核酸のポリアニリンベースのセンサ

要約

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

要約

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

概要

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

プロトコル

1.加工可能PANI合成

1. 250mL丸底フラスコ中で完全にクロロホルム60ml中のアニリン（1 mlの11ミリモル）に溶解します。 5分間600rpmで撹拌し、氷で0〜5℃に冷却します。これは通常、15〜20分（ 図2A）を取ります。
2. 600rpmで攪拌しながら、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（NaDBS）（て7.44 gの21ミリモル）丸底フラスコ中のアニリンの溶液に加えます。
3. 20ミリリットルの水に過硫酸アンモニウム（APS）（3.072グラム、13.5ミリモル）を溶解し、ドロップワイズ30分かけて反応の過熱を防ぐため、それのすべてを追加します。
4. 24のための時間0-5℃で反応を行い、それがさらに24時間室温に到達させます。
5. この反応混合物は、最初は15分後に乳白色を回して観察し、2時間後、最終的には24時間（ 図2B-F）の後に暗緑色に暗褐色。
6. ブフナー漏斗とPANI-NaDBSソリューションをフィルタリングします。 80 mLのクロロホルムと120ミリリットルの水と混合eparation漏斗（ 図2G）。
7. 水性の上清中の未反応NaDBSとAPSを残して、室温で24時間のためのソリューションをインキュベートし、分離漏斗から暗緑色PANIを集めます。

2. PANI-プローブ混合とUV照射

1. クロロホルム - 水でPANI液10倍に希釈（1：3 V / V）および微量遠心管中で15分間穏やかに振動することにより、プローブDNAオリゴヌクレオチドの6.4μmolので希釈したPANIの200μLを混ぜます。
2. 2分間架橋剤中のUVの1200μJ/ cm ²のPANI-DNA溶液を照射します。 UV露光が示された量に制限されていることが重要です。紫外線に長時間さらさは、PANIとDNAの共有結合架橋に起因する可能性が高いPANI中の蛍光変化を、損ないます。
3. 6分間の17000×gで遠心分離によってペレット錯体、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。再びペレット化し、PBS中に再懸濁します。

3. HPANI-プローブのybridization

1. PANI-プローブ複合体の200μlに核酸を100μMの相補的なDNAオリゴヌクレオチドを8μlを添加またはターゲット。
2. 40で15分間混合液をロッキングすることによりハイブリダイゼーションを行います °C。
3. 6分間の17000×gで遠心分離することによってPANI複合体をペレット化。 PBSで洗浄し、水に再懸濁します。

4.排出定常の蛍光測定

1. 250 nmで励起することにより、96ウェルマイクロプレートに異なる処理からPANIを追加し、270から850 nmの範囲の発光蛍光を測定します。 PANIのための発光ピークは、500nm付近に観察されるべきです。

ハイブリダイズした二重の5蛍光顕微鏡測定

1. 48時間、40℃でホウケイ酸ガラスのカバースリップとドライにコートPANIをドロップします。
2. 乾燥したPANI膜の上にプローブ（100μMの8μl）を追加し、UV光（1200μJ/ cm ²のそれを照射）。
3. 48時間40℃でPANI-プローブPBSでフィルムや乾燥を洗ってください。
4. 標的核酸を添加することにより15分間ハイブリダイゼーションを行います。これは生物学的サンプルまたは制御目標オリゴヌクレオチド（100μMの8μL）である可能性があります。 PBS洗浄に従ってください。
5. 500 nmのロングパスフィルタを用いて、40X倍率で蛍光画像を取得します。

結果

図2Aは、APSの添加前に、 すなわち 、重合プロセスの開始時に反応セットアップを取り込みます。ミセル形成は、ミセル界面におけるプロセス-PANI合成が起こる反応の最初のステップである。 図2Bは、5分後に乳白色の解決策を示しています。 APSの30分後、反応はやや褐色に変わり追加されます。 図2Cは、オリゴマーの形成?...

ディスカッション

核酸のPANIベースのセンサーは、DNAやRNAと相互作用するために、水中でのポリマーの可溶化を必要とします。水中のPANI分散物は、以前⁸報告されているように、ミセルを形成する界面活性剤を使用して達成されます。 4-スルホフタル酸ドデシルエステルなどの他の陰イオン界面活性剤ここで用いられるNaDBSに加えて、ノニルフェノールエトキシレート、またはセチルトリメチルアンモニ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536