高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

要約

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

要約

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

概要

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

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プロトコル

すべての動物の使用は、ボストン小児病院で施設内動物管理使用委員会によって承認されています。

1.試料の調製

1. 時限交配
   1. 同じケージで一緒のC57Bl6野生型のオスとメスを入れます。
   2. 次の日の朝早く、嵌合プラグの形成のために確認してください。嵌合プラグ（ 別名 、膣または交尾プラグ）は、そのブロック膣を硬化ゲル状の堆積です。
   3. 胎生0.5（E0.5）などのプラグ日付を設定します。
2. マウス胚の単離
   1. CO ₂窒息により妊娠した雌を安楽死させます。
   2. 吸収パッドに仰向けマウスを入れて、70％エタノールで腹部をスプレー。
   3. 皮膚を持ち上げ、手術用はさみを使用して尾側腹部での初期5ミリメートルの切開を行います。カットし、完全に内臓を露出させるために腹部の皮膚を取り除きます
   4. VAの近くにカットGINAは、子宮全体を削除します。
   5. 子宮角に沿って移植部位の間で切断。各セグメントまたは受胎は、内部に一つだけの胚を持っている必要があります。
   6. 1xの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で子宮セグメントを保管してください。
3. 胚の解剖
   1. ステレオスコープの下の氷冷PBSで別々の皿に各受胎を置きます。
   2. 順次細かい解剖鉗子を使用して、子宮組織、胎盤、その後、胎児膜を削除します。
   3. 大ホールピペットを用いて、1×氷冷PBSで50mlチューブに解剖胚を転送します。組織の損傷を最小限にするためにピンセットで直接胚を拾うことは避けてください。
4. 固定
   1. 固定剤の少なくとも10のサンプルボリュームを持つ以上24時間4℃で10％中性緩衝ホルマリン溶液中で切開した胚を修正しました。
5. 前処理
   1. 4：クリアソリューションを準備二重蒸留水中M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）。
   2. クリアリング・ソリューションとの固定液を交換してください。
   3. 2週間 - 優しく1室温でロッカー上の標本を回転させます。第二および第三日目に一度クリアソリューションを交換します。標本はゆっくりとはっきりと半透明になります。
   4. 10％ホルマリンでクリアソリューションを交換し、2日間ロッカーに残します。
6. 脱水
   1. 5分ごとに、1×PBSで3回を前処理したサンプルを洗ってください。
   2. 穏やかなロッカー上で室温にて昇順エタノール系列でサンプルを脱水します。 E15.5の胚については、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％及び100％エタノール、2時間、各段階を含む、上昇エタノール系列を使用します。古い胚については、インキュベーション時間を長くする必要があります。
7. 染色
   1. エオシンY二ナトリウム塩と0.02の0.1375グラムを追加します。染色溶液を準備100％エタノール50ml中にアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩75グラム。 2時間撹拌。濾紙でフィルタリングします。室温で保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。
   2. 1時間染色溶液に試料を転送します。
   3. 新鮮な染色液と染色一夜に交換してください。
8. 浸潤
   1. 浸透液を調製：JB-4埋め込みキットの溶液Aの100ミリリットル、触媒C、エオシンY二ナトリウム塩の0.275グラムとアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩の0.055グラムの1.25グラムを兼ね備えています。 2時間アイスバケット中（200 rpm）を混合するために攪拌し、次いで濾紙で濾過します。
   2. 4℃で浸透ソリューションを保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。
   3. 浸透液に胚を移す：染色溶液（1：1）、および4℃でロッカー上で少なくとも3時間インキュベートします。
   4. 浸透液に胚を移し、3時間インキュベート低温室でロッカーの研究。
   5. 一回毎日浸透ソリューションを交換し、さらに3日間緩やかなロッカーに寒い部屋に残します。

2.埋め込み

1. 氷の上に溶液Bと浸透策を保管してください。
2. すぐに埋め込む前に埋め込みソリューション（溶液Bと浸透策の1時25分）を行います。
3. オリエント埋め込む金型内の検体は、その後静かに埋め込む型の中に冷たい埋め込みソリューションを注ぎます。再配向させる必要に応じてピンで。
4. 埋め込みソリューションが固化されているかどうかを調べるためにピンを使用します。試料ブロックを押し、必要に応じてそれをトリミング。
5. クロスの向きを取得するために別々の金型を使用して試料ブロックの向きを変えます。
6. 埋め込む金型の上にブロックホルダーを置きます。金型とブロックホルダは埋め込みソリューションによって水没するまで静かに金型内に埋め込みソリューションを注ぎます。
7. 第2の容器に試料を保持し、それを残しますヒュームフード内で4時間 - 3氷上で。
8. 4°Cで固化した標本を保管してください。
9. 埋込み型を剥がします。ブロック内の試料の位置を検査するために、斜め照明で実体顕微鏡下にブロックを置きます。試料の周りのブロック面には、マークグリッド線。
10. 参照としてマークされたグリッド線を使用して材料を埋め込むのアクセス量を除去するためにブロックをトリム。

3.画像取得

1. ミクロトームに試料ブロックを固定し、新鮮な切断面を得ます。セット部の厚さ（ 例えば 、e9.5-10.5、1.5ミクロン; e11.5-12.5、2.0ミクロン; e13.5-15.5、2.5ミクロン; E16.5-古い、3ミクロン）。ミクロトームのホームポジションに検体/ブロックを保管してください。
2. 水平方向に試料のブロック面に対向ステレオズーム顕微鏡をマウントします。
3. コンピュータと顕微鏡の電源を入れ、画像取得ソフトウェアを起動します。
4. 視覚化し、ブロック面に光学系の焦点を合わせますイメージングソフトウェアの「ライブビュー」モードで。
5. ブロック-顔がファインダーの中心になるように、必要に応じて顕微鏡およびミクロトームを合わせます。
6. ブロック全体-顔がファインダー内に収まるようにズームを調整します。
7. 緑色蛍光タンパク質（GFP）フィルター（励起470±20 nmで、ダイクロイック495nmで、発光525±25 nm）を選択し、必要に応じて再び焦点を合わせます。
8. 測定し、設定された露光時間を手動で（ 例えば、80から400ミニ秒）。
9. 各新鮮なカットの後、ブロックの顔の画像を取得し、可能な場合は、自動的に画像を保存します。
10. 解像度、切片厚とズームを含むレコードの重要なパラメータ。
11. 標本全体を終えた後、エクスポートし、必要に応じてすべての画像ファイルは、JPEG形式に変換します。
12. イメージング処理ソフトウェアを使用して、すべての原稿画像を反転し、明るさとコントラストを調整します。
13. 別のフォルダ内のすべての処理された画像を保存します。

4. 3D可視化

1. 指示に従って、3D可視化ソフトウェアに対するすべての処理された画像をアップロードします。
2. 入力解像度とセクションの厚さは、ボリュームデータ（ すなわち、ボクセルサイズ）へのすべての画像を変換し、3Dファイルを保存します。
3. 自動モードを使用して、すべての画像の位置を合わせます。必要に応じて手動で個々の画像を調整します。
4. 新しいファイル名に合わせた画像を保存します。
5. 3次元可視化ソフトウェアを使用して、試料の形態学的特徴を分析します。

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結果

我々は、E9.5とE13.5 ⁸間のマウス胚の高品質のHREM画像を報告しています。後期段階の胚の画像品質は、しかしながら、かなりために蛍光色素エオシンの限られた組織浸透の危険にさらされています。染色効率を向上させるために、我々は、蛍光イメージング¹¹に互換性のあるいくつかの前処理方法をテストしています。具体的には、E15.5マウス胚のSca /電...

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ディスカッション

ここでは、迅速な3D可視化および複雑な構造の形態計測分析のために互換性のあるシリアルHREM画像を取得するために、ルーチン実験装置を使用して修正されたプロトコルを提示します。高解像度の画像ではなく、個々のセクションのブロック面から直接取得されるため、微細な形態学的特徴を保持し、迅速に3次元可視化プログラムでデジタル再構築されます。

3Dイメー?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S