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要約

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

要約

炎症性腸疾患の発生率、 すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎は、大幅に過去10年間で増加しています。 IBDの病因は不明のままであり、現在の治療戦略は、免疫系の非特異的抑制に基づいています。具体的に有意にIBDの管理を改善することができ、腸の炎症および上皮創傷治癒を標的とする治療法の開発は、しかし、これは、炎症性の変化を正確に検出する必要があります。現在、潜在的な薬物候補は、通常、 インビボまたはインビトロでの細胞培養に基づく技術を用いて、動物モデルを用いて評価されます。組織学的検査は、通常、サンプルの特性を変えることができ、さらに、調査結果の解釈は研究者の専門知識によって変えることができ、目的の細胞または組織染色することが必要です。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、光路長遅延の検出に基づいて、可能汚れのない定量的位相コントラストイメージング。この結果は、直接絶対生物物理学的パラメータと相関させることを可能にします。私たちは、屈折率測定に基づいて、DHMと組織密度の変化の測定は、大腸炎マウスとヒトの結腸組織標本の異なる層に、染色することなく、炎症性の変化を定量化する方法を示しています。さらに、当社は、創傷領域の簡単な自動化された決意と、そのような移行細胞の乾燥質量と層の厚さなどの形態学的パラメータの同時決意を通じてDHMを使用して可能in vitroでの上皮創傷治癒、の連続マルチモーダルラベルフリーの監視を実証します。結論として、DHMは貴重な、新規かつ定量的なツールの可能なパラメータの絶対値を持つ腸の炎症を評価するための、in vitroでの上皮創傷治癒の簡素化定量化を表し、したがって、翻訳診断uのための高い可能性を秘めていますSE。

概要

炎症性腸疾患（IBD）、 すなわち、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、消化管1の特発性炎症性障害です。 IBDの根底にある病態生理および潜在的な新薬や新たな診断手法の評価の研究は、特に重要です。基礎研究およびIBD患者の臨床管理の両方で、腸粘膜が注目2,3の焦点となっています。粘膜は、共生細菌、上皮細胞および腸の免疫系の種々の細胞成分間の相互作用は、腸のホメオスタシス4,5を編成れる解剖学的境界を表します。しかし、IBD患者に、制御されていないと持続性の腸の炎症は最終的にそれ自体が局所の炎症6を悪化させる上皮バリア機能の崩壊に終わることができます潰瘍や狭窄などの検出可能な損傷を、粘膜につながります。

上皮は、創傷治癒、炎症ので下記上皮再生のために重要であるだけでなく、消化管手術7後の消化管潰瘍や縫合不全の治癒のためのコア要件です。上皮は治癒がアッセイ治癒インビトロ創傷でシミュレートし、腸の炎症8,9のマウスモデルにすることができます巻か。両方のin vitroおよびin vivoでのアプローチは実験的評価の精度を制限する欠点を持っている。in vitroアッセイを、古典的なスクラッチアッセイのように、蛍光発色団と長引く染色手順またはトランスフェクションを必要とします。彼らは多くの場合、10を自動化することができない細胞増殖および遊走のそれらの不連続な監視によって制限されている。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎などのin vivoモデルを、頻繁に起因見られる大きな変化に一部、堅牢な読み取りアウトを欠いています実験室でのマーカーで、ミリアンペア不適切な王このようなマーカーは、大腸炎の重症度11,12を評価しました 。炎症を起こした粘膜の組織学的分析は、まだ現在大腸炎の重症度を決定するための最も有効な手法であるが、これは、in vitroでの上皮創傷治癒アッセイのように、染色を必要とし、研究者の専門知識13に依存しています。

最近、デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）、定量的位相顕微鏡14の変異体は、 インビトロおよびインビボ 15 における上皮の創傷治癒の評価のための有用なツールとして同定された。DHMは、（OPD）の光路長遅延を測定することにより、組織密度の評価を可能にします、その見通し新たな癌の診断16-18と炎症関連組織の変化19の定量化。また、DHMは、セルの厚さ、セル覆われた表面領域および細胞内（タンパク質）コンテンツ量を決定することにより、細胞形態動態のモニタリングを可能にします 15,20。 in vitroアッセイでは、DHMはまた、細胞体積と厚さ21,22の変化を評価することによって、 例えば、携帯透水性、生理学的プロセスの分析を可能にします。また、DHM測定は、研究者に関連したサンプルバイアスを防止する自動化することができます。

ここでは、腸の炎症のマウスモデルにおけるDHMの使用を実証し、また、ラベルフリーのin vitroアッセイとして、創傷治癒の定量的モニタリングのためのヒト組織試料の分析にDHMを適用します。まず、我々は、IBDを有するヒトから大腸炎マウスおよび組織切片における異なる結腸壁層の炎症性変化を評価します。 DHM定量位相画像化手順を説明した後、我々は、詳細な顕微鏡部品を使用するための指示、組織切片を調製し、また、取得した定量的な位相画像の評価を記述を提供します。

次に、我々は、DHMはUTIできることを示していますin vitroでの上皮創傷治癒の連続マルチモーダル監視のためlized、および細胞層の厚さ、乾燥質量と細胞容積のような細胞の特性の分析を記述し、薬物誘導し、生理的な細胞の変化への洞察を与えます。

プロトコル

全ての動物実験は、ドイツ動物保護法に基づく（Landesamtエリーゼナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、LANUV、ドイツ）地域の倫理委員会によって承認されました。ミュンスター大学の地元の倫理委員会は、組織学的および顕微鏡分析のためのヒト組織の使用を承認しました。

1.動物と材料

  1. 地元の動物管理法律に従って女性または20〜25グラムの重量を量る必要DSS-感受性株の雄マウス、および家を使用してください。げっ歯類のための特別な餌を与え、水を自由に飲んでオートクレーブ処理。
  2. 5日間オートクレーブ水道水で：W / Vデキストラン硫酸ナトリウム（36,000-50,000ダDSS、分子量）の3％を投与することによって急性 DSS大腸炎を誘発します。
    注：DSSの効力はメーカーやバッチに応じて非常に可変です。これはダのために、疾患活性の誘導のための最初のサプライヤが提供するDSSのテストILY体重は、信頼性および客観的な指標です。
  3. 結腸組織試料の組織学的評価のために、実験の終了時にCO 2通気（または国や機関のガイドラインで指定）によってマウスを安楽死させます。

2.実験セットアップDSS-大腸炎とのin vitro創傷治癒アッセイ

  1. 細胞培養および創傷治癒アッセイの確立。
    1. 37℃で95％湿度および5％CO 2環境でのCaco-2細胞を成長させます。 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI培地を使用します。
    2. ハイカルチャーインサートと35ミリメートルのペトリ皿に4×10 5細胞/ cm 2の密度でシードのCaco-2細胞（ 図4Aを参照してください）。
      注：インサートは、分析されるべき創傷領域を表す定義されたセルの空き領域で分離された2つのセルカバーされるエリアを生成します。
    3. 2日seedin後に培地変更グラム。 、最初の自動ピペットを用いて、細胞の破片で残留培地を吸引することによって実行し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）100μlで洗浄し、新鮮なRPMI培地または無血清培地を追加します。
    4. 創傷治癒挙動の変化を検出するために、20 ngのEGF / mlの血清または2μgのマイトマイシンC / mlの血清を添加した無血清培地（0.1％FBS）中で24時間培養細胞。 24時間細胞を制御するために、通常のRPMI培地を追加します。
    5. 培養24時間後、削除して、ステップ3.4で説明したように培養インサートを破棄し、DHMを行います。
  2. 急性DSS大腸炎の誘導
    1. DSS溶液（w / v）の3％を得るために水をオートクレーブ100mlにDSSを3gを溶解します。 7日間のマウスを自由に飲料水の代わりにこのソリューションを提供します。マウス/日あたりDSS-溶液5mlを計算します。対照マウスを自由のためにDSSずにオートクレーブ処理水を提供します。
  3. マウスおよびヒトの結腸のcryostaticセクションの調製
    1. 実験の終了時にCO 2注入によるマウスを安楽死させます。
    2. 開腹23によって、動物の腹部を解剖。ピンセットを使って慎重に結腸全体を削除して、手術用はさみを使用して、回腸および直腸の端をカット。直腸最後まで盲腸から長手方向にハサミでコロンをカットし、コロンを開きます。 PBS 24で洗浄したピンセットを使用して試料からすべての糞を削除します。
    3. 内側に湾曲した粘膜と直腸最後に盲腸から長手方向芽綿と結腸全体をロールアップすることにより、スイスロールを準備します。最適な切削温度（OCT）化合物中に埋め込む結腸サンプルおよびさらなる使用まで-80℃で凍結しておきます。
    4. 最適な切削温度10月化合物中の手術標本からのヒト結腸組織を埋め込み、さらに使用するまで-80℃で凍結し続けます。
    5. cryotoの助けを借りて、OCT-化合物包埋標本の厚さ7μmのカットセクション直前に検査する私。
      注：最適なサンプルの厚さは、永続性と調査中の組織型の散乱特性に依存します。結腸組織を使用して説明した実験のために、スライス厚の厚さのサンプルは、<5μmのはクライオ切断工程からアーティファクトを誘発損傷のためのより高いリスクを示しているが。> 10μmのは、原因で定量的DHMの位相コントラスト画像における光の散乱によるノイズの大幅な増加を引き起こします
    6. ガラス物体キャリアのスライドへのセクションを転送します。

3.技術設備、デジタルホログラムの取得・評価のためのソフトウェアと手続き

  1. 定量的な細胞および組織のイメージングのためのデジタルホログラフィック顕微鏡
    1. 図1に示すように、生細胞イメージング25オフアクシスマッハツェンダデジタルホログラフィック顕微鏡システムを使用してください。顕微鏡は装備されていることを確認定量位相画像25のために37℃、ソフトウェアの生理的温度を維持するために10倍の顕微鏡レンズ、直径35mmのガラス物体キャリアスライドとペトリ皿のホルダーを有する顕微鏡のステージ、加熱室。
      注：たとえば、ケンパーら 26とLangehanenberg ら 27に記載されているように。。。
      注：別の方法として、明視野顕微鏡と生きている細胞および解剖組織スライドの定量位相イメージングを行うことができる同様のシステムを使用しています。
    2. きれいな顕微鏡レンズとレンズクリーニングペーパーやほこりまたは他の汚染物質を除去するために、顕微鏡の製造業者によって推奨されるように洗浄剤（ 例えば、エタノール）と凝縮。
    3. 白色光照明「オン」「明視野」撮像モードとスイッチを選択し、DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアを起動します。ケーラー-illuminを確認してください（代替的に、標準的な画像収集ソフトウェアがこのステップにおいて使用することができる）、画像取得ソフトウェアのライブイメージング窓内のサンプルを観察しながら、顕微鏡の製造業者によって推奨されるように試料のエーション。
      注：画像強度は、視野内に均一に分布されるべきであり、試料位置は、顕微鏡のフォーカス駆動を有する光学リフォーカシング時に移動しないようにしてください。
    4. 「DHM「撮影モードを選択して、レーザー光」に「白色光照明とスイッチを「オフ」に。レーザ光 ​​の照射が均一であることを確認してください（ すなわち 、光強度が均一DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアのライブイメージングウィンドウで配布されていること）とオフアクシスキャリア干渉縞のパターンがで十分なコントラストで表示されていることを確認撮影した画像（デジタルホログラム）。
  2. イメージングのための凍結切片の調製DHMと
    1. （：2.3で説明したように、7μmのガラス物体キャリア、厚さにクライオスタットセクション）を冷凍庫からサンプルを取ります。 RTおよび通常の大気中で約5分間のサンプルを解凍。
    2. それは完全にバッファに覆われるまで、ピペットを用いて組織切片上に媒体を埋め込むように100μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS） - 50を追加します。きれいなガラスカバースリップ（ガラス厚さ170ミクロン）でサンプルをカバーしています。
      注：過剰乾燥試料の屈折率と散乱特性の有意な変化を誘導することができます。
    3. ガラスキャリアとカバースリップの底部が光散乱を誘発し得る埃や他の汚染から洗浄されることを確認してください。サンプルは、明視野顕微鏡とDHMと調査のための準備ができています。
  3. DHMで組織切片の定量的な位相画像
    1. デジタルホログラフィック顕微鏡のスイッチをオンにし、イメージングのための10Xの顕微鏡レンズを選択します。第一次戦略兵器削減条約DHM顕微鏡の魔道士取得ソフトウェアと明るいファイルの撮影モードを選択します。
    2. 顕微鏡の対物レンズに面したカバースリップで、顕微鏡スライドホルダーに）2で説明したように、組織スライドを置きます。
    3. DHM顕微鏡の明視野照明スイッチ「オン」。顕微鏡ステージにサンプルを置き、関心の組織領域がライブモニタリングウィンドウに表示されていることを確認してください。顕微鏡のフォーカス駆動を使用して、画像の鮮鋭度を向上させます。
      注：だけでなく、関心のある領域は、組織のないスライドの面積も視野に存在すべきです。
    4. 画像取得ソフトウェアを使用して、急激に重点を置いた試料の明視野画像をキャプチャします。
    5. 「DHM「撮影モードを選択し、「オフ」白色光照明をオンにし、レーザー光の照射を「オン」に。 3ミリ秒以下、ホログラム記録のための「露光時間」を選択し、そのhologrを観察aphic軸外干渉縞は、画像取得ソフトウェアのライブイメージングのウィンドウで適切なコントラストで表示され、デジタルホログラムをキャプチャします。
    6. 明視野画像と異なるサンプル領域のデジタルホログラムの十分な数が記録されるまで3.3.5 - を繰り返し3.3.3手順。ホログラム買収が完了しました。
  4. DHMイメージングのための創傷治癒アッセイの調製
    1. DHM測定中に安定した温度条件を確保するために、実験開始前に3時間 - 約1 DHM顕微鏡のペトリ皿の加熱室に切り替えます。
    2. 必要な機器（2.3に記載されている創傷治癒アッセイのペトリ皿）とワークベンチを用意：ピペット、ピンセット、ペトリ皿用ガラス蓋、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）は、生理的で、細胞培養培地を緩衝しました無菌環境での試料調製のための温度（37℃で）。
      注記： ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を、10％胎児子を産む血清（FCS）、20mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、および850ミリグラム/ LのNaHCO 3で構成されています。
    3. ペトリ皿からプラスチック製のふたを取り外し、ピペットで細胞培養培地を除去します。ピンセットを使用して、ペトリ皿の底からカバーを取り外します。
    4. 死細胞および創傷領域の残りの細胞成分（ 例えば 、血清）を除去するために、バッファリング1ミリリットルのHEPES細胞培養培地で2回-サンプル1を洗ってください。 2ミリリットルを追加HEPESは、細胞培養培地をバッファリングし、ガラス蓋付きペトリ皿キャップ。
    5. ガラス蓋とペトリ皿の底が埃や他の汚染から洗浄されていることを確認してください。サンプルはDHMとタイムラプス観察の準備ができています。
  5. DHMを用いたin vitroでの創傷治癒の連続マルチモーダル監視
    1. 前3時間 - 約1 DHM顕微鏡のペトリ皿の加熱室に切り替え実験の開始にDHM測定中に安定した温度条件を確保します。
    2. デジタルホログラフィック顕微鏡「オン」スイッチは、イメージングのための10倍顕微鏡レンズを選択します。 DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアを起動し、「明視野」撮影モードを選択します。ペトリ皿のための加熱室は、生理的温度（37℃）で動作していることを確認してください。
    3. DHM顕微鏡の加熱室において、創傷治癒アッセイ4に記載のように調製）を用いてペトリ皿を置き。
    4. 明視野撮像モードを選択し、DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアのライブモニタリングウィンドウでそれを観察しながら、顕微鏡ステージにサンプルを置きます。サンプルの所望の領域が急激に白色光照明の下で集中表示されていることを確認します。
    5. 白下（コンフルエント細胞と創傷領域および周辺地域）のサンプルの異なる領域の明視野画像をキャプチャ画像取得ソフトウェア、文書の外観、細胞密度および均一性を有する光照明。
    6. DHM顕微鏡の「明視野」撮影モードを選択します。 DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアとのライブモニタリングウィンドウで白色光照明の下で、適切な創傷領域を選択してください。創傷領域は、死細胞と無血清遺跡から自由であることを確認し、双方は、好ましくは、直国境を持つ単一の均一な細胞層を、含まれていることを確認。
    7. DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアと明視野撮像モードでの最初の創傷領域の白色光画像をキャプチャします。
    8. 白色光照明を「オフ」に、レーザー照射」の「「DHM」モードとスイッチを選択します。ホログラム記録については、以下の3ミリ秒の露光時間（干渉縞がトンの画像取得ソフトウェアのライブイメージングウィンドウで十分なコントラストで表示されるホログラフィック軸外の観察を選択彼は顕微鏡をDHM）とデジタルホログラムをキャプチャします。
    9. 画像取得ソフトウェアでDHMモードでサンプルホログラムをキャプチャし、画像品質を確認するためにDHM顕微鏡の再構築ソフトウェアで定量的な位相画像を再構成します。
    10. DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアでタイムラプスホログラム取得のための- （5分例えば 、3）適切な時間遅延を選択します。
    11. サンプルのみホログラム取得中にレーザ光を照射する画像取得ソフトウェアのタイムラプス取得モードを選択します。
    12. 創傷治癒アッセイのタイムラプスDHM観測を開始します。
    13. 意図した時間後にタイムラプス買収を停止し、明視野撮像モードを選択して、白色光イメージング下でのサンプルの最終的な外観を文書化します。
  6. 解剖組織のデジタルホログラムを再構築し、定量化するためのパラメータとして平均屈折率を決定します組織密度
    1. ケンパーら 26とLangehanenberg ら 27に記載されているように、 例えば DHM顕微鏡のソフトウェアとの解剖組織のデジタルホログラムから定量的位相画像を再構成します。
    2. 利益（ROIを）19の適切に選択された領域内の異なる組織層（上皮、粘膜下組織、間質）の平均位相差Δφを決定します。
    3. 屈折計を使用して、またはその代わりに、文献から適切な値を使用することにより包埋媒体の屈折率を決定します。 （典型的な埋め込 ​​みメディアの屈折率の値：nは水 = 1.334 28、nはリン酸生理食塩水（PBS）= 1.337 29、n個の細胞培養培地 = 1.337から1.339 29,30を バッファリング ）。
    4. 平均位相差19値は異なる組織層の屈折率を算出します
      figure-protocol-7258（1）
      注：式で。 、解剖組織の厚さD（ここでは7ミクロン）：1λ（λ= 532 nmのここ）は、レーザ光 ​​の波長であり、nは媒体がここに包埋媒体（の屈折率： 中 = nのPBS のn = 1.337、アッベ屈折計により測定）。
  7. 再構築し、一連の観測創傷治癒タイムラプスからデジタルホログラムを評価
    1. DHM顕微鏡ソフトウェア26,27と創傷治癒の観察中に得られた時間経過ホログラムシリーズから定量的位相画像を再構成します。
    2. 最大位相コントラストの画像に定量的位相画像の各シリーズを正規化します。
    3. 当たりできる画像セグメンテーションによって定量DHMの位相画像中の細胞によって覆われる面積S cを決定しますフリーソフトウェアセルプロファイラを用いて形成された（www.cellprofiler.org 31）。
    4. 面積S CのセルΔφ セルの平均位相差を計算します。
    5. 面積S C 15の平均位相差Δφ 細胞から細胞乾燥質量DMを取得
      figure-protocol-8026 （2）
      注：2 DMは細胞乾燥質量を表す式では、S cは 、細胞およびα= 0.002メートル2 /キログラムによって占有される領域を示しています。
    6. 一体型携帯屈折率n 細胞および細胞培養培地nは 媒質の屈折率を決定します。 30で説明したように懸濁した細胞とは別に実験的にn個の セルを決定し、屈折計を有するn 媒体を測定します 。オルタナtively n個の セル 30とn の媒体 29,30のための文献値を使用します。
    7. λ、Δφ セル 、n個 の細胞から平均セル厚d セルを計算し、nは 媒質 26,32
      figure-protocol-8727 （3）
      注：式で。 3パラメータd 細胞が平均セル厚さ、λは、レーザ光 ​​の光波長を表すΔφ セル平均位相差を表し、nはセルおよびn 媒体積分セルラ屈折率と周囲の媒体の屈折率です。

結果

デジタルホログラフィック顕微鏡用DHMイメージングのための典型的なセットアップ（DHM）

図 1Bに示すように、明視野イメージングおよび定量DHM位相コントラスト撮影を行うために、我々は、倒立顕微鏡を適用しました。 25前述したように、システムは、DHMモジ?...

ディスカッション

私たちは、DHMは、ex vivoでのマウス大腸炎モデルおよびヒトの結腸組織試料における組織学的損傷の正確な評価を提供することを実証している。また、我々は、DHMが連続的に同時に携帯の変化についてのマルチモーダル情報を提供しながら、上皮創傷治癒を監視することができます示します。 DHMでは、デジタルで撮影したホログラムの再構成が数値的に32に行われます。?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
Methylene blueMerck, Darmstadt, Germany1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, highibidi GmbH, Munich, Germany81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insertibidi GmbH, Munich, Germany80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digital holographic microscope
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lensZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germany
CCD cameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Germany

参考文献

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