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要約

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

要約

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

概要

現在のベンチトップ細胞分離手法（ 例えば 、蛍光活性化細胞は1ソート、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション2、免疫磁気ビーズ分離1）が準備し、ソートの数時間かかることがあります。これらの大きな時間スケールは、生理学的応答3の代表ではない分析の結果、生理学的応答および発現レベルに影響を与えることができます。システムは、迅速かつ効率的な生物医学的用途のための細胞の単離及び濃縮を改善するために、細胞表面受容体レベルを中断することなく、特定の細胞型を分離することができる必要とされています。したがって、我々のアプローチの理論的根拠は、細胞単離のための穏やかなアプローチを開発することです。

「ラボオンチップ」概念が速く（時間・ツー・分）細胞単離を桁違いの約束を提供し、最も頻繁に表面上に細胞を捕捉し、細胞や細胞内のコンテを解放することを含みます4,5物理的または化学的方法6を通じてNTS。これらのアプローチは、このようなRNA発現9-11、あるいはin vitro培養12,13のための細胞を提供する識別、タンパク質7,8式を識別するなど、いくつかの利点を提供していますが、これらの技術の多くは、このような原因で細胞受容体プロファイリングなどの診断に翻 ​​訳することはできませんそれらの非生理的な環境です。このようなコラゲナーゼなどの酵素リフティング剤もこれらのリフティングエージェントが正確な生理学的データを生成しません使用する細胞受容体の定量化技術を意味し、これらの受容体の量14,15に影響を与えることができます。細胞溶解は、天然の表面受容体との間の差別化を防止し、あらかじめ16を内在したもの。このプロトコルは、細胞単離のための高速かつ穏やかなアプローチを説明しています。

プロトコル

1.ガラスの表面を洗浄および試薬の準備

  1. それをきれいにするために、50％のパワーで5分間酸素プラズマ機でガラス表面を置きます。
  2. コニカルチューブにAPTESを50μlとエタノールの2.45ミリリットルを追加することにより、再構成された2.5ミリリットルの2％（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）溶液を調製します。

2. APTESとDSB機能化

  1. 表面にAPTESソリューションを追加します。 8ウェルプレートウェル当たりピペットを150μl。 24ウェルプレート用のウェルあたり100μLを加えます。 60×15ミリメートルのガラス皿のための1.1ミリリットルをピペット。蒸発およびAPTES液の偏在を防止するために、表面を覆います。 APTES層の均一な分布を作成し、室温で50分間、プラットフォームシェーカー上で表面を置きます。
    注：APTES表面の第1の層を形成するアミノシランです。異なる表面を使用する場合、ヒューリスティック表面を覆うために必要な溶液の量を決定します。
  2. 8ウェルプレートおよび24ウェルプレートのために2時間55℃に加熱する：表面がシェーカー上でありながら、オーブンの温度を選択します。 1時間90℃に加熱ガラスのみ皿。
  3. エタノールで表面を洗浄します。
    1. 使用される表面に基づいて参照することにより、必要なエタノールの量を管理します。 8ウェルプレート各ウェルに150μlのエタノールを追加します。 24ウェルプレート各ウェルに125μlのエタノールを追加します。ガラス皿のために1.1ミリリットルのエタノールを追加します。
    2. このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。エタノールを使用して二回以上すすいでください。
      注：ガラスボトムウェルプレートのいずれかが、その中に任意のプラスチックを持っている場合は、プラスチックが溶融してワープするために開始されますように、65℃以上、それらを加熱することはありません。
  4. タンクから供給100％窒素ガスで乾燥しました。 Oで表面を配置ヴェン。
  5. 2462.5にジメチルスルホキシド（DMSO）の37.5μlの1.5 mg / mlでDSBを組み合わせることにより、D-デスチオビオチン（DSB）溶液2.5ミリリットルを準備、および5mg / mlの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC） 0.1 M 4モルホリノエタンスルホン酸水和物（MES）（pHが6）バッファμlの。その後、両方のソリューションを組み合わせます。
  6. DSBとEDCとの反応をクエンチするために溶液中に、15分後、2-βメルカプトエタノールの1μLを加えます。オーブンからガラス表面を官能基化ホットAPTESを削除します。冷却するためにガラス表面のために5〜10分待ちます。
  7. MESは、表面に基づいた量を用いて、リンスする表面をバッファ加えます。 MESは、8ウェルプレート各ウェルにバッファー150μlを添加します。 MESは、24ウェルプレート各ウェルにバッファー125μlを添加します。ガラス皿のために1.1ミリリットルのMES緩衝液を追加します。
  8. このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接指摘されていないので、約70°の角度ピペットを保持します表面に。 MES緩衝液で2回以上すすいでください。
  9. それらをインキュベートすることを可能にするために表面にDSBソリューションを適用します。 8ウェルプレートウェル当たり150μlのDSBのソリューションを追加します。 24ウェルプレートのために、ウェルあたり100μlのDSBのソリューションを追加します。ガラス皿DSBソリューションの1.1ミリリットルを追加します。
  10. DSBは、ペトリ皿の内側に湿らせたペーパータオルでガラス表面を覆われて置きます。覆い、18-24時間、4℃の冷蔵庫でインキュベートします。

3.ストレプトアビジン官能

  1. 1.0×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1ミリリットルで、各ガラス表面を3回洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。 0.4 mg / mlで（推奨）へのストレプトアビジン（SAV）ストック溶液を希釈します。
    注：これは希釈およびリンスのための媒体として使用することができるように、PBSに等張性です。 PBSは、SAのための溶媒として使用されますV、およびそのため、表面に結合するSAVの能力には影響しません。
  2. ガラスの下部にあるフォームの薄い層は、表面に基づく溶液の量を選択するように、表面に均等にSAV液の0.4 mg / mlとを適用します。 8ウェルプレートについては、ウェル当たり150μlの0.4 mg / mlでSAVのソリューションを追加します。 24ウェルプレートの場合は、ウェル当たり100μlの0.4 mg / mlでSAVのソリューションを追加します。ガラス皿のために、1.1ミリリットル0.4 mg / mlでSAVのソリューションを追加します。
  3. 覆い、水分を保持するために14センチメートルペトリ皿にプレートを移動します。 18-24時間冷蔵庫でペトリ皿をインキュベートします。
    注：これは、各表面上にAPTES、DSB、およびSAVの一貫性のあるボリュームを利用することが不可欠です。
  4. SAVを除去するために、PBS150μlで各ガラス表面を3回洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。
  5. ペーパータオルワットをぬらしi番目の脱イオン水、ウェル中の水分を保持するためにプレートを囲む14センチメートルペトリ皿にペーパータオルを平らに置きます。井戸を含むペトリ皿をカバーしています。必要になるまで4℃バイオセーフティレベル1（BSL-1）冷蔵庫でペトリ皿をインキュベートします。

4.細胞捕捉およびリリース

  1. 実験のために意図された細胞のT175フラスコ（複数可）から開始します。フラスコ（複数可）からメディアを吸引除去します。室温PBS 5mlで残りのメディアを洗浄します。フラスコ（複数可）から吸引し、PBS。
  2. 細胞のT-175フラスコに、このような細胞解離ソリューションなどの非酵素的なリフティング剤の10ミリリットルを追加します。フラスコから細胞を持ち上げを可能にするために、6分間インキュベーターにフラスコを置きます。
  3. リフティング剤を不活性化するために、6分後、冷たいハンクス液（材料の一覧を参照してくださいHBSS）の10ミリリットルを追加します。血球計を使用して溶液中の細胞の数をカウントするために、細胞を20μlを取り出します。
    注：FUNCに応じて、捕獲実験に用いた表面をtionalized、必要な細胞の数が変化します。官能基化8ウェルプレートの場合は、十分に300,000細胞を使用しています。官能基化ガラス皿のために、110万セルを使用。官能化24ウェルプレートの場合は、125,000細胞が推奨されています。細胞計数の詳細については、サプリメントに含まれています。
  4. 手順を繰り返して、4.1- 4.3細胞の別のフラスコのために、少数の細胞は、実験のために必要以上に存在している場合。溶液中の細胞の総数を取得するために、細胞懸濁液と再集計のセルを結合します。
  5. 濃縮された細胞のペレットを得るために、4℃で5分間、500×gで遠心分離して細胞懸濁液をスピンダウン。その後、スピンダウンした細胞からの上清を吸引し、算出されたボリュームを追加、1mlあたり1×10 6細胞の濃度を得るために、細胞懸濁液に追加するHBSSの適切な量を見つけます。このボリュームは、追補の式を用いて計算することができます。
  6. 目を再懸濁するために上下にピペット（粉薬）抗体結合を減少させることができる電子細胞溶液中および溶液中の細胞凝集を減少させます。別々の制御と実験ソリューションにセルラーソリューションを分割します。コンポーネントと計算のための補足ファイルを表示します。
  7. 補足ファイルに記載されているそれぞれの細胞溶液にビオチン化抗体を追加します。転倒ミキサーで4℃で30分間インキュベートします。
    注：MCF7GFP細胞については、0.5 mg / mlでのhIgGまたは0.5 mg / mlでHLA-ABC抗体を推奨します。 RAWマクロファージについては、1mg / mlのmCD11b希釈の違いを考慮して半分の容量で推奨されています。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）については、0.5 mg / mlでhCD31をお勧めします。
  8. HBSSで官能ガラス表面を洗浄します。この実験では、8ウェルプレートをお勧めします。
    1. 8ウェルプレート各ウェルに150μlのHBSSを追加します。 HBSSを用いて二回以上すすいでください。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。 4℃で冷間保管してください。
  9. ウェルに細胞のソリューションを追加し、シェーカー上で、氷上でインキュベートした細胞のために45分を待ちます。補足で説明したように計算されたボリュームを使用することによって、滅菌HBSS中のビオチンの溶液を作ります。
  10. HBSSを用いてガラスウェルから細胞溶液を除去します。
    1. 静か各ウェルに150μlのHBSSをピペット。その後、HBSSをピペット。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。
    2. さらに2回繰り返します。洗浄後、湿潤細胞を維持するためにウェルにHBSSを追加します。
  11. 各ウェルのそれぞれのリリースに20mMのビオチン溶液を150μlのを追加し、反応を可能にするために20分を待ちます。
  12. 非特異的に結合した細胞を思い出し前述した、その後、蛍光標識された細胞を用いた場合、蛍光画像に細胞を進むにつれて、HBSSで洗浄することによって秒。また、フラスコ内の画像、生細胞（対照としては、ウェル中の細胞と比較します）。緑色蛍光タンパク質（GFP）トランスフェクトされた細胞を使用する場合、励起は470nmでなり、そして発光は515nmです。

5.抗体の最適化：抗体滴定

  1. ステップ4.1- 4.3で説明したようにT75またはT175フラスコから細胞を持ち上げることから始めます。
    注：これらのボリュームは、24ウェルプレートのために校正されていますが、ヒューリスティックなテストを通じて任意のガラス官能表面に合わせて変更することができます。代表的な抗体の滴定は、図1に示されています。
  2. 血球計を用いて細胞をカウントし、その後4℃で5分間、500×gでコニカルチューブに細胞溶液をスピンダウン。補足で説明した計算を使用して、1ml当たり100万個の細胞に細胞を再構成します。
  3. 1メートルを分割します抗体（Ab）ソリューションのための別の遠心管中で500μlの6つの異なるソリューションへml溶液あたりillion細胞。
    1. 10μg/ mlの、1 / mlの、100 ng / mlで、10 ng / mlで、1 ngの/ mlまでの抗体原液を希釈します。染色バッファー（PBS + 1％アジ化ナトリウム+ 1％BSA）を100μl、及びその中に無いのAbと制御のための細胞の500μlのを使用してコントロールを作成します。ブランクコントロール（無抗体と細胞なし）の場合は、300μlのPBSの溶液を使用してください。
      注記：注意：アジ化ナトリウムは、非常に、毒性、爆発性であり、それを使用する際に細心の注意を払わなければなりません。材料安全データシート（MSDS）を参照し、適切な安全装置を使用してください。
  4. 合わせて、4℃で30分間転倒ミキサーでセルソリューションとアブソリューションをインキュベートします。 HBSSで3回官能24ウェルプレートをすすぎます。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。パイを保持pette先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度。
  5. 適切なAPTESに小分けし、各サンプル溶液の125μLを、DSB、およびSAVがよく、官能。ガラス表面上で45分間、4℃又は氷上でインキュベートします。非特異的に付着した細胞を除去するために、HBSSで3回表面を洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。それらはコントロールであるように、一番下の行を洗わないでください。
  6. 、よく洗浄し、それぞれにHBSSの150μl加え、氷上で24ウェルプレートに入れ、その後、GFP細胞（励起485 nmの/発光528 nm）での蛍光を測定するために、プレートリーダーを使用します。

6.セルの最適化：細胞滴定

  1. 手順4.1 -4.3で述べたように、細胞を持ち上げます。
  2. 血球計を用いて細胞を数えます。そう、細胞をスピンダウン4℃で5分間、500×gで円錐管でリューション。 1mlあたり100万個の細胞に細胞を再構成します。
    注：血球計の使用の詳細については、サプリメントで見つけることができます。
  3. ピペットの円錐管で160万個の細胞株と場所のための細胞溶液から1.6ミリリットル。円錐管で80万細胞株と場所のための細胞溶液からの細胞のピペットで800μlの。円錐管80,000細胞株と場所のための細胞株からのピペットを80μl。ピペットの円錐管で8000細胞株および場所のための細胞株から8μlの。
    注：濃度は、必要に応じて複製し、8ウェルプレートの測定ごとに与えられています。プレート出力の例が図2に示されています。
  4. 4ストック溶液を取り、4℃で5分間、500×gで遠心機でスピン。 HBSS400μlの中のすべてのストック溶液を再懸濁します。
  5. 0.8μ、160万細胞ストックに100ng / mlの抗体の1.6μLを追加80万細胞ストックにリットル、および他のすべての株式を0.5μlの。 4℃で30分間転倒ミキサーで30分間抗体をインキュベートします。 HBSSで3回、官能化ガラス表面を洗浄します。
    注：官能化24ウェルプレートをプレートリーダーの定量化のために推奨されている間に官能8ウェルプレートは、顕微鏡定量化のために推奨されます。 8000細胞株のための抗体濃度は、溶液中の抗体の欠如ではなく、表面の捕捉特性ではないに捕獲表面の制限要因を可能にするために減少しませんでした。
  6. 各ウェルに試料溶液を150μlを適用します。左の井戸の最初の列に160万細胞ストックを適用します。左から2番目の列に80万細胞ストックを適用します。左から3列目80,000細胞ストックを適用します。最後に、最後の列に8000細胞ストックを適用します。シェーカー上で4℃で45分間インキュベートします。
    注：160万細胞ストックは、試験すべき最高濃度となっており、二重、それは典型的な細胞濃度であるとして80万細胞株は、実験のための対照として役立つ細胞分離実験（よく60万細胞）で一般的に使用される細胞の量でありますそれは、細胞分離実験（ウェル当たり300万細胞）において使用されます。 8万細胞ストックは、細胞の捕獲のためのより低い濃度（ウェル当たり30,000細胞）をテストするための10倍希釈として機能します。 8000細胞株は、細胞の分離（ウェル当たり3000細胞）の下限を確認するためのテストとして使用するために百倍希釈として機能します。
  7. HBSSで3回洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。すべての洗浄液を収集します。
  8. 画像は、蛍光顕微鏡で細胞を、8ウェルプレートを使用する場合、SURそれぞれの写真を撮ります顔、そしてシェーカー上で4℃で1時間各表面に150μlのビオチンを適用します。 1時間後、前のようにHBSSで3回ビオチン放出ウェルをすすぎます。血球計数器と画像でリリース井戸をカウントするための井戸からすべての洗浄を収集します。
  9. 24ウェルプレートを使用した場合、1時間ビオチンリリース適切なウェルに、その後、HBSSでそれらのウェルを3回洗浄するために20mMの過剰ビオチン溶液を150μlを適用します。プレートリーダーを用いて24ウェルプレートを定量します。すべてが順調に集めた洗浄液から細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。

7.画像解析

注：フィジー・ソフトウェア・パッケージは（http://fiji.sc/Fiji）画像解析のために推奨されます。最初に、画像はグレースケール画像に変換した後、明るさ/コントラストは、細胞を引き出すために変更されました。

  1. 「タイプ」にスクロールダウンしてからクリックし、次に画像]タブをクリックして画像をロードし、グレースケールに変換します4; 8ビット」。
  2. イメージ]タブをクリックし、「調整」するためにスクロールすることにより、画像のコントラストを高めます。 「明るさとコントラスト」をクリックして、細胞が目立つようにスクロールバーを使用します。蛍光画像を使用する場合、細胞はより明確にするために画像を反転させます。
  3. ImageJの上にプラグインをロードすると、画像を分析するためにITCN（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html）と呼ばれます。
  4. ITCNを開きます。ダイアログボックスがそれは、セルの大きさを推定するためにいくつかのパラメータをユーザーに促す表示されたら、最初に目的の細胞の最小幅を設定します。画像が蛍光であり、細胞が暗くている場合は、「検出ダーク・ピークス」オプションをクリックします。
  5. 当初は2でしきい値を設定し、「カウント」ボタンを押してください。絵の新た数えバージョンは、細胞がカウントされた場合に描く赤いドットで表示されます。
  6. definiすることにより、より正確な携帯電話のデータを取得するために、しきい値と幅のパラメータを調整します「セル」のサイズをngの。注：計数した細胞の数は、右のダイアログボックスになります。パラメータの変更は、計数した細胞の異なる数を与えます。
  7. 良好な推定値は、セルの数のために到達するまでのしきい値と幅のパラメータを反復処理を続行します。

結果

このプロトコルを使用して、我々は、細胞捕捉（ 図3A）とMCF7GFP細胞ならびに生細胞対照（ 図4）の細胞の放出（ 図3C）を示しています。 60％と80％が放出されたとして、我々は（ 図3C）細胞捕獲を定量化しました。私たちは、RAW 264.7マクロファージおよびMCF7GFP細胞の混合物にこのアプローチを拡張すると、RAWマクロ?...

ディスカッション

細胞分離技術の改善は、血管生物学19で細胞の再生生物学でのプログラミング、および血管新生シグナル伝達幹、神経科学18における構造と機能の関係に科学的研究をfurthers。実際、初代細胞培養物20（ 例えば 、HUVECを）血管生物学のは、主として細胞分離技術を使用して行われます。細胞の単離は、最近細胞膜受容体3,14,15,19,21の定量的な流れ（qFlow）?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We would like to thank the American Cancer Society, Illinois Division (282802) and the National Science Foundation CBET (1512598) for funding support. We also would like to thank Dr. Dianwen Zhang from the University of Illinois Beckman Institute for microscopy training. Finally, we would like to thank Jared Weddell, Stacie Chen, and Spencer Mamer for insightful discussions.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)Acros Organics919-30-2Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner PicoDienerModel 1Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slideBD FalconCase of 24: 354118
Case of 96: 354108		Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well platesMatTekP24G-0-13-FUsed in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
MercaptoethanolScience Lab60-24-2Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision OvenThermo Scientific11-475-153Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass DishFisher Scientific08748AUsed in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with CoverSigma-AldrichZ717231Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cellsCell BiolabsAKR211Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophagesATCCTIB-71Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLELife Technologies12605036Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle mediumCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC50003PCSupplier: Corning
Nonessential amino acidsCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC25-025-CIAlready added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraperFisher Scientific12-565-58Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation SolutionCorningMT-25-056CIUsed to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
HemacytometerHausser02-671-54Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
BiotinAmresco58-85-5Used to release cells from surface.
HBSSCreated from RecipeN/AUsed to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC AntibodyBioLegend311402Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG AntibodyBioLegendHP6017Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cellsCell BiolabsAKR-211Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted ConicalsThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)Fisher Scientific05-450-127Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columnsThermo-ScientificPI-87770Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- ScientificUsed to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate ReaderBioTekSynergy HTX Multimode ReaderUsed to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

参考文献

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