実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

要約

マルハナバチ巣箱内微生物コンソーシア豊かにし、ハチの幼虫のため花粉を維持します。研究室と実験、フィールド ベースの次世代シーケンシングによるこの原稿は殺菌剤残留物変更、花粉マイクロバイ オームおよびコロニーの人口統計、コロニーに繋がること仮説をテストするために使用されるプロトコルについて説明します損失。

要約

生産者は、しばしば病は、殺菌剤残留物に蜂を公開に対する作物を保護するために花の中に殺菌剤散布を使用します。「蜂-安全」と考えられるが、花粉で殺菌剤の残留物が (蜂蜜とバンブレ蜂種) の蜂の減少に関連付けられている証拠があります。メカニズムは比較的知られていないまま、研究者は、蜂と微生物の共生が関与していることを推測しています。微生物は、保全や蜂の幼虫の栄養となる花粉の処理に重要な役割を再生します。微生物群集を変更すると、殺菌剤これらの微生物を介したサービスを妨害、ミツバチの健康危険にさらされる可能性が。本稿では、間接機構、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。殺菌剤処理の花に蜂を公開ケージの実験は既に殺菌剤がネイティブ熊蜂 (マルハナバチ インパチェンス) で深遠な植民地の損失を引き起こすという最初の証拠を提供しています。殺菌剤のフィールドに関連する線量を使用して、一連の実験は、殺菌剤にさらされた花粉群集動態の細かい説明を提供するために開発されています。次世代シーケンサーとメタゲノム解析、花粉マイクロバイ内真菌と細菌群集の構造の組成の変化を調べた。ここを開発した実験は、殺菌剤が花粉規定のマイクロバイにどのような影響を与えるかの機械的な理解を提供するために設計されています。最終的には、これらの調査結果は、間接的な経路、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性に光を当てる必要があります。

概要

管理し、野生ハナバチの種は、両方の自然と農業システムの¹の主要な意味を持つ、広範な低下を経験しています。この問題の原因を理解するための努力にもかかわらず蜂蜜ミツバチ減少の要因はまだよく理解されて^2,3,4。野生では、ネイティブのミツバチの特定の種、状況は悲惨な^5,6になりました。産業としての農業と交差する、彼らの人口は、秋に引き続き、花粉 (世界生産の⁷の 35%) を必要とする作物に耐えるだろうとミツバチの人口を維持できない場合は、収穫を削減しました。

蜂蜜蜂の減少、農薬の露出、病気、および生息地の損失^1,4,8,9,10など多くの潜在的な要因が関与しているとき比較的少しネイティブ蜂健康、または農業システムの近くにこれらのストレスのインタラクティブな効果について知られています。多くの現在の研究努力は、過去の研究を示していますが殺菌剤が蜂の低下で、記憶形成を損なうことによって役割再生も殺虫剤、(例えば、ネオニコチノイド^11,12) に注力していきます嗅覚フロント¹³、巣認識¹⁴、酵素活性、代謝機能^15,16,17。グローバルに、殺菌剤は満開で開花作物に適用し続けます。最近の研究は、蜂はよく戻るハイブに¹⁸、確かに殺菌剤残留物をもたらす、研究が含まれているテストのハイブ殺菌剤の残留^19,20の大きい割合を示していることを記載しています。その殺菌剤の残留率が高い蜂蜜蜂幼虫死亡率^21,22,23とコロニー内で「花粉の埋葬」の存在に関連付けられてそれ以上の仕事は明らかにするが、無毒微生物活性を欠いているし、栄養学的危害を受けた²⁴です。殺菌剤「蜂セーフ」が考慮されて長いことにもかかわらず、証拠は今単独で殺菌剤への曝露ネイティブ バンブレ蜂種²⁵マルハナバチ インパチェンスの深刻な植民地損失を引き起こす可能性が。

殺菌剤暴露と植民地との間の因果関係を確立するには、死亡率、これらの化学物質の手口を決定する必要があります。土²⁶、堆積物中の²⁷日、水生環境²⁸菌をターゲットによって証明される、最も可能性の高い殺菌剤変更真菌豊富と花粉規定、それにより主要なコミュニティを呼び出す内の多様性をシフトします。細菌を強く支持可能性があります。真菌の競合他社や拮抗薬、病原性の細菌は比較的オフ、花粉規定の腐敗を促進する増殖できます。過去の研究は実証、微生物、酵母や糸状菌、特に蜂^29,30,31栄養共生として、寄生虫および病原体^{32 からの保護 ,33}, 花粉店の長期保存を提供。防かび剤、したがって、直接害を与えるかもしれないない未熟な蜂がこれらのサービスを提供するために必要な微生物群集を混乱させることによっておよび/または日和見主義の病原体や寄生虫¹²への感受性を高めることによって。食料生産の需要増加に伴い、世界中の作物がされて毎年殺菌剤を噴霧ブルームは、このような殺菌剤による影響の大きさを理解する必要性を強調する中に。

まで、主な知識のギャップに関するネイティブ蜂微生物生態学は次の質問によって表すことができる:どの程度は殺菌剤変更蜂花粉規定内の微生物コミュニティ?深く変えられた群集で花粉を消費の下流への影響は何ですか?これらの生態学的関係の質問を維持し、実験は、明らかに 1 の主な目標で開発された) 単独でその殺菌剤残渣ネイティブ蜂種; 重度のコロニーの低下を引き起こす可能性が2) 殺菌剤、および 3 によって変更されます花粉規定の微生物群集する程度) ミツバチの健康の深刻な変更された微生物群集による影響します。実験の目的は、実験室およびフィールド ベースの組み合わせを使用して上記の質問に対処するため定義されました。新式のメタゲノムと従来のフィールド観測の方法と一緒に分子技術を使用して、この研究はミツバチの健康に対する薬剤の潜在的な効果を一緒に作品を目指しています。

本研究の第一の目的は、殺菌剤暴露のみでネイティブ蜂種の間で重要な植民地の損失を引き起こす可能性を示すことです。大規模なフィールドのケージを含む研究は、マルハナバチ インパチェンス米国 (図 1図 2図 3) で、ユビキタス、豊富なネイティブ蜂のコロニーの成長に及ぼす殺菌剤曝露の調査に使用されました。殺菌剤処理じんましんであれば、低いフィットネスと非曝露ハイブと比較して非定型の人口統計、仮説。この実験から得られたデータは、花粉内の殺菌剤の残留物がネイティブ バンブレ蜂種²⁵で深遠な植民地の損失の唯一の原因をすることができますを示す、この仮説をサポートされています。本研究の第二の目的は、殺菌剤の曝露に花粉マイクロバイの応答を調査するためです。それは、殺菌剤にさらされる花粉規定内微生物の群集構造が異なる未処理花粉のこと仮定されます。真菌の豊かさと多様性を期待して、大幅に低下する、細菌および/または単一の支配的な真菌種可能性が大きくなります他の競合する菌の有無のチェック。一連の生体内試験、メタを使用してこれらの微生物群集組成の変化を分析します。

プロトコル

1。 バンブレ蜂コロニーの成功を使用してフィールド ケージ実験に殺菌剤曝露の効果を調べる

フィールドで

を 10 セット
1. メッシュ ケージは麦が植えられました。各ケージの周りトレンチを掘るし、蜂が逃れることができないように地面にメッシュ ケージの 4 つすべてのエッジを掘る。ハチ (例えば ソバ、ルリヂサ、ミヤマナズナ属、コスモス、ひまわり) を知られている、鉢植えな顕花植物とケージをストック ( 図 2).
2. は、ブルームのクローバーのシングル トレイ (36 cm × 42 cm) とケージを補足します。スペース約 2.5 m x 1 m 単調な生活残りのケージ領域を麦でケージの 1 つのコーナー内の花のリソースをクラスターします
。 植民地、各含んでいる労働者と単一の女王、治療
3. ランダム熊蜂を割り当てる (殺菌剤あり/なし、N = 治療当たり 5 植民地、植民地 10 合計)、フィールド ケージ内配置 (N = 1/ケージ) 29 日 (6 月 23 日-7 月 21 日 2014).
4. オリエント コロニー ボックスその植民地 ' s 開口部がミツバチをナビゲーションの最適の条件を提供する南を指します。砂糖水の膀胱、蜜可用性を補完するハイブ ボックス内に配置を持つコロニーを補助します
。
5. 適用草花 5 殺菌剤治療中にフィールドに関連するレベル (20 g/L) クロロタロニル ベース殺菌剤は手を使って研究 (一日 0 や 13) 中に 2 回農薬噴霧器を開催しました。花の表面 ( 図 3) にさらに液体の付着がありませんその花を均一にコートします
。
6. ケージ調査の結論で、ケージから B. インパチェンス 植民地を手で削除、20 分-20 ° C のフリーザーに置くことによってじんましんをクールな
7. を取り外して滅菌鉗子を用いたミツバチ幼虫、蛹、大人の女性の数を記録 (私 。e. 受動的探索担当)、および大人の男性。母女王、幼虫、蛹、(すなわち 受動的探索担当)、成人女性、成人男性の乾物重を記録分析用天秤を使用します
。

2。へまをする蜂の巣室を用いた In Vivo 試験の花粉対策で微生物に殺菌剤影響を調べる

標準を使用して細かい粉に

1. 廃タイ市販購入した花粉研究所ボールミル。粉末花粉を滅菌するには、紫外線の下で一晩蒸発することができます 70% エタノールに浸漬します。汎用寒天に ~0.5 mg をメッキすることによって花粉の不稔を確認します。
   1. 乾燥、滅菌ピペットを使用して滅菌の花粉を追加殺菌剤の投与量を関連するフィールド: 14.3%; propiconazole トリートメントの 22.9% でアゾキシストロビン (0.74 μ L と 0.65 μ L それぞれ/日ハイブ/)。滅菌を木の棒でよく混ぜ
   。
2. 場所 6 実験ハイブ (n = 3 の各コントロールと治療のため) で部屋の温度で維持されるクリーンで衛生研究所ベンチトップ。毎日花粉 ^{34 , 35} 防かび剤 (トリートメント) 用または (制御用) 標準的な無菌技術を使用してフード内の滅菌水と混合の 4.27 g の重量を量ます。
   1. トラップ ドアの外側のじんましん、段ボール箱の側面によって提供されるを使用してハイブ内の花粉を紹介します。毎週滅菌糖溶液とハイブを補足します。4 週間以内に政権を与え続ける
   。
3. 研究室での研究の結論で滅菌鉗子とへらを使用してひな部屋内に含まれる花粉規定を 20 分こすり-20 ° C のフリーザーに置き、滅菌ストレージ管場所ハイブをクールします。-80 ° c. の数と労働者と開始時と実験 (ステップ 1.7) の最後の女王の母の重量のレコード ストア
。
4. 市販 DNA の隔離を使用して花粉規定サンプルからの DNA の分離キット (詳細については表を参照してください).
   1. 抽出への花粉提供の 0.25 g チューブ、簡単にミックスする渦を追加します
   。
   2. は、50 μ L/サンプルについて十分な脱イオン蒸留水に 200 mg/mL のリゾチーム ソリューションを行います。完全にフォーム ソリューションを積極的に振る
   。
   3. は、リゾチーム溶液 50 μ L を加える、それのサンプルを抽出管と複数回の反転でよく混ぜます。37 の ° C の水浴中で 10 分間のチューブを孵化させなさい。沈殿物が形成されている場合熱 60 ° C まで使用する前に溶解するソリューションです
   。
   4. 追加 70 μ L 水溶液溶解抽出管にソリューションの保護、テープでフラット ベッド渦パッドの水平と 30 10,000 x g で 10 分間遠心分離渦管常温 s.
   5. は、きれいな 2 mL コレクション チューブに上清を転送します。4 ° C の氷浴で 5 分で 5, 加温のタンパク質沈殿物溶液、渦の 250 μ L を追加します
      。 注: は、500 μ L の上清を 400 μ L の間期待してください。上清はまだいくつかの粒子を含めることができます
   。
   6. 10,000 × g で 1 分間室温でチューブを遠心し、上清の最大 600 μ L をクリーン 2 mL 管に転送します。水性阻害剤除去ソリューション、簡潔に、渦の 200 μ L を追加し、, 5 分遠心 10,000 x g に 1 分間室温でチューブはクリーン 2 mL コレクション チューブに上清の 750 μ L まで転送のための 4 ° C で
   。
   7. 培養上清と 5 の渦に水性バインド ソリューションの追加 1200 μ s. スピン フィルター、および 10,000 × g で遠心する室温で 1 分に清約 675 μ L をロードします。流れを破棄します
   。
   8. 繰り返す 2.4.7 2 回。
      。 注: 処理の各サンプルに対して 3 つの負荷の合計が必要です
   。
   9. 追加 500 μ L エタノール、室温で遠心する 30 の 10,000 x g に s、流れを破棄し、再びクリーン 2 mL 採取管の g. 場所スピン フィルター x 10,000 で 1 分間室温で遠心分離します
   。 フィルター膜の中央に
   10. 追加 100 μ L の溶出バッファー。30 間室温で遠心 10,000 x g に s スピン フィルターを破棄します。ストアは、-20 ° C から-80 ° C の間に DNA を集めた
5. シーケンスの DNA を分離使用。
   1. 定量化するため、蛍光分析で 2 ng/μ L の DNA の分離を正規化します。 28 s の相対的な量を比較する抽出されたサンプルごとに 3 通
      1. 準備反応 (工場)、その (真菌)、分析および各花粉規定サンプル ³⁶ の 16S (細菌) コンポーネント。各反作用に 10 が含まれていることを確認総 DNA、非対称シアニン染料ベースのマスターの組合せの 2 x および前方および逆のプライマー組 28KJ/28 b ³⁷ 植物と真菌 DNA の its 1 領/ITS5.8R 各 2.5 μ の ng ³⁸.
   2. 増幅 DNA の次のパラメーターを使用して: 50 ° c、2 分初期変性 95 ° C で 2分前の変性のサイクルの 40 (15 98 ° c、15 s 58 ° c、60 s s 72 ° c)、融解曲線が続く
   。
   3. 準備 2 ステップ、入れ子になったターゲット 16S rRNA 次世代シーケンシング ライブラリを使用して PCR のプロトコル V3 ・ V4 の可変領域と ITS/5.8 s rRNA スペーサー領域。 各プライマーのマスター ミックス × 2
      1. 追加 12.5 μ L DNA の 5 pmol。(16 s またはその; の表 1 を参照してください)、各地域別の反応を確認します。前述の ^{39 , 40} 遺伝子特定シーケンスにシーケンサー固有のアダプター突出部分塩基配列を追加する領域特異的プライマーを変更します
      。
      2. 次のパラメーターを使用して初期の増幅を行う: 3 分初期変性 95 ° c、25 サイクル (30 95 ° c、30 秒 55 ° c、30 秒 s 72 ° c)、72 で 5 分最後の拡張 ° C
      3. 次最初の増幅、電気泳動の移動性によってライブラリのサイズ、および量を確認、ボリューム固相リバーシブル imm x 1 を使用してきれいに残存プライマーと反応試薬を削除する obilization ビーズ。プール 16S、各サンプルの単一私アンプリコン プールを作成する定量的その amplicons
      。
      4. は、シーケンサー特定アダプターを追加し、次のプライマー (表 1 を参照) を使用して特定のデュアル インデックスのサンプルします。各プライマーのマスター ミックス × 2 5 pmol に増幅された DNA の 2.5 μ L を追加します。次のパラメーターを使用してライブラリの増幅を実行: 3 分初期変性 95 ° c、8 サイクルの (30 95 ° c、30 秒 55 ° c、30 秒 72 ° c s)、72 で 5 分最終的な拡張 ° C
   4. 次の PCR、1 x 量の固相リバーシブル固定化ビーズを使用してクリーンな完成のライブラリ。電気泳動の移動性と蛍光分析、それぞれ使用して完成したライブラリの質と量を評価します。ライブラリに 2 μ M およびシーケンスの前にプールを標準化します
   。
   5. プラットフォーム全体私アンプリコン ⁴¹ をカバーする適切な長さと、セカンダリの PCR で追加アダプターに似てに次世代シーケンスを実行します
   。
6. シーケンス アノテーションと微生物組成分析。
   1. コンバインすべてシーケンスされたライブラリの単一のコンティグにシーケンス データをペア ・ エンド (R1 及び R2)。R1 と R2 の両方のファイルをマージするには、ライブラリごとに単一の fasta ファイルが生成します
      。 注: この手順およびプロセス (特記されない場合は) 下記 Mothur バージョン 1.38.0 ³⁸ で実行されます
   。
   2. 画面のあいまいな拠点、予期しない長いシーケンス、および長いホモポリマーを削除する各 fasta ファイル
      。 注: スクリーニング、およびシーケンス除去のパラメーターは、maxambig = 0、maxlength = 600、および maxhomop 両方の遺伝子の 8 を =。同一のシーケンスを削除が、個別に、すべてのライブラリ (別名 Mothur でカウント表) contingence テーブルを保持します
   。
   3. シルバ データベース バージョン 123、に対して遺伝子 16S ライブラリとその団結データベース ⁴² に対して遺伝子 ITS ライブラリの一意のシーケンスを配置します
      。 注: シーケンスは、属のレベルに国レベルから注釈する必要があります。
      1. クラスターがシーケンスを配置後、diff を使って関数 pre.cluster = 5 とキメラを削除します
      。
   4. 王 ⁴³ (遺伝子 16S) のシルバと (遺伝子 ITS) のためには、「その団結分類ファイル (80% のカットオフ値) に基づいてメソッドを使用してシーケンスを分類します。
   5. は Mothur の分類プロセス中に生成された contingence テーブル (1 つの遺伝子) R ⁴⁴ に読み込みます。各分類レベルで、さらに微生物群集変化分析ライブラリごとの相対的な豊かさを取得します
      。 注: 各分類レベルで一緒にマージ分類相対的な豊かさはすべての実験の繰り返しの 2% 未満と
   。

結果

ケージ調査:

ケージの実験から得られたデータは、マルハナバチのミツバチのコロニーが殺菌剤の暴露に重要な応答を持っていたことを示した。殺菌剤処理ハイブ生産コントロールのじんましんよりも大幅に少ない労働者 (12.2 ± 3.8、平均 ± SE) (43.2 ± 11.2,= 6.8 F_{1, 9}, p = 0.03) (図 4

ディスカッション

ミツバチの健康に対する薬剤の効果への調査は、害虫管理戦略の流面を残っています。ミツバチ減少の潜在的な要因を明示的に分離する相補的な技術のスイートを使用して、この知識のギャップを埋めることを目指します。計画、理論的根拠、およびこれらの実験のレンダリングは次のとおりです。

この人口統計学の分析を損なわれてしまいますので、ケージを用いた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR