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要約

ここでは、ケラチノサイト上のストレプトリシンS、A群連鎖球菌によって産生される分泌毒素の効果を研究するために透過性膜挿入に基づく感染系を用いる方法が、記載されています。このシステムは、容易に感染の間の種々の宿主細胞型の他の分泌された細菌タンパク質の研究に適用することができます。

要約

多くの細菌性病原体は、宿主細胞内シグナル伝達の変更を開始するため、または感染の過程、免疫系の応答を操作するために、宿主組織の破壊を補助するために強力な毒素を分泌します。メソッドが正常に精製するために開発され、これらの重要な病原性因子の多くを生産してきたが、まだその独特な構造や大規模な翻訳後修飾を精製し、in vitro系で勉強するためにそれらを困難にする多くの細菌毒素があります。また、純粋な毒素を得ることができる場合であっても、関連する生理学的条件下で毒素の特異的効果を研究に関連した多くの課題があります。宿主細胞の分泌された細菌毒素の効果を評価するために設計されたインビトロ細胞培養モデルにおける大部分は、毒素の一回投与で宿主細胞をインキュベートすることを含みます。このような方法は、不十分な毒素が継続することにより製造される感染の間、実際にどのような宿主細胞経験を概算します細菌細胞および感染の過程で徐々に蓄積することができました。このプロトコルは、ヒト上皮ケラチノサイト上のストレプトリシンS、A群連鎖球菌によって産生される強力な毒素の効果を研究するための透過膜インサートベースの細菌感染システムの設計について説明します。このシステムは、より密接に、純粋な毒素や細菌上清を直接宿主細胞に適用される方法よりも感染の間の自然な生理的環境を模倣します。重要なことに、この方法は、細菌と宿主細胞との直接接触に起因する宿主応答の偏りを排除します。このシステムは、効果的に、宿主膜完全性、細胞の生存率、および細胞シグナル応答のストレプトリシンS（SLS）の効果を評価するために利用されています。この技術は、容易に分泌された細菌の因子Dの特定の役割を調べるために、哺乳動物の宿主細胞型の様々な他の分泌毒性因子の研究に適用することができます感染の経過をuring。

概要

宿主細胞の感染の文脈における細菌毒性因子の機能を理解することは、細菌の病原性の研究の主要な焦点です。 10 -多くの細菌性病原体は、積極的に、宿主細胞中でのシグナル伝達の変更を開始するため、または感染1の過程、免疫系の応答を操作するために、宿主組織の破壊を補助するために毒素および他の可溶性因子を分泌します。メソッドが正常に精製するために開発され、研究のためにこれらの重要な病原性因子の多くを生産してきたが、いくつかの細菌産物は、in vitroの系を用いて分離して研究することができない、したがって精製方法のためにそれら手に負えない候補を作成し、ユニークな構造や大規模な翻訳後修飾を有します。例えば、A群レンサ球菌咽頭炎からの壊死性筋膜炎および毒性ショック症候群に至るまでの感染症の無数の責任細菌の病原体は、分泌生産します17 -ストレプトリシンS（SLS）11として知られている細菌毒素。このリボソーム生成されたペプチドは、ストレプトリシンS関連遺伝子（ サグ ）クラスタによってコードされ、成熟した製品は、サイズ14で2.7 kDaであると推定される- 17。 17 - 佐賀によってコードされたプロトキシンは、成熟した、機能的なフォーム15を生成するためにいくつかの酵素（SagB、SAGC、およびSAGD）によって翻訳後修飾されています。毒素の異常アミノ酸配列と結合されたこれらの翻訳後修飾の複雑さは、日付15,17に試みられてきたすべての精製および構造解明の努力と互換性のない毒素をレンダリングしています。これらの課題は、ホスト病因におけるこの毒素の特定の役割を決定するための努力を複雑にしています。

精製された毒素または他の分泌因子の調製が可能な複雑かのいずれかである場合、にメカニズムでこれらの製品の機能を解明する伝統的に、次にセル18のホストに適用されるフィルタリング細菌上清の準備を通じて研究されてきた- 20。この技術に関連するいくつかの課題があります。まず、SLSを含むこれらの分泌因子の多くは、格納された最大または一貫性の活性を維持し、後で宿主細胞に適用されません。上清を単一の時点で収集した後、宿主細胞に適用した場合に加えて、生理的関連性を決定し、分泌された因子は、の感染の経過中に蓄積することが許可されている天然の感染プロセス、について直接的な結論を引き出すことが困難です生理学的に関連する濃度。 3,8 -この第二の課題は、細菌上清の使用にだけでなく、宿主細胞の研究1で精製された毒素の使用に限らず適用されます。これらの問題、透過膜のinseに対処するために、RTベースの感染システムは、最適な毒素活性を維持し、また、細菌および宿主細胞との直接接触の変数を排除するように宿主細胞のSLSの効果を評価するために開発されました。このシステムでは、ヒト上皮細胞をウェル2チャンバーの下部チャンバーに、単層で増殖させ、細菌を、同じウェルの上部チャンバーに導入されます。多孔性膜（0.4μmの孔）が分泌された因子は、二つの室の間で交換されることを可能にするが、細菌の通過を防止し、上部および下部チャンバを分離します。このシステムは、A群連鎖球菌感染の間の直接接触を介して発生する可能性のある応答を排除しながら、単に持続分泌細菌成分に起因する宿主応答の効果的な評価を可能にしました。 SLS以外の他の分泌細菌の要因も多孔質膜を通過することができますが、野生型（WT）を含む同質遺伝子変異体パネルの使用、SLS-KNockout（ΔsagA） 佐賀補完株（ΔsagA+佐賀）が厳密にSLS依存21ある宿主応答を正確に評価することができます。

類似した透過性膜挿入システムは、ウイルス感染に関与する分泌因子の研究、癌生物学、および免疫細胞移動22のために使用されてきたが- 26、宿主細胞との細菌の相互作用を含む、いくつかの研究は、このアプローチ6,27,28を利用しています。細菌と宿主細胞間の相互作用を調査するために、このようなシステムを採用しているにも研究は、主に透過膜インサート上にプレート上皮または内皮単層を通って炎症細胞や細菌の移行に焦点を当てています。本明細書に記載の透過性膜挿入に基づく感染システムがEFFEを評価するために、多孔質膜を介して細菌宿主細胞の分離に依存する単純かつ効果的な方法でありますホスト膜の完全性、細胞生存率、細胞シグナル伝達、および分泌された宿主細胞因子に分泌された毒素、SLSのCTS、。この技術は、感染の過程で特定の細菌因子の役割を調査するために、哺乳動物の宿主細胞型の種々の他の分泌毒性因子の研究に適合させることができます。

プロトコル

1.細菌培養

  1. 興味21の具体的な分泌因子の研究のために使用される同質遺伝子変異株を生成します。
    注：含まれ、これらの実験のために利用GASM1T1 5448株 WT GAS」、（Δ 佐賀などのテキストに略す） 佐賀 Δ 猫 SLS欠損変異体、 佐賀補完株（Δ 佐賀+佐賀などのテキストに略記する）21。
  2. 関心の細菌株の一晩液体培養物を準備します。ヒト細胞に感染する前に16-20時間、37℃でガスM1T1にトッドヒューイットブロス-10ミリリットルで5448株を成長させます。
  3. 遠心分離で一晩細菌培養物（10分間2400 RCF）と新鮮な細菌培地中に再懸濁。
    注：同じボリュームで再懸濁し、一晩培養物を（5〜10 ml）に増殖させたとして、一般的に望ましい初期光学密度を生産します。
  4. への細菌培養物を正規化600 nmの（OD 600）での同一の光学密度は、試験される全ての株に対して得られるまで、追加の細菌培地中で再懸濁した培養液を希釈することにより、同等の開始濃度（約1.0のOD 600は便宜のために推奨されます）。
    注：これらの研究では、静止期の細菌培養物を直ちに正規以下の宿主細胞に感染するために使用しました。しかし、細菌出口静止期のいくつかの株としてnonsynchronouslyは、これは、目的の株の場合であることが見出された場合、対数期培養物を用いて宿主の感染を開始することがより適切であり得ます。
  5. さらなる分析の前に、感染多重度（MOI）、または宿主細胞当たりの細菌の割合を決定することができるように、出発培養物中ミリリットル本当たりのコロニー形成単位（CFU）を決定するためのアッセイをカウントコロニーを行います。
    1. 1ミリリットルに所望の光学高密度化に正規化された細菌培養物の連続希釈液を準備TYリン酸緩衝生理食塩水（PBS）または適切な細菌増殖培地（トッド - ヒューイットブロスをこれらの研究において使用しました）。可算コロニー（30から300コロニー）と寒天プレートの少なくとも1セットを生成するために10 -1〜10 -6までの範囲の希釈液を調製します。三連ですべての希釈を実行します。
    2. 分析されている細菌種のための適切な培地を含む寒天プレート上に各シリアル希釈液100μlを移します。
      注：トッド・ヒューイット寒天培地は、これらの研究に使用しました。
    3. 均等に寒天プレートの表面全体に100μlのアリコートを配布し、液体は寒天の中に吸収されるまで広がり続けるにはガラスやプラスチック細菌スプレッダーを使用してください。滅菌技術を使用して炎の下で実行します。
    4. 一晩または可算コロニーが現れるまで37℃で寒天プレートをインキュベートします。
    5. 各プレート上で増殖するコロニーをカウントし、次のformuによって元の培養におけるCFU / mlに計算しますラ：コロニー数ミリリットル中にプレート連続希釈/培養液量のX逆。
      例えば （200コロニーのx 1/10 -5希釈）/ = 2.0×10 8 CFU / mlのメッキ0.1ミリリットル

2.宿主細胞培養物

  1. 目的の分析のための適切な宿主細胞株を取得します。
    注：HaCaT細胞ヒト上皮ケラチノサイト29、V. Nizetからの親切な贈り物は、これらの研究のために使用しました。
    1. 10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で100mMの培養皿でHaCaT細胞を維持します。 5％CO 2で37℃でインキュベートします。

透過膜を挿入し、システム3.宿主細胞感染

  1. 彼らは90％の密集度に到達するまで、適切な組織培養皿でプレート細胞とは、彼らが成長することができます。
    注：これらの研究で使用したHaCaT細胞は、典型的には、2-3 D内の密集度に達しますメッキ後のAYS。
    1. 溶解物収集のために（ 例えば 、分析およびアデノシン三リン酸（ATP）決意アッセイシグナル伝達）、/ウェル約3×10 5細胞の播種密度で6ウェルディッシュにHaCaT細胞をプレート。
    2. /ウェル約3×10 5細胞の播種密度で6ウェルディッシュ内の滅菌ガラスカバースリップ上の免疫蛍光イメージング実験、プレート細胞について。
    3. エチジウムホモダイマー膜透過および乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイのために、/だけでなく、約5×10 4細胞の播種密度で24ウェル皿にHaCaT細胞をプレート。
  2. 治療の直前に、1×滅菌PBSで細胞を洗浄。
  3. 細胞に新鮮な増殖培地を適用します。ここに記載された条件について、6ウェルプレートまたは24ウェルプレートウェル当たり0.5ミリリットル媒体用ウェル当たり2ミリリットル培地を適用します。薬理学的治療が試験されている場合は、新鮮な培地と混合し、このSTEの間に適用されますP。
    注：一部のアッセイは、代替メディアが必要な場合があります。例えば、フェノールレッド、高血清濃度は、LDH放出アッセイを妨害し、1％ウシ血清アルブミン（BSA）（V / W）、2mMのL-グルタミン、および1mMピルビン酸ナトリウムを補充したフェノールレッドを含まないDMEMでしたこれらの実験のために利用。
  4. 新鮮な培地を適用した後、慎重に各ウェル中の滅菌0.4μmの透過膜インサートを配置します。層流フードで、このステップを実行し、各ウェルに透過膜インサートを転送するために滅菌ピンセットを使用しています。
  5. 製造業者の説明書に従って、各ウェルの上部チャンバーに新鮮な細胞培養培地を適用します。ここに記載された条件について、6ウェルプレートまたは24ウェルプレートウェル当たり0.1ミリリットル媒体用ウェルあたり1ミリリットル培地を適用します。
  6. 透過膜インサートシステムの上部チャンバーに（セクション1を参照）は、正規化された細菌培養物の適切な量を適用します。感染していないCONTRのための細菌培地を使用しますオールトリートメント。ここで説明する結果を得るために、24ウェルプレート用室あたりの正規化された文化の25μlのを追加し、6ウェルプレート用室あたりの培養液100μlを追加します。
    注：これらの研究では、野生型または変異GASは宿主細胞に適用されました 10 MOIのMOIは、最終的な真核生物の細胞数に基づいて算出された時に（ 例えば、2×10 6細胞/ウェル）を10倍の細菌が感染期間の開始（ 例えば、2 xで宿主細胞毎に添加されたように、ウェル当たり10 7 CFU）。適切なMOIは、異なる細菌種とし、所望のフォローアップ分析によって変化するであろう。
    注：非感染コントロールの細菌の培地を使用することに加えて、本技術の特定の用途のための他の有用なコントロールは、熱死滅細菌を含んでいてもよいか、比較のための細菌の培地を過ごしました。
  7. 5％CO 2、37℃で感染した細胞をインキュベートします。

4.サンプルコレクション

<オール>
  • フォローアップのために無傷の細胞で、細胞培養培地、宿主細胞溶解物、またはガラスカバースリップを分析収集するために、注意深く滅菌ピンセットで透過膜インサートを除去することによって開始します。
  • 分泌ホストProtiensの評価の場合：
    1. 1.5ミリリットルチューブに下室からの培地を収集します。収集中の単層を乱さないようにしてください。
    2. 細胞破片を除去するために4℃で10分間14,000 RCFで遠心分離サンプル。
    3. -20℃で新鮮な1.5mlチューブとストアに50μlの上清が、すべてを削除するか、すぐに使用しています。
  • 宿主細胞Lystatesの評価のために：
    1. 静かに宿主細胞の単層を上記培地を吸引除去します。これはサンプルの損失につながる可能性があるため、単層を乱さないようにしてください。
    2. 1×PBSで細胞を1回すすいでください。
    3. 静かにPBSを吸引。すぐに所望のタンパク質濃度を達成するために、氷冷溶解緩衝液の適切な量を適用し、インキュベート15分間氷上でのサンプル。 0.5および1.5 mg / mlとの間のタンパク質濃度を達成するために、200μlの各6ウェルプレートのウェル当たりの溶解緩衝液350μlの間に適用されます。
      これらの研究で使用される溶解緩衝液は、脱イオン水で構成された、1％（v / v）のノニデットP40の代替、ホスファターゼ阻害剤カクテル、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル：注意。具体的な試薬は、材料および装置のセクションに記載されています。
    4. 各ウェルのプレート表面から細胞を分離するために、セルスクレーパーを使用して、よく1.5mlチューブにそれぞれの内容全体をピペット。
    5. 遠心分離機のサンプルを4℃で20分間14,000 RCFで。
    6. 可溶性溶解物の成分を評価するために、-20℃で新鮮なチューブやストアに上清を除去したり、すぐに使用します。
    7. 核または他の不溶性の溶解物の成分を評価するために、-20℃でペレットと店を予約したり、すぐに使用しています。
  • 免疫蛍光イメージングによる評価の場合：
    1. として海賊媒体と1×冷PBSで細胞を洗浄します。
    2. PBS中で一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で細胞を固定（W / V）。
      注：これらの研究では、PFAの1ミリリットルを各6ウェルプレートのウェルに添加しました。

    • 5.推奨用途

    1. SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによってシグナル伝達解析をホスト
      1. 4.3節で説明したように、宿主細胞溶解物を収集します。
      2. ビシンコニン酸（BCA）アッセイまたはタンパク質標準30を使用して同等のことで、各サンプル溶解物のタンパク質濃度を決定します。
      3. ロードする前と4〜15％ポリアクリルアミドゲルまたは適切な代替31上でサンプルを実行しているサンプル間のタンパク質濃度を正常化します。
        1. 新しい1.5mlチューブに、各サンプル（ 例えば、20μgの）からの同じタンパク質の量をピペッティングし、溶解緩衝液の可変ボリュームを追加することによって、試料濃度を正規化する（バッファ量=総体積-試料体積試料を横切る総容量（ 例えば、50μl）を、最終タンパク質濃度と同等にするために各チューブに）加えました。
      4. ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（または同等のもの）への転送サンプル。ここで説明する結果を得るために、さらに45分間、70ボルトに電圧を上げる前に、2時間25ボルトでサンプルを転送します。 200mMのトリス塩基、1.5Mのグリシン及び脱イオン水中の20％メタノール（v / v）からなる移動バッファを使用。
      5. トリス中の5％BSA + 0.1％のTween 20でブロック膜は、生理食塩水（TBS）をバッファリング。使用する抗体については、製造元の推奨事項に基づいて、それに応じて調整します。
      6. 4℃で一晩一次抗体を有する膜をインキュベートします。メーカー推奨希釈で使用してください。
      7. TBS + 0.1％ツイーン20で1.5時間、膜を洗浄します。すべての10-15分をバッファリフレッシュ。
      8. 部屋のtemperatで1.5時間、5000：西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とインキュベート1の希釈で二次抗体を抱合URE。
      9. TBS + 0.1％ツイーン20で1.5時間、膜を洗浄します。 15分 - すべての10をバッファリフレッシュ。
      10. 製造業者の指示に従って前フィルムに現像に化学発光検出試薬で膜をインキュベートします。所望に応じて他の検出方法を用いることができます。
    2. 宿主細胞免疫蛍光染色およびイメージング
      1. セクション4.4に記載されるように、宿主細胞を含むカバースリップを修正しました。
      2. PFA溶液を除去し、PBSで処理した細胞を含むカバースリップを2回洗浄し、洗浄の間に吸引します。
        注：PFAは非常に毒性があり、適切に処分しなければなりません。
      3. 1％PBSで、室温で2時間カバーガラスブロック（w / v）の正常ヤギ血清、2％（v / v）のトリトンX-100、および0.5％（v / v）のツイーン20。
      4. バッファごとに10分を更新、30分間PBSでカバースリップを洗ってください。
      5. ゾルをブロックで1：50の比率（またはメーカーが推奨するなど）で一次抗体とカバースリップをインキュベートution 4℃で一晩。
      6. 30分毎にバッファリフレッシュ、PBSで1.5時間、カバースリップを洗ってください。
      7. ブロッキング溶液への抗体の200：1の比を用いて、（ヤギ抗ウサギIgG AlexaFluor488、これらの研究に使用した）二次抗体で、室温で2時間、カバースリップをインキュベートします。
      8. 洗浄は、バッファごとに20分を更新、1時間カバースリップ。
      9. 希望の汚れを適用します。
        注：ブロッキング溶液中で千：1の比率でDAPI（核染色）およびローダミン - ファロイジン（アクチン染色）を利用し、これらの研究を。
      10. 室温で30分間の核とアクチン汚れでカバースリップをインキュベートします。
      11. 10分毎にバッファリフレッシュ、室温で30分間PBS中でカバースリップを洗ってください。
      12. マウンティング培地を用いてガラススライド上にカバースリップをマウントします。
      13. カバースリップは、シールやイメージングに先立って一晩スライドに設定することができます。ここに記載の結果を得るために、蛍光顕微鏡USIに画像を収集します標準の20X目的​​をngの。撮影した画像を処理するためにImageJの顕微鏡イメージングソフトウェアを使用してください。
    3. エチジウムホモ二量体細胞死アッセイ
      1. 各ウェル滅菌PBSで細胞を2回洗浄から培地を吸引。
      2. PBSで4μMのエチジウムホモダイマー-1を適用します。
      3. 暗所で30分間室温で細胞をインキュベートします。
      4. 528 nmの励起および590nmでのカットオフ値を持つ617 nmの発光に設定し、プレートリーダーを用いて蛍光のレベルを決定します。
      5. サポニン（w / v）の各ウェルに以下の初期読み取りに0.1％を加え、プレートを同じ設定でプレートをもう一度読む前に（揺らしながら）室温でさらに20分間インキュベートすることができます。
      6. （ポストサポニン）を読み取る第二の蛍光によって初期蛍光読み（後処理）を分割し、各ウェルについて個別パーセント膜透過を決定します。
    4. ATP決意アッセイ
      1. 上記のセクション4.3で説明したように溶解物を収集します。
      2. BCAアッセイまたは類似の30を介して溶解物中のタンパク質レベルを正常化します。
      3. 発光ベースのATP決意キットや、メーカーの指示に従って同等のものを使用して、細胞ATPレベルを決定します。
      4. 正規化は、対応する非感染対照試料に値を処理しました。
    5. LDH放出アッセイ
      1. 4.3節で説明したように感染後、上清を収集します。
      2. 製造業者の説明書に従ってLDH放出のための細胞傷害性検出キットを使用して、LDH放出を評価します。

    結果

    分泌された細菌性因子の研究のために開発された透過性膜挿入に基づく感染システムプロトコルは、このシステムは、この場合には、分泌細菌因子の影響を評価するために、多孔質膜を介して細菌宿主細胞の分離に依存して、図1に詳述されていますこのような宿主膜完全性、細胞生存率、細胞シグナル伝達、および分泌する宿主細胞因子などの宿主応答のストレプトリシンS（SLS）、 図2は 、このシステムは、コンタクトのアクティベーションの変化を評価するために使用され得ることを実証する代表的なウエスタンブロットデータを提供非依存ホストシグナル伝達タンパク質。具体的には、代表的なデータは、SLS生産GAS株の存在下で大幅に強化されたp38 MAPKの活性化を示しています。このシステムはまた、免疫蛍光顕微鏡（によって宿主タンパク質の局在に分泌された細菌の要因の影響を視覚化するために適用することができます<強い>図3）。データは、活性化の21時に細胞質から核へ移行し、キー炎症性メディエータ核因子カッパB（NFκB）のSLS依存性活性化を示しています。 図2および3の結果は、両方がSLSに依存することは、炎症性シグナル伝達応答は、細菌と宿主細胞との直接の接触を必要としない示します。以前の実験は、すでに直接感染モデル21におけるSLS依存のp38およびNFκB活性化を実証してきたように、透過膜インサートベースのシステムにおける3つのガス系統間のp38またはNFκB活性化の同様のレベルは、応答がとの間の直接的な接触を必要としたことを示しているだろう細菌宿主細胞。 図4は、この感染システムはエチジウムホモダイマー及びLDH放出アッセイを介してホスト細胞傷害性毒素依存性の変化を評価するために適用され得ることを実証します。これは大幅な増加のiで証明されます膜透過性およびSLS欠損株に暴露し、非感染細胞または細胞と比較して、SLSを含むガス株に暴露された宿主細胞からのLDHのリリースではnの両方。有意な効果は12時間後の膜透過の場合は感染とLDH放出の場合には16時間まで明らかではないとして、細胞毒性におけるこれらの変化は、即時ではありません。代表的なデータは、これらの宿主応答の評価のための適切な時点および感染条件を選択することの重要性を示します。ホストシグナルの変化と細胞毒性の評価を可能にすることに加えて、透過性膜挿入に基づく感染系は、宿主細胞溶解物の細菌汚染を防止することによって、ホストATPレベルの正確な決意のような代謝変化の研究にも適用可能である（ 図5） 。これらのデータは、強化されたATPの損失と、感染後16時間までにGAS感染に応答して、ケラチノサイトATPの著しい損失を示すInはSLSの存在。これらの結果は、宿主ストレス応答シグナル伝達および細胞毒性の観察された毒素依存性の増加と一致しています。

    figure-results-1444
    図1：透過膜挿入に基づく感染システムプロトコルのダイアグラム宿主細胞に分泌細菌因子の影響を評価するために、ヒトケラチノサイトはボトムコンパートメントに播種し、90％コンフルエンスまで増殖させます。 0.4μmの細孔を有するコラーゲンコーティングされた膜は、上部および下部チャンバーを分離し、そして細菌を、所望の感染期間の透過膜インサートシステムの上部チャンバーに添加されます。細胞培養上清および宿主細胞は、感染期間以下の収集と分析の様々に利用することができる。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。

    figure-results-1945
    図2：透過膜挿入に基づく感染システムは、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって宿主細胞溶解物の分析のために利用することができる代表的なデータは、SLSは、感染したケラチノサイトにおけるp38 MAPK経路の活性化を増強することを示しています。 （A）HaCaTsは、透過性膜インサート感染系を介して7時間GASに感染させた（MOI = 10で）、そして溶解物をp38の活性化について評価しました。三つの独立しウェスタンブロットから（B）濃度測定をGAS'infectionに応答してp38の相対的な活性化を定量するために実施しました。 3生物学的複製からの平均、標準偏差を表すエラーバーで示されています。 p38の相対的な活性化は、リン酸化/総タンパク質レベルとして表されます。統計的有意性は、と比較して決定しました非感染細胞。全体のp値はANOVA（P = 0.0063）によって決定しました。ダネットのテストは、対応する非感染対照平均に各条件を比較するために事後行きました。 *、P = 0.01〜0.05。 **、P = 0.001〜0.01。 ***、p = 0.0001から0.001。 ****に、p <0.0001。この図は、フラハティら。2015年21から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    figure-results-2825
    図 3： 透過膜挿入に基づく感染系は免疫蛍光顕微鏡によってホストシグナル伝達の変化の可視化を可能にしますが代表的なデータは、ストレプトリシンSは、NFκBの活性化を介して炎症誘発性シグナル伝達を増強することを示しています。たHaCaTヒトケラチノサイトはMでGASに感染していました透過膜インサートベースの感染システムを使用して、8時間のための10のOI。 NFκBの（A及びB）核局在化は、免疫蛍光画像化によって評価しました。核局在化細胞の割合は、NFκBが所与のフィールドのために細胞質から核に転位したれる細胞の数を計数し、同じフィールドのセルの合計数でその数を割ることによって計算しました。スケールバーは100μmで示しています。 （A）3の生物学的反復の平均値は標準偏差を表すエラーバーで条件ごとに表されています。全体のp値はANOVAによって決定しました。 P <0.0001。ダネットの試験は、対応する非感染対照条件に各条件を比較するために行きました。 *、P = 0.01〜0.05。 **、P = 0.001〜0.01。 ***、p = 0.0001から0.001。 ****に、p <0.0001。この図は、フラハティらから変更されている。2015年21。/ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    figure-results-3710
    図4： 透過膜挿入に基づく感染系は、細菌と宿主細胞との間の直接接触の非存在下での細菌媒介膜透過化および細胞毒性の決意を可能にします代表的なデータは、ケラチノサイトの生存率は、アクティブSLS毒素の存在下で減少することを示しています。 。 GAS -誘導細胞死はWT、SLS欠損またはSAGA補足ガスの存在下でHaCaT細胞において評価したケラチノサイトは、10のMOI（で8-16時間、透過性膜挿入に基づく感染系を用いたガスに暴露しました。 A）生存率は、エチジウムホモダイマーアッセイまたは（B）LDH放出アッセイによって評価しました。両方のパネルにおいて、3の再plicatesを平均し、誤差バーは標準偏差を表しています。各時点で有意性はANOVA（A）8時間、p = 0.0241により決定しました。 12時間、p <0.0001（B）8時間、p = 0.0287。 12時間、P = 0.1977; 16時間に、p = 0.0031。ダネットの試験は、対応する時点について、野生型感染に各状態から平均を比較するために行きました。 *、P = 0.01〜0.05。 **、P = 0.001〜0.01。 ***、p = 0.0001から0.001。 ****に、p <0.0001。この図は、フラハティら。2015年21から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    figure-results-4685
    図5： 透過膜挿入に基づく感染系はBACTを防止することにより、ホストATPレベルの正確な決意を可能にします宿主細胞溶解物のerial汚染。代表的なデータは、A群連鎖球菌感染中のATPのSLS依存性損失を示しています。 HaCaT細胞を、透過性膜挿入に基づく感染系を用いて8-16時間GASに感染させました。技術的反復（n = 3）は、代表的な一生物学的複製（サンプルあたり2×10 6細胞）の標準偏差を表すエラーバーで、各条件について平均したから。全体のp値はANOVAによって決定した（12時間、P <0.0001; 16時間、P <0.0001）。ダネット検定は、対応する時点での野生型感染と各条件を比較するために行きました。 *、P = 0.01〜0.05。 **、P = 0.001〜0.01。 ***、p = 0.0001から0.001。 ****に、p <0.0001。この図は、フラハティら。2015年21から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    ディスカッション

    本明細書中でインビトロ系におけるヒト上皮ケラチノサイトの細菌毒素ストレプトリシンSの効果を調べるために透過膜インサートベース感染系を用いる方法が記載されています。このプロトコルは、他の分泌された細菌の毒性因子の検討、ならびに代替の宿主細胞タイプに適合させることができます。 3,8,18 - - 20この最近開発されたシステムは、精製された毒素またはフィルタリング細菌上清1を利用した実験の方法に比べていくつかの利点を提供します。透過性膜挿入ベースのシステムは、最大の毒素活性を維持することができ、それが産生されるように宿主細胞に対する関連細菌毒素の一定に維持投与量を提供し、また実験間で一貫性を増加させます。さらに、このシステムは、より密接に感染が進行するにつれて分泌因子が経時的に蓄積させることによって、およびelimiにより生理的条件を模倣します任意の宿主細胞に適用するには、特定の毒素濃度を選択する必要がNAT変換。さらに、このシステムは、また、研究者が関心の細菌因子が接触依存的な様式で宿主細胞に送達されるかどうかを評価するための手段を提供します。接触依存性は、多くの場合、接着性や付着を防止する試薬を使用することにより、欠損同質遺伝子細菌の変異体の生成を介してテストされます。ここで説明するシステムは、補体またはこれらの従来の手法を交換するための簡単​​な代替手段を提供します。

    プロトコルの項5に記載の試験用途に加えて、この感染系を容易に適合させることができた他のアプリケーションは、サイトカインアレイおよびELISAアッセイのための試料の採取を含みます。これらの場合の両方において、LDH放出アッセイについて記載したものと同様の手順を行ってもよいです。ここでは図示しないが、このシステムが効果的になるように、宿主細胞のサンプルを収集するために使用されていますフローサイトメトリーによってnalyzed。このアプリケーションでは、透過性膜挿入は、感染期間の後に除去され、細胞は、細胞培養培地を除去するために洗浄され、トリプシンは、分析のための細胞の回収を可能にするために適用されます。それはそうでなければ、フローサイトメーターにより正確な細胞計数を妨害する可能性が付着細菌および宿主細胞からなる大きな凝集体の形成を防止するのに役立つので、宿主細胞からの細菌の物理的分離は、この用途に特に有用です。

    従来の直接感染研究と透過膜インサート系感染研究の結果を比較すると、非常に一貫性のあるホストの応答が観察されているが、これらの宿主応答の動態におけるいくつかの顕著な違いは、21の観察されました。例えば、宿主シグナル伝達および膜ベースの細胞毒性の変化はCORより透過性膜挿入に基づく感染モデルで発生する30〜50％時間がかかり直接感染モデルを応答します。透過性膜挿入ベースのシステムは、各ウェルの上部及び下部区画に適用される媒体を必要とするため、ここに記載される研究のために開発されたシステムは、以前に使用され、対応する直接感染モデルに比べて、ウェル当たりの総培地容積の30％の増加を必要と21。直接の接触が禁止されたときに、細菌宿主細胞との間の距離の増加と相まって、総培地容積のこの差は、おそらくSLSは、宿主細胞に到達するために媒体を介して拡散し、観察された効果を誘発するのにかかる時間を増加させます。また、透過膜インサートベースのシステムは、細胞の損傷をホストするために貢献する可能性がある多くのガスの毒性因子を削除します。このシステムでは、これらの追加の要素が存在しないことはまた、宿主細胞の死と直接感染21と比較して、宿主シグナル伝達事象の開始における遅延に貢献する可能性があります。これらの要因を考慮すべきです実験を設計する際に、他の分泌された細菌の成分を評価します。

    宿主細胞の分泌された細菌因子の効果を試験が推奨される透過性膜挿入に基づく感染システムの各アプリケーションの時点の範囲を試験するための最も意味のある条件を特定します。条件は、目的の特定の毒性因子を最適正常その効果を観察するために（特定の環境信号に応答して、例えば対数期、定常期、 等 ）が生成されるものの下に考慮することが重要です。宿主シグナル伝達タンパク質の変化を評価することに焦点を当てた実験では、SLSは、宿主細胞に到達すると、シグナル21を変更誘導するのに十分な量で製造するための十分な時間が許容時間ポイントを選択する必要がありました。これと同時に、必要なシグナリング宿主の変化の評価は、この効果cとして、前SLSによって誘導される膜透過に行われます分析のための宿主細胞溶解物のコレクションをomplicates。 SLSによって誘導される細胞死は、最適数時間報告シグナル伝達事象21の開始後の両方の直接および透過性膜挿入に基づく感染モデルで観察されました。また、興味のある時点を選択することが検討されて細菌が試験期間中に多孔性挿入膜を透過することができないことを保証することも重要です。長期間にわたって特定の細菌成分の製造は、膜の完全性を破壊し、下部コンパートメントへの細菌の通過を可能にすることができます。これは、対象のシステムの潜在的な問題であるかどうかを決定するために、検討される細菌株は、時間点の範囲で透過性膜挿入に基づくシステムの上部チャンバに適用することができます。各時点で、インサートを慎重に除去することができ、下部チャンバーから培地を回収し、標準的なコロニー共同で利用することができますuntingアッセイ（セクション1.5を参照）。全くコロニーを下部区画に細胞培養培地から形成されていない場合、挿入膜を効果時点で細菌の通過を防止すると仮定することができるし、細菌負荷を試験しました。

    分泌された細菌の要因の効果的な分析のための最適化を必要とする可能性がある別の実験設計コンポーネントは、感染（MOI）の多数あります。 MOIは、宿主細胞当たりの細菌細胞の割合を意味し、従って感染の時点で細菌のコロニー形成単位数（CFU）によって宿主細胞集密度の影響を受けた細胞に適用されます。これらの研究では、ケラチノサイト細胞はこれらの細胞が無傷のタイトジャンクショ​​ンを有する粘着単層を形成させ、90％の集密度に増殖させました。検討されるべき宿主細胞の生理学的組織の配慮は、感染実験のための適切なコンフルエンシーを選択する必要があります。 approprいったんウェルあたり宿主細胞のiate数が決定され、適切な細菌CFUは、所望のMOIから算出することができます。ここに記載の研究では、ガスは、異なる細菌を、所望の追跡分析によって変わる10の適切なMOIのMOIで宿主細胞に適用しました。低初めMOIは、典型的には、より生理学的に関連性があると明らかにされている宿主細胞の生存率が劇的に変化する前に、宿主細胞のシグナル伝達の微妙な変化を捕捉するのに十分ゆっくりと蓄積するために関心の細菌ファクターを可能にします。より高いのMOIは細胞毒性を評価する多くの研究で使用されているが、この効果は、低MOIで始まり、感染が長期間にわたって進行させることにより達成することができます。すべての菌株を試験するための同質遺伝子変異体は、野生型細菌と比較して改変された成長速度を有することができるように、光学密度の帰結に正確なCFUを決定することが重要であるため、より高いまたはより低いCFUのにウェルに添加されることを必要とするかもしれません株間の宿主応答の適切な比較を確保します。哺乳動物宿主細胞は、検討されてケース内の細菌を死滅させるまたはそれらの増殖を阻害することができるか、菌株間で非同期成長が疑われる場合、また、感染期間の終了時に、最終的な細菌負荷を評価するための研究を行うために有用であり得ます。これは、透過性インサートの内容物を収集し、手順のセクション1.5に記載したのと同様のコロニーカウントアッセイを実施することによって達成することができます。

    所望のアッセイのために適切な大きさの井戸を選択すると、最適な結果を得るために重要です。透過膜インサートは様々なサイズで利用可能であるが、ここに示されている研究のための最も一貫した結果は、24ウェルおよび6ウェル組織培養プレート用に設計されたインサートを用いて観察しました。これらのインサートサイズは​​、滅菌ピンセットで取り扱いが比較的容易であり、操作の容易予防において重要ですウェルの下部コンパートメントに上部コンパートメントからの細菌の不要な転送をる。宿主細胞溶解物の回収を伴う実験のために、6ウェルディッシュは、ほとんどの分析のための条件ごとに適切な細胞数を提供し、試料採取用セルスクレーパーを収容するのに十分な大きさです。宿主細胞が付着残存し、（ 例えば、エチジウムホモダイマーアッセイ、トリパンブルー排除アッセイ）プレートリーダーで測定することができ、蛍光または比色色素で標識された細胞傷害性アッセイのために、対応する挿入物を有する24ウェルプレートの使用でありますお勧め。細胞培養培地を回収し、分析された実験（ 例えば、LDH放出、サイトカイン研究）のためのいずれかの小さなウェルは、典型的には、これらの分析のために十分なサンプル量を提供し、必要なの使用を最小限に抑えるのに24ウェルまたは6ウェルプレートを使用することができます試薬。全体として、この方法は非常に汎用性があり、必要に応じてsamplを調製するために適合させることができます多数の追跡アプリケーション用エス。

    開示事項

    The authors have nothing to disclose.

    謝辞

    We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.

    資料

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Todd-Hewitt brothAcumedia7161AUse appropriate broth for bacterial species of interest.
    BioSpectrometerEppendorfbasic modelAny UV-Vis spectrophotometer is suitable. 
    Petri DishesFisher ScientificFB0875713Other brands are suitable.
    AgarSigmaA1296-1kgOther brands are suitable.
    HaCaT human epithelial keratinocytesGift from lab of Victor Nizet.
    Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11995-073Use appropriate media for cell line of interest.
    Fetal Bovine Serum (FBS)BiowestS162HUse appropriate media additives for cell line of interest.
    10 cm tissue culture dishesNunc150350Other brands are suitable.
    6 well tissue culture dishesCytoOnecc7682-7506Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
    24 well tissue culture dishesCytoOnecc7682-7524Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
    Glass coverslipsFisherbrand12-541-BThese must be autoclaved prior to use for cell plating.
    Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco10010-023
    Phenol Red Free DMEMLife Technologies31053028Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
    Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
    L-glutamineGibco25030149Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
    Sodium pyruvateGibcoBP356100Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
    Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well)Corning3540
    Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well)Corning3595
    ForcepsFisher3120018These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
    Cell scrapersFisherbrand08-100-241These are only required for the collection of cell lysates.
    ParaformaldehydeFisher Scientific04042-500TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
    Bicinchoninic acid (BCA) assay kitPierce23227Other protein quantification assays may be used.
    Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gelsBioRad4561083Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
    Electrophoresis cassette suppliesBioRad1658063Only required for Western Blotting.
    Electrophoresis power supplyBioRad1645050Only required for Western Blotting.
    Western blot transfer cassetteBioRadOnly required for Western Blotting.
    Polyvinylidene (PVDF) MembraneEMD MilliporeIPVH00010Only required for Western Blotting.
    Tween 20SigmaP1379-500ml
    Rabbit IgG-HRP secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc2030The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
    Mouse IgG-HRP secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc2031The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
    Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibodyCell Signaling4511Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
    Total p38 MAPK antibodyCell Signaling8690Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
    Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488Molecular ProbesA-11034Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
    LumiGLO Detection ReagentKPL54-61-00Only required for Western Blotting with detection on film.
    Detection filmBiodotBDB57Only required for Western Blotting with detection on film.
    DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscopeNikonOther fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
    Normal goat serumThermo Scientific31873
    Triton X-100SigmaT9284-500mL
    DAPI nuclear stainCell Signaling4083Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
    Rhodamine-phalloidin actin stainMolecular ProbesR415Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
    Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Only required for immunofluorescence imaging.
    Ethidium homodimer 1Molecular ProbesE1169Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
    Spectramax M5 Microplate ReaderMolecular DevicesOther microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
    SaponinSigma47036-50G-FOnly required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
    Molecular Probes ATP Determination KitLife TechnologiesA22066Other kits are likely to be suitable.
    Cytotoxicity Detection Kit for LDH releaseRoche11644793001Other kits are likely to be suitable.
    Nonidet P40 SubstituteSigma74385-1LOther suppliers are suitable.
    HALT Phosphatase Inhibitor CocktailThermo Scientific78420BOther cocktails are likely to be suitable.
    SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-freeSigmaS8830-2TABOther cocktails are likely to be suitable.

    参考文献

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