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要約

Proton Transfer Reaction Time of Flight Mass Spectrometry allows high-sensitivity, rapid and non-invasive analysis of volatile organic compounds. To demonstrate its potential, we give three examples: lactic acid fermentation of yogurt (on-line bioprocess monitoring), different apple genotypes (large-scale screening), and retronasal space after drinking coffee (nosespace analysis).

要約

プロトン移動反応（PTR）は飛行時間型（TOF）質量分析計（MS）と組み合わせて、直接イオン注入質量分析（DIMS）技術に属する化学イオン化に基づく分析アプローチです。これらの技術は、揮発性有機化合物（VOCs）の迅速な測定を可能にし、高い感度と精度を保証します。一般に、PTR-MSは、試料の調製も試料の破壊も必要とせず、試料のリアルタイムおよび非侵襲的分析を可能にする。 PTR-MSは、環境および大気化学から医学および生物科学に至るまで、多くの分野で利用されています。より最近では、オートサンプリングの度合いを高め、結果として技術の可能性を高めるために、PTR-ToF-MSを自動サンプラーとテーラードデータ解析ツールと結合した方法論を開発しました。このアプローチにより、バイオプロセス（ 例えば、酵素酸化、アルコール発酵）を監視し、大きなサンプルセットをスクリーニングすることができたVOC含有量に関していくつかの実験モード（ 例えば 、特定の成分の異なる濃度、特定の技術的パラメータの異なる強度）を分析することが可能である（ 例えば 、異なる起源、全生殖胞）。ここでは、ヨーグルトの乳酸発酵中に放出されるVOCの検出（オンラインバイオプロセスモニタリング）、異なるリンゴ品種（大規模スクリーニング）に関連するVOCのモニタリング、 、およびコーヒー飲用中のレトロナサルVOC放出のインビボ研究（鼻腔の分析）が含まれる。

概要

Direct-Injection Mass Spectrometric（DIMS）技術は、揮発性有機化合物（VOCs）の迅速な検出と定量化を可能にする、高感度で堅牢な質量分析と時間分解能を提供する分析装置アプローチの一種です。これらの器械的アプローチには、とりわけ、MS-e-鼻、大気圧化学イオン化質量分析（APCI-MS）、プロトン移動反応質量分析（PTR-MS）、および選択イオンフローチューブ質量分析SIFT-MS） 1 。各アプローチの賛否両論は、サンプル注入の種類、前駆イオンの供給源と制御、イオン化プロセスの制御、質量分析器1,2によって決まります。

プロトン移動反応質量分析（PTR-MS）は、20年以上前にリアルタイムおよびウィ大気中の最も揮発性の有機化合物（VOCs） 3、4 。 PTR-MSの現在の用途は、医療用途から食品管理、環境調査までである 5,6 。この技術の主な特徴は、迅速かつ連続的な測定の可能性、前駆体イオンの強力で純粋な供給源、およびイオン化条件（圧力、温度およびドリフト電圧）を制御する可能性である。これらの機能により、汎用性の高い用途と高度な標準化の組み合わせが可能になります。実際、この方法は、ほとんどの揮発性化合物（特にプロトン親和力が水より高いもの）において非解離性プロトン移動を誘発するヒドロニウムイオン（H 3 O + ）の反応に基づいており、プロトン化中性化合物H 3 O + + M→H 2 O + MH +の反応に従う。 APCI-MS などの他の技術とは対照的に、プリカーサーイオン生成とサンプルイオン化は、2つの異なる機器区画に分かれています（PTR-MS機器の概略図は図1に示されています ）。中空カソードイオン源内の水蒸気による放電は、ヒドロニウムイオンのビームを生成する。この段階の後、イオンはドリフト管を横切り、そこでVOCのイオン化が行われる。イオンはパルス抽出セクションに入り、TOFセクションに加速されます。飛行時間を通して、イオン8の質量電荷比を決定することが可能である。各抽出パルスは、選択されたm / z範囲の完全な質量スペクトル8をもたらす。イオンスペクトルは、高速データ収集システム7によって記録される。完全なスペクトルは典型的には信号対雑音レベルに応じてより高い時間分解能を達成することができるが、VOCヘッドスペース濃度の定量的推定は、較正9,10なしでも提供することができるが、1秒で取得することができる。

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図1： PTR-MSの概略 図 。 PTR-MS装置の模式図。 HC：中空カソードを有する外部イオン源; SD：ソースドリフト。 VI、ベンチュリ型入口; EM、電子増倍管; FC1-2、フローコントローラ。 Boschetti らの許可を得て転載。 7 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

11 。 PTRは、環境、大気、食品、技術、医学、生物学の分野でかなりの関心を集めています12 。

食物マトリックスに関連するVOCは、臭気および風味の知覚に関連した生物学的現象の分子的基盤における重要な役割のために、食品科学技術に非常に関心が高い。したがって、VOCのリアルタイムおよび非侵襲的検出への関心は、主に食物の感覚的性質を扱う。さらに、放出されたVOC13によって腐敗および病原性微生物を検出する可能性、および/または揮発性有機化合物をマーカーとしてモニタリングする可能性を考慮すると（ 例えば 、熱処理中のメイラード副産物） 14 、VOCの同定と定量化が食品品質管理における関心のある分野であることは明らかである6 。食品マトリックス中のVOCの迅速なモニタリングと定量化のためのPTR-MS技術の最近の使用例では、これらの分析手法の適用範囲が広いことが証明されています（ 表1 ）。

食品マトリックス 申請の種類 簡単な説明 参照
バタースクリーニング/キャラクタリゼーション欧州バターの地理的起源 15
ヨーグルトバイオプロセスモニタリング乳酸中の進化指導 16
シリアルバー インビボ測定砂糖組成の異なるシリアルバーの消費中の鼻空間 17
液体モデルシステムシミュレートされた口頭条件モデル口における舌圧および口腔状態の評価 18
林檎 インビボ測定異なる遺伝的、組織的および物理化学的パラメータを有するリンゴを消費する間の鼻腔 19
コーヒースクリーニング/キャラクタリゼーション専門コーヒーの差別化 20
ブドウは必須ですスクリーニング/キャラクタリゼーション調理プロセスの効果 21
風味のあるキャンディー インビボ測定異なるパネルを使用したパネリストの決定直接質量分析法 22
ハムスクリーニング/キャラクタリゼーション養鶏システムの効果 23
パンシミュレートされた口頭条件咀嚼中のパンの香りをシミュレートする 24
牛乳スクリーニング/キャラクタリゼーション光酸化に起因するミルクの動的変化のモニタリング 25
コーヒースクリーニング/キャラクタリゼーション異なった地理的起源のローストコーヒーの多様性 26
パンバイオプロセスモニタリングアルコール発酵中の異なる酵母スターターの効果 27
コーヒー インビボ測定異なる焙煎コーヒー調製物の摂取中の鼻腔 28
トマトスクリーニング/キャラクタリゼーション生産場所、生産システム、およびバラエティの影響 29
パンバイオプロセスモニタリングアルコール発酵中の小麦粉、酵母およびその相互作用の影響 30
きのこスクリーニング/キャラクタリゼーション乾燥ポルチーニキノコの賞味期限 31
ヨーグルトバイオプロセスモニタリング乳酸発酵中の様々なスターター培養の影響 32
林檎スクリーニング/キャラクタリゼーションリンゴgermplasmコレクションの多様性 33
コーヒースクリーニング/キャラクタリゼーションコーヒーの原点を追跡する 34
コーヒー インビボ測定の組み合わせコーヒーの知覚を理解するための動的感覚法と生体内鼻空間解析 35

表1：食品分野におけるPTR-ToF-MSを用いた科学的研究のリスト。食品関連の実験でVOC含有量を監視するPTRベースのアプローチを使用した科学研究の非網羅的なリスト。

最近の研究では、自動サンプリングシステムと組み合わせたPTR-ToF-MSの適用と、サンプルの自動化と信頼性を高め、結果としてこの技術の可能性を高めた7,10,13のデータ解析ツールについて報告しました。これにより、VOC含有量に関して、VOC放出に対するいくつかの実験モードの影響を分析するために、VOC含有量に関して、大きなサンプルセット（ 例えば 、多数の複製物、全生殖胞を有する異なる起源の食品）をスクリーニングすることができた特定の技術パラメータの多様な強度）、および所与のバイオプロセスに関連するVOC（ 例えば、酵素酸化、アルコール発酵）を監視することができる。ここでは、農業食品分野におけるPTR-ToF-MSの可能性を例示するために、異なる微生物スターター培養物によって誘発されたヨーグルトの乳酸発酵中に放出されるVOCの検出（オンラインバイオプロセスモニタリング）、異なるリンゴ品種（大規模スクリーニング）に関連するVOCのモニタリング、コーヒー飲用中の鼻孔VOC放出のインビボ研究（鼻腔分析）。

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プロトコル

このプロトコルは、人間の研究倫理に関する制度委員会のガイドラインに従っています。

1.サンプル調製およびオートサンプラー条件

  1. オンラインバイオプロセスモニタリング：ヨーグルトの乳酸発酵中に放出されるVOCの検出
    注：プロトコルのこのセクションは、Benozzi らによって報告された手順の一部を表しています。 32
    1. 各バイアルに5 mLの低温殺菌ミルクを加えます（PTFE /シリコンセプタムを備えた20 mLガラスバイアル）。使用したミルクの種類に注意し、試料を45℃に素早く加熱する。温度制御トレー（45℃）を備えた多機能GCオートサンプラーに移します。
    2. オートサンプラーのロボットアームを使用して、バイアルに微生物スターター培養液を接種します（スターター培養メーカーの仕様に従う）。所望のヨーグルトの種類と仕様に応じてインキュベーション時間を設定するスターターカルチャーメーカーが報告した。一方のサンプルを便利に分析し、ヨーグルト調製中の乳酸発酵のオンラインVOCモニタリングを得るために、オートサンプラーを設定します。
  2. 大規模スクリーニング：異なるリンゴの遺伝子型に関連するVOCのモニタリング
    注：プロトコルのこのセクションは、Farneti らによって報告された手順の一部を表している。 33,36
    1. 熟成/保存の所望の段階（ 例えば 、商業的収穫段階）でリンゴをサンプルする。各クローンに目に見える損傷を与えずに、少なくとも5つの均質な果物を選択します。室温（25℃）または冷蔵（4℃）でリンゴを所望の期間貯蔵する。
    2. フルーツブレードサンプラーを使用して、各リンゴから円柱ディスク（直径1.7cm、厚さ1cm）5枚を集める。皮質組織の一部を含めると、コア部分にシードが付かないようにします。直ちにサンプルをホモジナイズし、液体窒素中で凍らせる。分析まで-80℃で保存する。
    3. 分析前に、各生物学的複製物からの2.5gリンゴ試料の3つの複製物をバイアル（PTFE /シリコーンセプタムを備えた20mLのガラスバイアル）に入れる。 2.5 mLの脱イオン水、1 gの塩化ナトリウム、12.5 mgのアスコルビン酸、12.5 mgのクエン酸とサンプルを混合し、分析までサンプルを4℃で保存します（最大3日間）。
    4. サンプルを40℃でインキュベートし、オートサンプラーを設定してVOCを自動的に分析します。
  3. 鼻空間分析：コーヒー飲酒中のVOCのレトロナス放出の研究
    注：プロトコルのこのセクションは、Romano らによって報告された手順の一部を表している。 28
    1. 挽いたコーヒーサンプルから淹れたコーヒーを準備する。
      1. コーヒーマシンを使用する：水/粉比、使用されるミネラルウォーターの種類、コーヒーメーカーのタイプ、およびコーヒー飲料を得るために採用される手順（量はコーヒーマシンの寸法の関数である）を含む。
      2. 450mLの水と30gのコーヒーパウダーを使用して、イタリアでは「モカ」として知られている6カップのストーブトップコーヒーメーカーを使用します。醸造したコーヒーを容器に入れ、恒温水槽（60℃）で移す。
    2. 各コーヒー醸造物について、7.5mLアリコートをポリスチレンカップ（40mL）にプラスチックキャップで移す。各パネリストに、i）30秒間の自由な呼吸、ii）1回のコーヒー、その後の速やかな飲み込み、およびiii）人間工学的なガラスのノーズピース28への3分間の呼吸で飲料を味わう。
    3. 毎日コーヒーサンプルとパネリストの順序をランダム化して、3日間連続して実験全体を繰り返します。
    4. パネラーの鼻にシリコンゴムの使い捨てエルゴノミックノーズピースを適用してサンプリングを行います。 nを接続するPEEKチューブを使用して、パネリスト本体と接触する第1の部分のみが加熱されないようにし、次いでサンプリングインターフェースをPTR-MSと接続する入口ホース中で110℃で加熱する楽器
      注： 表2において、Benozzi らによって報告されたものと類似の手順で分析された製品のリスト32 、Farneti et al。 33,36およびRomano et al。 28が報告されている。
食品マトリックス サンプルの数と種類 参照
林檎著者らは、190個のアクセッションで表されるコレクションをスクリーニングし、古いものと新しいものの両方のリンゴの品種 33
ヨーグルトヨーグルトの乳酸発酵中に放出されたVOCに関して、4種の出発物質を分析した（A、FD-DVS YF-L812 Yo-Flex、Chan、Hansen; B、FD-DVS YC-380 Yo-Flex、 -DVS YC-X11 Yo-Flex、Chan。Hansen、D、YO-MIX 883、Danisco） 32
コーヒー単一の純粋なアラビカコーヒーブレンドから得られた3種類の粉砕コーヒーを使用した：ミディアムロースト、ダークローストおよびカフェインミディアムロースト 28

表2：分析された製品のリスト。 Benozzi らによって報告されたものと類似の手順で分析された生成物のリスト32 、Farneti et al。 33,36およびRomano et al。 28

2.実験設計と実用上の注意

  1. 少なくとも3日間の生物学的複製を実行する試験モードごとに、3つのテクニカル・レクリプションを備えています。
  2. サンプルのインキュベーションと分析の前に、各バイアルについて、ヘッドスペースを清浄な空気で200 sccmで1分間フラッシュします。
  3. すべての実験モードでブランクを準備し、サンプルの同じ条件下でブランクをインキュベートし、分析する。
  4. 分析のためにサンプル/ブランクの順序をランダム化する。
  5. VOCを検出するために使用される他の方法と同様に、器具を使用する前に、香水入りパーソナルケア製品、ならびにガムおよびタバコの使用を制限する。ラボのすべての揮発性化学物質をしっかりとキャップし、テスト中にできるだけエアードラフトを制御してください。

3. PTR-MS機器の最適化と解析

注記：計器条件は参考文献に記載されている（ 例： Makhoul et al。27）。

  1. commerciでサンプルのヘッドスペース測定を実行する標準的なコンフィギュレーションモードのPTR-ToF-MS装置に接続します。
  2. PTR-MSドリフトチューブのヘッドスペースに、何も処理することなく空気を直接注入します。 PTR-MSを通るサンプル空気の連続的な流れがあるので、PTR-MSインレットの端部を単にサンプルヘッドスペースに挿入するだけで注入が達成される。
  3. ドリフトチューブ内の以下のイオン化条件を設定し、常に確認してください：110℃ドリフトチューブ温度、2.30 mbarドリフト圧力、550 Vドリフト電圧。これにより、約140Td（1Td = 10 -17cm 2 V -1 s -1 ）のE / N比が得られる。インレットラインは、110℃に加熱したPEEKキャピラリーチューブ（内径0.04インチ）で構成されています。デフォルトでは、インレットフローを40 sccmに設定します。
  4. ToF取得チャンネルのサンプリング時間を0.1 nsに設定し、m / z = 400までのマススペクトルに対して350,000チャンネルになります。すべてのスペクトルは、約28,600回の集録の合計ですそれぞれ1μsの時間分解能が得られます。
    注：スペクトルはその後も連続して保存されます。分光測定信号は、バックグラウンドレベルから数秒で安定した値（入口ラインのガスを置換するのに必要な時間）に成長し、この過渡現象の後に得られたスペクトルのみがさらなる分析において考慮される。

4.カスタマイズされたデータ分析

注：MATLABの手順を使用して、カスタマイズされたデータ解析が開発されました。

  1. カペリン（Cappellin ）らによって記載されたようなポアソン（Poisson）統計に基づく方法論を介して、イオン検出器のデッドタイムに起因するカウント損失を補正する。 10 。
  2. Cappellin et al。によって記述された手順に従って内部較正を実行する。良好な質量精度（0.001Thまで）を達成するためには38です。
  3. 得られたスペクトルデータと参照標準の断片化データを比較する複合アノテーションを実行し、データr科学文献に掲載されている。
  4. Cappellin et al。によるノイズ除去、ベースライン除去、ピーク強度抽出を実行します。 39 、修正されたガウス分布を使用してピークに適合させる。
  5. Lindinger et al。によって記述された式を使用して、ppbv（10億分率）でピーク強度を計算します。 （k = 2.10 - 9 cm 3 s -1 ）のための適切な反応速度係数または一定値を使用して、 図5に示されている。後者は、実際の係数が既知であれば、30％までの系統誤差を考慮に入れることができる40 。
  6. 主成分分析、分散分析、Tukeyの事後検定、およびRを使用して開発された既存のパッケージを適合させる他の統計的検定/分析（ 例えば、 Cappellin et al。 10）。

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結果

サンプルの揮発性プロファイルは、毎秒取得される所望の質量範囲について完全な質量スペクトルをもたらした。 図2では、ヨーグルトオンラインバイオプロセス中に取得された平均スペクトルの一例が与えられている32 。すべてのスペクトルにおいて、250Thまでのm / z範囲の300以上の質量ピークが同定され得る32 ?...

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ディスカッション

飛行時間型（ToF）質量分析計に結合されたプロトン移動反応 - 質量分析（PTR-MS）は、揮発性有機化合物の同定および定量化の必要性と迅速な分析プロファイリングの必要性の間の有効な妥協点である。 ToF質量分析器を特徴付ける高質量分解能は、相当な情報コンテンツを伴う関連する感度および質量スペクトルを与える/提供する。さらに、PTR-ToF-MSをオートサンプラーと組み合わせ、オート?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work is supported by the European Commission's 7th Framework Programme under Grant Agreement Number 287382. SY is a beneficiary of a European Commission's 7th Framework Programme Grant Agreement Number 287382. IK is a beneficiary of a FIRST doctoral school grant from the Fondazione Edmund Mach. For his work at University of Foggia, VC is supported by the Apulian Region in the framework of 'Future In Research' program (practice code 9OJ4W81).

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PTR-TOF 8000 High-Resolution PTR-TOF-MSIonicon Analytik Ges.m.b.H.PTR-TOF 8000An detector for volatile organic compounds (VOCs) that allows for continuous VOC quantification with a very high mass resolution
GERSTEL MPS 2XLGerstelA multifunctional autosampler 
Gas Calibration UnitIonicon Analytik Ges.m.b.H.GCU-s / GCU-aA dynamic gas dilution system that provides variable but known quantities of different standard compounds in a carrier gas stream
TofDaqTofwerk AGfree available at http://soft.tofwerk.com/   A data acquisition software (for spectra  acquisition)
MATLAB MathWorkshttp://it.mathworks.com/products/matlab/A technical computing language and interactive environment for algorithm development, data visualization, and data analysis
RThe R Foundationfree available at https://cran.r-project.org/mirrors.html  A language and environment for statistical computing and graphics

参考文献

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