキュベートします。
   9. 蛍光顕微鏡で式を確認してください。

前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）

1. チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法^11を用いて^、細胞ペレットからmRNAを抽出します。
2. 逆転写^11を用いて、全mRNAの2μgのからcDNAを増幅します。
3. cDNAテムの2μLを用いたPCRに必要な成分を混合プレート^11。
4. RT-PCRを行い、ゲル電気泳動¹¹で結果を確認します。

5.アルカリホスファターゼ（AP）染色

1. 37℃で5-7日間培養性IPSC、染色前に、5％のCO _2。
2. メディアを吸引し、1分間、4％PFAで細胞を固定します。
3. 固定液を捨て、1Xリンスバッファーで細胞を洗浄。
4. AP染色のための試薬を準備します。ファストレッドバイオレット：ナフトールAS-BIリン酸塩溶液：水= 2：1：以下の比率での試薬を混ぜる1。
5. 光を避けて、15分間、室温で染色液で細胞をインキュベートします。
6. 染色液を捨て、リンスバッファーで細胞を洗浄。
7. 乾燥を防止し、明視野顕微鏡を使用して発現を確認するためにPBSで細胞を覆います。

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結果

本研究では、レンチウイルスシステムを使用してFLSSからiPS細胞を生成するためのプロトコルを記述している。 図1Aは、FLS単離プロトコールの簡単なスキームを示します。滑膜の外科的除去に続いて、組織は、外科用はさみを使用して小片に切断しました。コラゲナーゼは、組織の塊から細胞を単離するために添加しました。細胞は、さらなる処理の前に1...

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ディスカッション

iPS細胞の発見前に、科学者たちは、主に分化を通じて幹細胞生物学および他の細胞系譜を研究するためのESCを使用していました。しかし、ESCは、初期段階の胚である胚盤胞の内部塊に由来します。 ESCを単離するために、胚盤胞の破壊を克服することは不可能である倫理的な問題を上げ、避けられません。 ESCは、幹細胞性特性および多分化能を有するがまた、それらは個体から得ることがで?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004