後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

要約

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

要約

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

概要

神経損傷では、近位および遠位の神経断端はしばしば病変部位^1-2に神経繊維束の直接の再編が防止されます。通常、軸索路は、接続の複雑なネットワークを形成する軸索の高度に秩序と整列束で構成されています。しかし、神経再生は不十分編成軸索整列^3-4による無秩序なプロセスです。したがって、損傷部位を埋める軸索再生の十分な数を生成するためには、よく組織軸索整列を誘導することが必要です。さらに、脱髄は、損傷部位でのミエリン形成細胞の死による神経損傷を伴います。脱髄が強く軸索の生存導電容量を損なうので、脱髄をターゲットまたは再ミエリン化を促進する治療は、神経損傷⁵後の機能回復のために重要です。したがって、このプロトコルの目的は、これらの2つの問題に対処する工学的手法を説明することです神経再生の。

材料の物理的又は機械的性質に、異なる軸に沿って測定したとき、差として定義される面の異方性は、セルの配置、増殖、および遊走^6-7に影響^を与えるために適用されています。地形に加えて、異方性を誘導する他の方法があります。以前、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）膜の機械的静的プレストレッチによって誘発される表面異方性を調べました。 「小変形超大規模に課さ」の理論は、細胞が延伸方向に感知有効剛性は、垂直方向と異なり、有効剛性の違いは、表面異方性⁸によるものであること。予想しました予備延伸PDMS膜上で培養した間葉系幹細胞（MSC）は、積極的に表面を引っ張ることにより、結果として異方性を感知する事前延伸方向⁹に整列することができます。同様に、異方性表面AR機械的な事前延伸表面からイジングすると、アライメントに影響を与えるだけでなく、後根神経節（DRG）の成長と髄鞘形成は^、10を軸索。ここでは、軸索再生^10を強化するために、静的な事前延伸PDMS基板上の表面異方性を誘導するためのプロトコルを提供します。

軸索アライメント、目的のパターンを持つ地形的特徴を引き出すために、整列した繊維およびチャネル^6,11-12を通じて接触ガイダンスを提供することが報告、軸索アライメント^11,13を容易にするために実証されました。しかしながら、そのような繊維、チャネルおよびパターニングなどの地形的特徴を介して軸索整列を誘導するための技術が報告され、長く及び軸索の厚さを増加させることができませんでした。これとは対照的に、ストレッチング緩やかな機械的ストレッチ¹⁴の大きさに伴って増加長く、太く軸索との延伸方向における軸索アライメントにつながりました。しかしながら、 インビボでの電力供給のモータ装置を搭載することはありません実現可能。対照的に、静的な事前延伸誘導異方性は、より複雑で、より容易にインビボ用途のための将来の足場の設計に組み込むことができます。

このプロトコルでは、静的な事前延伸細胞培養系は、トポロジー特徴なし表面異方性を誘導するために使用されます。膜は、フレームに固定され、所定の伸びの大きさは、延伸ステージに適用されるところの事前延伸培養系は、PDMS膜、伸縮フレーム延伸ステージで構成されています。最大21日間の事前延伸表面上で培養新たに単離したDRGニューロンは軸索のアライメントおよび厚さのために監視されています。続いて、シュワン細胞（SCS）整列軸索と共​​培養は、髄鞘形成のために監視されます。プレストレッチ誘発される表面異方性を組み込むことによって、私たちはそれぞれ、MSCおよびDRGニューロン^9-10のセルアライメント分化と軸索配向成長を促進することができました。

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プロトコル

細胞の単離のためのすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

前延伸異方性表面の調製

1. 塩基及び硬化剤の1液及び組織培養皿（直径12cm）中に混合物を注ぐ：10を混合します。 4900 mgのベースと合計架橋混合物のための490 mgの硬化剤を使用してください。
2. 気泡を除去するために20分間真空下でゲル混合物を保管してください。
3. 60℃で一晩硬化のためにオーブンでゲル混合物を置きます。
4. PDMS膜が硬化した後、165ミリトルで3分間及びO ₂の65 SCCMフローのプラズマ洗浄/エッチングシステムを使用して酸素プラズマを用いて表面を処理します。
5. 皿から長方形のメンブレン（5×3.5センチメートル）の一部をカットし、酸素処理されている側認識しながら、必ず酸素処理された面を上に、延伸フレームに固定されていることを確認。上のフレームを配置ステージをストレッチし、均等に、それは10％の伸び率に達するまでステージ上のノブを回してストレッチ（またはいくつかの他の予め定められたストレッチを、伸びが直接、延伸段階から読み取ることができます）長軸⁹に。フレームのネジを締めて、ストレッチを修正しました。
6. ステージからフレームを削除します。膜表面が乾燥し、ほこりのないことを確認し、その後、チャンバーの粘着面が膜に強固に取り付けることができるようにメンブレン上にシリコーン室を配置します。
   注：シリコーン室は、PDMS膜上の細胞培地を保持するための十分を提供します。装置の設計は、 図1に示されています。
7. 10分間UVで表面を滅菌します。
8. 追加1 mlのポリ-L-リジンプラズマ処理の6時間以内にチャンバー内PDMS表面に（PLL）（リン酸緩衝生理食塩水0.01％）、および37℃で2時間インキュベートDRGニューロンを播種する前に。これは、細胞接着を増強します。

DRGのル "> 2。アイソレーション

1. DRGニューロンのための標準的な増殖培地を準備します。
2. 分離前に、分離装置とフィルタ試薬をオートクレーブ。 6ウェルプレートの1ウェル中に分離緩衝液5mlを追加し、氷上にプレートを置きます。 0.05％トリプシン-EDTA（1mg / ml）の9ミリリットルにコラゲナーゼA（500 U / ml）を1ミリリットルを追加することにより、解離培地10mlを用意し、氷上で0.22μmフィルターと場所とのソリューションをフィルタリングします。
3. 単離のために7日間の齢のSprague-Dawleyラット - 10 5〜12を使用してください。 75％イソプロパノールで子犬をスプレーし、断頭により犠牲に。
4. 背中から脊髄を覆う皮膚を切り取ると、背骨の周りの余分な組織を除去します。上の外科手術用のスポットライトが付いている外科手術用ルーペの下では、首から最初の切開を行い、その後、ハサミで両側の背骨に沿ってカット。仔の身体から背骨を外し、過剰な筋肉を取り除きます。その後、経度に沿って切断するはさみを使用して脊椎および使用ピンセットのG軸は完全に脊椎を開いて滅菌15mlチューブに分離緩衝液でのDRGを転送するための大きな開口部を作成するために、ピペットから脊髄cord.Removeに先端を抽出します。
5. ピンセットの罰金ペアを使用して、骨のポケットから神経節を除去し、約10収集 - 両側から16 DRGを。神経根をトリムし、氷冷分離バッファに神経節を移します。
6. 滅菌15ミリリットルチューブに分離バッファでのDRGを転送するための大きな開口を作成するために、ピペットからヒントを削除します。化学解離した後、5分間900×gで4℃で遠心神経節を。
7. 組織は、チューブの底に沈殿し、そっと上に単離緩衝液を除去し、チューブに解離培地10mlを追加してみましょう。
8. 10分 - チューブごと5を振とうしながら1時間、37℃の水浴中で解離培地中で解剖した組織をインキュベートします。
9. 後の5分間900×gで4℃での化学的解離、遠心神経節。
10. 上清を除去し、10ミリリットルの標準的な成長培地、ボルテックスでペレットを再懸濁。
11. 再び2.9節に示されているように解離した細胞を遠心します。
12. 上清を除去し、標準的な増殖培地と渦の12ミリリットル中にペレットを再懸濁します。

前延伸表面上のDRGの3文化

1. 、細胞を播種チャンバーからPLLソリューションを除去し、滅菌水と空気乾燥でPDMS表面を洗浄する前に。
2. 2分の残骸がチューブの底に沈殿することを可能にするために - 細胞を再懸濁した後、1用のサスペンションセットができます。各ストレッチチャンバ内に細胞懸濁液1.5 mlを加え、5％CO ₂で37℃でインキュベートします。
3. 10μlの（または15μl）をフルオロ-2-デオキシウリジンおよびウリジン（FDU-U）の株式solutiの混合物を追加し、in vitroで 1日（DIV）で、グリア細胞を排除するために、各ウェルに（ 材料の表を参照してください）に。 7時間後、新鮮な標準的な増殖培地でこの培地を交換し、5％CO _2、37℃のインキュベーター中でプレ延伸培養装置を配置します。
4. 細胞培養期間中（2から3週間）、新鮮な培地で半分使用済み培地を交換し、2日毎に培地を変更します。注：2週間の延伸、未延伸面に培養した後、精製されたSCがチャンバに追加され、別の週（ステップ4.7）培養しました。

4.事前延伸表面上のDRGニューロンとシュワン細胞（SCS）の共培養

1. 博士カンパーナのグループ以前に¹⁵で説明したようにのSCを分離します。
   1. 簡単に言えば、1日齢の子犬からのSCを分離します。収集し、機械的に坐骨神経化学（トリプシンEDTAおよびコラゲナーゼA）の両方と（18ゲージの針/ 10ミリリットルの注射器^）15を解離。
   2. ポリ-D-リジン（PDL）の共同に解離細胞をシード5％CO ₂で37℃でT25フラスコと文化をated。 5日目に、抗なた1.1抗体及びウサギ補体を用いて抗体の選択を介して細胞を精製し、流路2に精製された細胞を継代培養 - ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を含む4.培養培地、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）、21 / mlのウシ下垂体は、（BPE）を抽出し、4μMフォルスコリン。
2. SCからの培養培地を除去し、そしてフラスコに5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 3分- 2、5％CO ₂にて37℃で細胞をインキュベートします。
3. 彼らはフラスコから持ち上げる場合には、培地の5ミリリットルを追加し、フラスコ内の細胞と混合見るために10倍の対物レンズを用いて光学顕微鏡下で細胞を確認してください。
4. 200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機に細胞懸濁液を追加し、20℃で5分間。
5. 上清を除去し、7ミリリットル標準DRG成長MEDにペレットを再懸濁IA。
6. 0.5 mlマイクロチューブに10μlの細胞懸濁液を取り、トリパンブルーを10μlと混合し、次いで10×対物レンズを用いて光学顕微鏡下で血球計数器を用いて細胞数をカウントします。 DRGの増殖培地を添加することによって1ml当たり5,000細胞の細胞懸濁液を希釈します。
7. 延伸室でDRG培養物から培地の0.5ミリリットルを削除し、DRG培養物にSC懸濁液0.5ミリリットルを追加します。
8. 文化DRGのための新たな標準的な増殖培地で半分使用済み培地を交換することにより、37℃で1週間の細胞および5％CO ₂を変更し、メディアごとに2日。 1週間共培養した後、免疫組織化学¹⁰で細胞を処理します。

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結果

予備延伸細胞培養系は、DRG軸索アラインメント^10を推進します。 DRGニューロンは、12日間プレ延伸、未延伸表面上で培養しました。軸索は、それらの位置合わせを実証するために、β-IIIチューブリンを染色した。 図2は、培養の12日後に前延伸、未延伸PDMS基板上の軸索の向きを比較します。彼らは、ランダムな配向を示し、未延伸PDMS基板上の相互?...

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ディスカッション

前延伸表面に軸索アライメントを誘導するために、2つの重要なステップがあります：1）PDMS膜は、均一な厚さのフラットでなければなりません。及び2）グリア細胞をDRGから削除する必要があります。 PDMSと架橋剤を混合し、オーブンで硬化させた後、架橋PDMSゲルは平らな作業台の上に保持し、任意の傾きを避けるために慎重に取り扱われるべきです。プラズマ処理後（細胞接着に必要な）表...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.