「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力

要約

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

要約

適応だけでなく、内皮表現型と遺伝子発現の病理学的変化を誘導することにより、血管生理学および病態生理学における血管の流体せん断重要な役割を果たしての正常レベルとパターンからの逸脱。具体的には、定期的に、一方向の流動誘起剪断応力の不適応な効果は、いくつかの血管の細胞型、特に内皮細胞上のさまざまな効果を引き起こすことができます。今では、多様な解剖学的起源から内皮細胞が培養されているが、中・深さは、流体のせん断に対する反応の解析せん断モデル（ 例えば、平行平板フローチャンバー、コーン・プレート・フロー・モデル）の相対的な複雑さによって妨げられてきました。これらのすべては優れたアプローチを示しているが、このようなモデルは、ボットへの挑戦を作成し、技術的に複雑であり、比較的長く、複雑なセットアップ時間、低表面積、多くの場合、シーラントおよびガスケットを必要とするポンプと加圧用の要件などの欠点があります時間無菌性の維持及び複数の実験を実行することができません。しかし、流れ及びせん断のより高いスループットモデルが利用可能であった場合は、血管内皮せん断応答、分子レベルで、特に定期的なせん断研究に大きな進展、より急速に進んだことがあります。簡単に単方向、周期的なせん断応力試験で実験的な反復の数が多いを可能にする比較的大きな表面積を持つ、簡単に組み立て小説、かつ安価な組織培養モデル：ここでは、せん断リングの構造や使用方法を説明します内皮細胞。

概要

シス調節エレメント⁶の活性化、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性⁷と剪断応力応答エレメント^（SSRE）8を介して^{5 -}流体せん断応力は、内皮遺伝子プログラム^1を調節することが示されています。組織因子⁹及び組織プラスミノーゲンアクチベーター^（tPA）10発現を調節することによって、応力の影響を凝固向かっ内皮寄与せん断。せん断応力もPDGF-Bの合成と応答^8を制御^することにより、血管新生¹¹と血管リモデリングの制御に影響を与えます。内皮由来の血管作動性メディエーターのアドレノメデュリン、エンドセリン-1、ウロテンシンIIおよびリラキシンはまた、せん断¹²によって規制されています。内皮型一酸化窒素合成酵素の産生および一酸化窒素産生の転写は、両方のせん断依存¹⁰です。せん断はまた、内皮ICAM-1の発現^13を制御^します。したがってpowerfuでき流れによって誘発されるせん断応力LLY内皮応答の多種多様な影響を与えます。重要なことには、血管の脈動は、現在、正常な血管の老化および血管性認知症¹⁴の形態の両方の病態生理に重要な役割を果たしているように見え、さらに、多発性硬化症¹⁵のような他の神経変性疾患に寄与し得ます。

静脈および動脈の内皮細胞は、本質的に、生体内で多様な血行力学的流動パターンに曝される、多くの異なる内皮細胞表現型は^、16を発揮することができます。流れの大きさと周期性に依存して、内皮細胞への影響は、遺伝子またはタンパク質発現^17,18の変化を反映することができる、炎症性細胞の活性化およびアポトーシスを含むことができます。現象を剪断する内皮細胞応答の研究は、したがって、十分にそのような剪断パターンを生成するインビトロモデルにおける生産の難しさによって複雑に残ります。

多くの異なるexperimeNTALプロトコルは、細胞単層の内皮細胞に流体せん断応力を適用するために開発されています。 ^{21 -}最も一般的に使用されるシステムの一つは、チャンバ¹⁹内に均一な層流を生成する平行プレートフローチャンバーです。蠕動ポンプは、典型的には、典型的には、インビボ ²² 内の多くの場所に流れ特性を再現することができる周期的な流れを作成するために接続されています。他の一般的なセットアップは、流体せん断応力は、コーン²³の回転速度によって決定されます。「コーン・プレート」モデルを使用しています。どちらのシステムも、それらに類似する他の構成は、セットアップし、多くの研究室には比較的高価で、アクセスできなくすることができるコンポーネントを必要とする退屈することができます。

これらの現在のモデルのもう一つの主要な制限は、同時に、比較的低い表面積を有する、それぞれ行うことができる反復試験の比較的少数です。これは、時間と共増加しますこのようなアプローチのmplexity。したがって、単方向および定期的なせん断を誘導する理想的なモデルは、比較的大きな表面積を持つ研究の複製の数が多いが簡単に設定することができます1、それぞれのかもしれません。また、上記のモデルは、多くのユーザーのためにコスト高であってもよい、かなり洗練されたセットアップが必要です。基本的な実験用材料を用いた流体せん断障害を生成することができますモデルは、いくつかの利点があるかもしれません。

単方向、定期的なせん断応力を印加したシンプルかつ非常に経済的な方法は、オービタルシェーカー²⁴上に円形の皿を配置することを含みます。必要に応じて、このプロトコルは、非常に単純であり、研究の反復の高い数字を達成するためにスケールアップすることができ、比較的大きな表面積を持つ各。しかし、皿の中央に位置するセルは、同じ皿の中の混合の細胞表現型の応答を得、周囲に沿って細胞とは異なる流れのパターンにさらされています。

_content ">この現在のレポートでは、「せん断リング」、単方向および定期的なせん断応力を作成するための我々のモデルの構築および使用について説明します。デザインをせん断リングのために効果的に制限「混合」携帯せん断誘発性表現型をフローを制限することにより、内輪の配置を介して周囲に円形の培養皿内経路せん断リングの構成及び動作は簡単で経済的であり、容易に広く利用可能な組織培養用品を使用してオービタルシェーカーの広い範囲に対応するようにスケーリングすることができる。このモデルは、生理学的および病態生理学的なレベル内に一方向と周期的流れパターンを提供するために、内皮細胞実験に適用することができます。

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プロトコル

1. 150ミリメートル直径せん断リングの構築（図1）

注：せん断リングは、異なる総表面積を有するデバイスが得られ、外側及び内側のペトリ皿の大きさを変えることにより、多くの異なる寸法を作成するために構成された細胞収量および剪断力の範囲を開発することができます。このレポートでは、98センチメートル^2（ 図2）の総表面積のための内部100ミリメートル皿と組み合わせた150ミリメートル皿を説明します。

図1.せん断リングアセンブリ。図の上の部分は、部分的に組み立てられたせん断リングを示しています。気密シールが完全に内側と外側の皿との間に形成されていない場合、転送ピペットで3mmの穴を介して塩化メチレンを0.5mlを注入。せん断リングは、内側EDGの周りにシリコーンゴム接着剤の厚さ1mmのビーズを適用することによって遮断シールされていますせん断リングトップの電子。図の下の部分は、組み立てられたせん断リングを示しています。青色メッキ内皮細胞の領域を表します。外側と内側の赤い矢印は、オービタルシェーカー上に配置されたせん断リングの内側せん断リングとメディアの軌道運動を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図150ミリメートルせん断リングのため2.表面の測定（スケールで描かれていない）。トップパネルは軌道回転に応じて、外側のリングに向かって流体の遠心移動を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1. 生成することにより、せん断リング建設テンプレートを作成します。150ミリメートルの円の中心に配置された100ミリメートル、内径とプレゼンテーションソフトウェアで150ミリメートル外側のエッジプロファイル。 A4白い紙にテンプレートを印刷します。
2. ピペットの150mmガラスペトリ皿に塩化メチレン（ジクロロメタン）を10ml。塩化メチレンが、ほとんどのプラスチックを可溶化し、プラスチック部品を結合するために、ここで使用される料理は、ガラスではなく、ポリスチレン（または他のビニルプラスチック）であることが重要です。
   注意：適切なフードの換気をすべての建設のために手袋を使用してください。メチレンクロライドは、接触刺激性であり、肝毒性です。
3. 外側せん断リングテンプレート上に150ミリメートルのプラスチックペトリ皿を合わせます。
4. 回転工具を用いて100 mmディッシュの中央に3mmの穴を開けます。掘削から生成される任意のプラスチックの削りくずを取り除きます。
5. 手袋をはめた手で押さえながら、反転し、約3秒間塩化メチレンのプールに前のステップから100ミリメートルペトリ皿の上縁を浸します。
6. トランス慎重にマークされたテンプレート上に100ミリメートル皿を合わせて、150ミリメートル皿の中央に100ミリメートルディッシュエッジダウンを「濡れる」をFER。塩化メチレンは、100ミリメートルと150ミリメートル皿に参加し、プラスチックを融合します。ゆっくり100ミリメートル皿を時計回りに回転させ、数回反時計回りに150ミリメートル皿に良好な接着性を確保するために。
   注：外皿の中央に内側の皿の適切な位置合わせを確実にするために、十分に注意してください。偏心位置合わせは、剪断環の異なる位置でせん断応力の変動をもたらすことができます。塩化メチレンが誤って100ミリメートル皿の配置中に150ミリメートルペトリ皿の外側のトラック部分の上に滴下することができないように注意してください。これは、流れの乱れを引き起こす可能性がある不均一な表面を作成する、細胞が成長する底面にプラスチックを溶融します。
7. 塩化メチレンを乾燥させた後、オーバー新たにバインドされたペトリ皿を反転し、慎重にそれを確実にするための接点を検査気密シールは、二つのペトリ皿との間に形成されています。
8. 気密シールが完全に形成されていない場合、転送ピペットで3mmの穴を介して塩化メチレンを0.5mlを注入。料理をピックアップし、静かに塩化メチレンがエッジに到達できるようにするには、それを回転させます。
   注：あまりにも速く回転させた場合、塩化メチレンは、細胞が成長する表面を変形とせん断リングを台無しに、150ミリメートル皿の外側部分に波及することができます。漏れたせん断リングは捨ててください。
9. シリコンゴムシーラントの3mmのビーズを適用することにより、100mMの皿穴を密封。
10. フラットカッティングヘッドを取り付けた回転工具を使用して、キャップ下のチューブの少なくとも1cmに残し、15ミリリットルの円錐ポリスチレン組織培養管のトップ3のCM部分をカット。滑らかで平坦な切断ヘッドの平らな面を使用してまで、カットチューブの端を磨きます。粉砕することにより生成される任意のプラスチックの削りくずを取り除きます。
11. 上にカットオフ15ミリリットルにコニカルチューブをトレース約0.5センチメートル離れた皿のエッジからマーカー、と150ミリメートル皿の蓋。円の端からのマージン約1〜2ミリメートル残して、描かれた円の内側の穴を開けます。
12. ドリル穴の上にカットオフコニカルチューブトップを置きます。転送ピペットを用いて、150ミリメートルの蓋にコニカルチューブを結合するために円錐管のカットオフエッジに塩化メチレンの約250μLを適用します。
13. トップペトリ皿の内側の縁の周りにシリコンゴムシーラントの厚さ1mmのビーズを適用することにより、150ミリメートル皿に150ミリメートルのふたを封印。

せん断リングの2滅菌

1. 15ミリリットルコニカルチューブポートを介して新たに形成されたせん断リングにリン酸緩衝生理食塩水のピペットで約10ミリリットル。せん断リングの内側に任意の破片を除去するために周りに渦巻きます。パスツールピペット/真空アスピレーターでリン酸緩衝生理食塩水を削除してください。
2. 破片が除去されるまで、前の手順を繰り返します。
3. steriへせん断リング平安大町、UV照射を用いて70％エタノール洗浄を組み合わせて使用​​します。
   1. アクセスポートを介して通気キャップ、ピペット70％エタノールの約10ミリリットルを外し、バックのキャップをねじ込みます。せん断リングの内側を十分に洗浄することを確認して、複数回回転させ、せん断リング裏返し。
   2. ヒュームフードの下では、過剰70％エタノールを吸引除去します。スプレーボトルを用いて、完全に70％エタノールでキャップし、アクセスポートをスプレー。
   3. 完全に乾燥するまで組織培養フード内にUV照射下でせん断リングとキャップを置きます。
4. 細胞培養めっきに使用するまで乾燥すると、室温でのバックキャップと店舗滅菌せん断リングをねじ込みます。

3.せん断応力の研究

1. 形質転換された内皮細胞株のための4分割比：典型的には1を使用して、標準的な細胞培養プロトコルに従って滅菌剪断環中の内皮細胞をプレート。
   注：ラットの網膜microvascular内皮細胞は、市販のものを入手しました。人間の脳内皮細胞（hCMEC / D3）細胞は博士ピエール・オリバークーロ（INSERM、フランス）からの寛大な贈り物として提供され、完全な内皮基礎培地（EBM）中で培養しました。
2. 文化は前流研究の開始に合流に到達することを可能にします。組織培養培地を30ml（10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシン有するダルベッコ改変イーグル培地）を使用します。 3日おきに細胞培養培地を変更し、7.5％CO ₂および92.5％の室内空気で、37℃で細胞を維持します。
3. インキュベーター中でオービタルシェーカーを置きます。
   注：オービタルシェーカーは、一般的に重いです（> 10キロ）。棚ストレスや振動を最小限に抑えるために、インキュベーターの底棚にオービタルシェーカーを置きます。
4. オービタルシェーカー上で実験的なせん断リングを配置します。同じインキュベータ内部の静的コントロール群せん断リングを配置します。
5. SH内の最大せん断応力を推定式耳リングどこ （単位cm）オービタルシェーカーのために回転半径は、 媒体の粘度（ポアズで）であります （グラム/ミリリットルで）媒体の密度であり、かつ ^24（回転/秒）の回転周波数です。
6. せん断応力印加（ 例えば 、72時間）の所望の期間のためにシェーカー上でせん断リングを残して、希望の回転数（ 例えば、90回転）にオービタルシェーカー上で回転設定を開始します。
   注：オービタルシェーカーは、熱を生成することができますので、インキュベーターの温度は37°Cを実験期間を通して維持されることを保証するために、最初に監視する必要があります。また、Sリングは、環境室（ 例えば 、モジュラーインキュベーターチャンバー）に移し、その後、回転培養器内に配置することができます聞いています。
7. 細胞層は、所望の時間に対するせん断インキュベーターから剪断リングを除去するために露出された後。せん断リングふたをやってのけるし、所望の終点分析（ 例えば、ウエスタンブロット法、蛍光活性化セルソーティングなど ^）25を調べるため、細胞および/またはメディアを取り出します。

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結果

ここでは、せん断リングで培養hCMEC / D3脳内皮細胞およびラット網膜微小血管内皮細胞単層、両方からの代表的な結果を提示します。

hCMEC / D3脳内皮細胞単層を完全EBMでコンフルエンスまで成長させた後、剪断リング72時間オービタルシェーカー上に置きました。ステップ3.5から式を用いて、計算された最大せん断応力

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ディスカッション

剪断する内皮細胞を露出させるためのせん断環系の構築には、せん断応力の試験を実行する簡単な方法です。それにもかかわらず、優れたせん断リングとより良い結果を得るために重要であるいくつかのステップがあります。完全なシールは、サンプル間で矛盾したせん断応力を作成することができ漏れからメディアを防止するために、内側と外側のリングとの間になされるべきです。完全?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 mm plastic tissue culture dish	Corning	430167	The dishes must be polystyrene
150 x 25 mm plastic tissue culture dish	Corning	430599	The dishes must be polystyrene
150 mm glass Petri dish	Fisher	3160150BO
15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes	Falcon	352099
Methylene chloride	Sigma-Aldrich	D65100
silicone rubber sealant	DAP	7079808641
ethanol	Decon	2701
3 ml transfer pipette	Becton-Dickinson	357524
printer paper
scissors
gloves
rotary tool and set	Dremel	4000-6/50
rotary tool cutting head	Dremel	EZ476
rotary tool drill head
distilled water
orbital shaker	VWR	57018-754
incubator
Rat retinal microvascular endothelial cells	Cell Biologics	RA-6065