ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

要約

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

要約

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

概要

ガラスまたはビーズ表面に係留大きなDNA分子の可視化DNA基質^、1,2および高分子物理学上のDNAタンパク質相互作用、タンパク質の動力学を調査するために利用されてきた^。3,4-単一係留大型DNA分子のためのプラットフォームは、いくつかの異なるを有します他のDNA固定化方法に比べて利点が⁵まず、表面につなが大きいDNA分子は、その結合部位を認識するDNA結合タンパク質のための非常に重要であるせん断流れずに自然なランダムコイルコンフォメーションを有します。第二に、フローチャンバー内の一連の酵素反応のためのDNA分子の周りの化学的環境を変更することは非常に簡単です。第三に、マイクロ流体せん断流がDNA分子、このような表面固定化⁶及びナノチャネルの狭窄などの代替的なDNA伸長手法を用いて達成することは非常に困難である完全な輪郭の長さの100％にまで延伸を誘発する^。7 A完全stretcheDのDNA分子は、ゲノムマップ上の酵素の動きを監視するために有用であることができる位置情報を提供します。

それにもかかわらず、DNAテザリングアプローチは、YOYO-1のような挿入色素は、一般的に容易に蛍光励起光によって破壊される係留DNA分子を引き起こすという重大な欠点を有しています。一般的に、大規模なDNA分子は蛍光顕微鏡下で可視化のための蛍光色素で染色されなければなりません。これらの色素は、それらが二本鎖DNAにインターカレートしたときにのみ蛍光を発するので、この目的のために、YOYO-1または他のTOTO系色素が主に使用されている^。8しかし、ビス-インターカレート色素があるため、光誘導されるDNA光切断を引き起こすことがよく知られています蛍光体のインターカレーション^。9更に、表面につなが蛍光染色されたDNA分子は、剪断流れが自由にDNA分子の移動の力を壊す発揮することができるため、より脆弱です。したがって、我々は新たなDとFP-DBPを開発しました表面に係留大型DNA分子を画像化するためのNA-染色タンパク質色素。 FP-DBPを使用する利点は、それが結合するDNA分子の光開裂を起こさないことである。加えて^、10のビス-インターカレート色素は輪郭長さを増加しながら、FP-DBPは、DNAの輪郭の長さを増加させません約33％です。

このビデオ方式は、PEG-ビオチン表面に大きなDNA分子を係留するための実験的アプローチを紹介する。 図1は、平滑末端および付着末端を有するDNAを係留の異なるアプローチを示しています。したがって、この染色方法は、DNA分子の任意のタイプに適用することができる。 図2は、DNA分子を伸長するだけでなく、化学的および酵素をロードするためにせん断流を生成するために、シリンジポンプによって制御することができるフローチャンバアセンブリの概略図を示していますソリューション。 図3は、PEGylatにつなが完全に伸張したDNA分子の顕微鏡写真を示していますエド面¹¹とFP-DBPで染色しました。

プロトコル

1. DNAビオチン化

1. ターミナルトランスフェラーゼを使用して平滑末端DNAのビオチン化酵素（TdT）
   注：平滑末端DNAで使用T4 DNA（166 kbpの）を、。
   1. 2.5mmののCoCl _2、10×反応緩衝液5μl、10mMのビオチン-11-dUTPを0.5μlの、ターミナルトランスフェラーゼの0.5μlの（10単位）、およびT4 DNA0.5μlの（0.5μgの/μl）を5μLを追加反応混合物。水38.5μLを添加することによって50μlの最終容積にしてください。
   2. 1時間37℃で反応混合物をインキュベートします。
      注：延長反応時間、 すなわち 、二重係留DNAを得ることができ、ビオチンが両端にタグ付けされていることが可能です。
   3. 0.5 M EDTA、pHが8の5μLを加えて反応を停止します。
   4. 4℃でチューブを保管してください。
2. DNAリガーゼを用いて粘着性のエンドDNAのビオチン化
   注意：使用λDNA（48.5 kbpの）、粘着末端のDNAです。 <オール>
3. T4 DNAリガーゼを1μl、10×ライゲーションバッファー5μlの、25 ngの/μlのλファージDNAを1μlを追加し、50μlの最終容量を作るために水の43μlを添加します。
4. 4℃でチューブを保管してください。

2.官能の表面誘導体化

注： 図1に示すように、ガラス表面上のDNA分子の末端をつなぐためには、第1級アミン基をビオチンPEGコーティングに続いてカバースリップ上にシラン化され、このPEG化プロセスがあるため、単一分子DNAの画像化のために重要です。著しく表面上の望ましくない分子の結合によって作成されたランダムノイズを低減することができます。

1. ピラニアクリーニング
   注：ピラニア・ソリューションは、したがって、それは適切な安全ガイドラインに従って、取り扱いに注意する必要があり、有機物質と激しく反応します。
   1. 場所は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）ラックにカバースリップ、およびbはそれらを保持しますyのPTFE長手方向シールテープ、ラックの表面のエッジと半分に半分。ラッピングした後、洗浄手順の間にラックを処理するためのテープの長い一片（〜5センチ）のままにします。
   2. SO H ₂ O ₂の₄および150mlをヒュームフード内でピラニア溶液を作製するためにH ₂ 350 mlを1 Lのガラスビーカーを埋めます。 2時間ピラニア溶液中でラックを配置します。
   3. ビーカー内の水のpHになるまで脱イオン水で完全に空のビーカーからのピラニア溶液およびリンスカバースリップを中性に達します。 pH試験紙ストリップを使用してください。
   4. 30分間、水を含有するビーカーにカバースリップのラックを超音波処理。ビーカーからわずかアミノシラン化の前に空の水。ガラス基板をきれいにし、誘導体化するために超音波処理電力の75 Wを使用してください。
2. ガラス表面にAminosilanization
   1. N 2 mlを加え- [3-（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミン及び200mlまで氷酢酸10mlaminosilanization溶液を調製するための清浄なポリプロピレン容器中でメチルアルコール。
   2. ポリプロピレン容器中で洗浄カバースリップを置きます。 30分間100rpmで、室温でそれらを振ります。
   3. W.は、少なくとも30分間、100rpmで、室温でそれらを振る75で15分間、誘導体化されたカバースリップを入れたビーカーを超音波処理します。
   4. エチルアルコールで二回ビーカーからの溶液を空にし、メチルアルコールで一回、慎重にカバースリップをすすぎ、と。ストアエチルアルコール中のカバースリップとは、2週間以内にそれらを使用しています。
3. カバーガラスのPEG化
   1. 0.1 M炭酸水素ナトリウム（NaHCO _3）の10ミリリットルを加えます。 0.22μmのシリンジフィルターで溶液をフィルタリングします。
   2. ビオチンPEGスクシンイミジルカーボネート（ビオチン-PEG-SC）およびNaHCO ₃の350μlの中のPEGスクシンイミジル吉草酸80mgの（MPEG-SVG）の2ミリグラムを溶かします。光保護管を使用してください。
   3. 1激しくチューブをボルテックス0秒、および気泡を除去するために1分間10,000×gで、それを遠心します。
   4. エチルアルコールですすぎ、続いてアセトンでスライドガラスを、洗浄します。完全に空気乾燥にスライドを許可します。
   5. きれいなガラススライド上のPEG溶液の滴（50μl）を配置します。任意の気泡を発生させることなく、アミノシラン化カバースリップで軽く滴をカバーしています。
   6. 3時間のための場所のスライドは一晩暗所で、室温で湿潤チャンバーを十分に平らにします。底に水で、チャンバとして空のピペットチップホルダーを使用します。チューブ内の残留PEG溶液を密封し、4℃で保管してください。
   7. 脱イオン水で十分にペグ化されたカバースリップを洗い流します。使用するまで暗く乾燥した場所に保管してください。

3.フローチャンバーの組み立て

1. 図2のように、パンチアクリルホルダーを製作。チューブインサートの直径は0.762ミリメートルであることを確認し、一つの孔を指定すると、入口であり、他方はであり、アウトレット（ 図2）。
2. 任意のチャンネル穴を摂動ない、入口と出口の穴に垂直に整列させ、アクリルホルダー（ 図2）に両面粘着テープ片（幅5〜6ミリメートル）を配置します。チャンバーを作るために、マルチチャネル壁としてこれらのテープストリップを使用してください。ピペットチップを使用してテープをスクラブ。
3. フェイスダウンPEG化側で、フローチャンバーを作るために上にPEG化されたカバースリップを置きます。
4. 漏れる任意の溶液を防ぐために、両面テープが配置されている領域の上にカバーガラスの上部を押します。上部にある、ボトム（ 図2の黄色）でチャンバのエッジを閉じるには速乾エポキシ接着剤を追加します。
5. ガスタイトシリンジにチューブ（外径、OD、0.042 "）の短い断片（2.5センチ）を接続し、エポキシ接着剤で接合部をシールします。
6. 注射器にリンクされているチューブに、エポキシ接着剤で接合部をシールする：長いフレキシブルチューブ（0.03 "OD）を接続します。
7. TUBI塗りつぶしngのDI水で注射器にリンクされています。空気の泡がないことを確認してください。
8. エポキシ接着剤で封止しフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。
9. 貯水池などの他の穴に黄色の先端部（200μlの先端）を配置します。

フローチャンバー内に4.サンプルのロード

注：ニュートラアビジンは、ストレプトアビジンのような他のアビジンのタンパク質で置き換えることができます。それは言及されない限り、全ての反応は、室温で行うことができます。黄色の先端に試料液を取り、アクリルホルダーの穴（ 図2b）上に溶液で先端をインストールします。

1. 50μl/分でシリンジポンプの流量を設定します。負荷アビジンタンパク質の20μlの（T50溶液中の25μgの/ mlで、10mMトリス、50mMのNaClを、pHを8）は、10分間それを維持します。
2. 負荷ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド（1×TE中100μM）を20μl、10分間それを維持します。ターミナルトランスフェラーゼを使用する場合は、ロードをスキップオリゴデオキシヌクレオチドの。
3. 10μl/分の流速でフローチャンバーへのステップ1からの負荷のDNA溶液20μlを、30分間それを維持します。
4. 1×TEとフローチャンバーを洗浄し、FP-DBP ^10（〜80 nM）を40μlのをロードします。
5. 60X対物レンズに1×TEで染色する分子の連続的な流れと蛍光顕微鏡下でDNAを観察します。 FP（EGFP）-dbpの励起に488nmの固体レーザーを使用してください。 DNA分子の完全なストレッチのために、使用されるDNAの長さに応じて異なる流量を適用します。例えば、T4 DNAの166 kbpのためのλDNAの48.5 kbpの、そして100μl/分を50μl/分を適用します。
   1. アクリルホルダーのリサイクルのため、家庭用洗剤溶液¹²で組み立てフローチャンバーを浸します。かみそりの刃でテープとエポキシを削除し、それらを完全にオフに取るために手でこすります。注射針で穴を邪魔を除きます。さらに使用するまで脱イオン水にホルダーを保管してください。

結果

図1は、DNA分子の末端構造に応じて2つの異なるDNAテザリング方法を示している。 図1aは、スティッキーエンドのDNA分子は、アビジン被覆PEG表面上に固定化された補完的なビオチン化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている様子を示す。 図1bは、の追加を示していますビオチン化のddNTPまたはターミナルトランスフェラー?...

ディスカッション

ここでは、表面上に固定するためにビオチン化長いDNA分子を可視化するためのプラットフォームを提示します。私たちは、ビオチン化ウシ血清アルブミンとアビジンタンパク質コーティングされた表面上の係留DNA分子のためのアプローチを報告している^。6以前のアプローチでは、我々は上の係留DNA分子を染色ビス-インターカレーション染料によって引き起こされるDNAの光開裂の重要...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulfuric acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99% Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9% Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99% Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.