リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

要約

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

要約

Scramblasesは、ATP非依存的に双方向膜二重層を横切ってリン脂質を移動さ。識別され、生化学的に検証された最初のスクランブラーゼはオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質でした。ロドプシンは、光の知覚の原因である網膜の桿体ディスク膜に局在するGタンパク質共役受容体です。ロドプシンのスクランブ活動、 すなわち 、そのリガンド11- シス -レチナールに依存しない、アポタンパク質オプシンは、スクランブラーゼとしても活躍。スクランブリング構成および調節リン脂質は、細胞生理学において重要な役割を果たしているが、わずか数リンscramblasesこれまでオプシン他に特定されています。ここでは、オプシンのスクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイを記載しています。オプシンは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及び蛍光NBD標識PCの微量（1-Pで構成される大単層リポソームに再構成され、almitoyl -2- {6- [7-ニトロ2-1,3ベンゾオキサジアゾール-4-イル）アミノ]ヘキサノイル} - SN -glycero -3-ホスホコリン）。スクランブラーゼ活性は、小胞の内部小葉に位置NBD-PCの分子はその蛍光が化学的に膜を通過することができない還元剤によって除去される外層にアクセスすることができる程度を測定することによって決定されます。我々が説明した方法は、一般的な適用性を有しており、他の膜タンパク質のスクランブ活動を特定し、特徴付けるために使用することができます。

概要

光受容体ロドプシン、（参照^1、例えばレビュー）プロトタイプのGタンパク質共役型受容体は、同定され、生化学的に^2,3を検証するための最初のリン脂質スクランブラーゼです。 Scramblasesは、双方向、ATPに依存しない方法^4-6で二層間のリン脂質の動きに、生理学的に適切なレベルの本質的に遅い速度を向上させるリン脂質トランスポーターです。彼らの行動の例としては、小胞体および構成スクランブリングは、膜の恒常性と成長のためだけでなく、グリコシル化経路⁵の様々なために必要とされる細菌の細胞質膜で見つけることができます。規制リン脂質スクランブリングは、それが、マクロファージ⁷は、「食べる・私」-signalとして作用し、タンパク質因子の産生を触媒する活性化血小板の凝血促進表面を提供する、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリン（PS）を露出させるために必要とされます血液凝固に必要なのです。感光ディスク膜に、ロドプシンのスクランブル活性は、ATP依存性により生成される二重層の二つの膜リーフレットの間のリン脂質の不均衡を相殺することが提案されている、一方向性脂質は、ABCA4 ^{4,8,9 10-12}フリッパーゼ。

ロドプシンは、原形質膜でのPS露出のために必要²⁺依存性scramblasesが（参照して見直さ^2、TMEM16タンパク質ファミリーのメンバーは、Caとして同定された感光体ディスクでスクランブラーゼとして報告されるまでscramblasesの生理学的重要性にもかかわらず、彼らのアイデンティティはとらえどころのないままでした^13）、および細菌タンパク質FTSWは、ペプチドグリカン合成¹⁴のために必要な脂質IIスクランブとして提案されました。これらの発見は、方法論のdescribを使用して、得られたプロテオにおけるリポソーム及びスクランブ活動のデモンストレーションで精製されたタンパク質の再構成に基づいていましたここ編。他の潜在的なscramblases ^15-21 -ペプチドグリカン生合成に関与MurJとAMJタンパク質、WzxEとO抗原前駆体をスクランブリングに関与し、関連するタンパク質、細菌の細胞質膜を横切ってアミノアシル化ホスファチジルを移行することが必要なMprFタンパク質、および提案されているXkr8ファミリーメンバーアポトーシス細胞の表面上にPSを露出させるためには、 - 生化学的に試験されていません。これは、スクランブ活動を識別し、特徴付けるための堅牢なアッセイの重要性を強調しています。

ここでは、精製されたオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質、大型単層小胞（LUVを）に、蛍光ベースのアッセイを使用して、得られたプロテオリポソー​​ム内のスクランブ活動のその後の分析の再構成を説明します。いくつかのよく記載されているプロトコルは、したがって、私たちはしません、オプシンの異種発現および精製のための文献で利用可能がありますこのプロトコルでそれを記述。我々は約100ngでFLAGタグ、耐熱性オプシン得ゴーレンら ³に記載^されたプロトコルを使用/ 0.1％μL（w / v）のドデシルマルトシド（DDM）。

再構成は、彼らが膨潤するが溶解しないように、十分な洗剤でたLUVを処理することにより達成されます。これらの条件下では、膜タンパク質 - タンパク質 - 界面活性剤ミセルの形態で供給される - は、リポソーム内に統合し、プロテオリポソー​​ムを生じ、界面活性剤の除去時にリポソーム膜に再構成となるであろう。 （0.1％（w / v）のDDMで精製タンパク質として得られる）オプシンを再構成するために、たLUVはPOPC（1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン）とPOPGの混合物（1-から調製されますパルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3- [ホスホrac-（1-グリセロール）]）とオプシンとNBD-PCを追加する前に、DDMで飽和。界面活性剤は、その後、ポリスチレンビーズとサンプルを処理することによって除去されます。

LASS = "jove_contentは">蛍光ベースのアッセイの基礎となる原理は、図1Bに示されています。 LUVをは対称的にNBD-PCまたは他のNBD標識蛍光リン脂質レポーター（ 図1A）の微量で再構成されています。ジチオナイトを追加することで、NBDのニトロ基のような膜非透過性ジアニオン、LUVをの外側のリーフレットにおけるNBD-PC分子がレンダリングされる非蛍光は、非蛍光アミノ基に還元されます。 NBD-PC分子もジチオンいずれも実験（<10分）の時間スケールで膜を通過することができるように、これは、蛍光シグナルの50％の減少をもたらします。リポソームをスクランブで再構成されている場合は、内部リーフレットにおいてNBD-PCの分子は、それらが低減されている外部に迅速にスクランブルすることができます。これは、理想的な場合（ 図1C）における蛍光の総損失をもたらします。

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図1：スクランブラーゼ活性アッセイの概略図アッセイは、蛍光NBD標識化レポーター脂質を使用しています;。 NBD-PCが示されている（A）。大型単層小胞は、NBD-PCの微量で再構成されています。再構成は、外側と内側のリーフレットに均等に分配NBD-PCで、対称的な小胞を生成します。亜ジチオン酸（S ₂ O ₄ ^2-）は 、化学的に非蛍光アミノ基とNBDのニトロ基を低減します。ジチオン酸は、負に帯電し、NBD-PCの分子と反応する膜を通過することはできません：外葉で唯一のNBD-PC分子が低減されるので、ジチオナイト（B、上）とのタンパク質を含まないリポソームの治療は、蛍光の50％の減少を引き起こします内側のリーフレットインチオプシン含有プロテオリポソーム（B、下）、 すなわち 、スクランブラーゼ活性のプロテオリポソーム、Fの100％損失の結果の亜ジチオン治療オプシンとしてluorescenceは、内側と外側のリーフレットの間NBD-PCの移動を容易にします。 （C）は、亜ジチオン酸でタンパク質を含まないリポソームとオプシン含有プロテオリポソームを処理して得られた理想化された蛍光トレースを示します。蛍光損失率は、亜ジチオン酸によるNBDの化学的還元は、スクランブリングは、化学反応の速度以上の速度で発生し、その律速であることを示す両方の場合で同じです。実際の実験から得られたトレースを図3に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

我々が説明した方法は、他の精製されたタンパク質、ならびに界面活性剤²²とミクロソームを抽出することにより、例えば、得られた膜タンパク質の混合物を再構成し、アッセイするために使用することができます。

プロトコル

リポソームおよびプロテオリポソー​​ムの調製

1. リポソーム生成
   1. ガラスシリンジを使用して、POPCのモル比で52.5モル脂質を得るために、丸底フラスコに（クロロホルム中、25 mg / mlで）および160μlのPOPG（クロロホルム中、25 mg / mlで）1,435μlのPOPCを追加：POPG = 9：1。
   2. （何の水浴を溶媒のこのボリュームのために必要とされていない）145回転の回転速度で回転蒸発器を用いて30分間、脂質を乾燥させ、次いで、室温で、一晩、少なくとも3時間、または真空デシケーターにフラスコを転送（RT）。
   3. 穏やかに均質な、濁った懸濁液が得られるまで、フラスコを旋回することによって、50mMのHEPES pH7.4中、100mMのNaCl（以下、緩衝液Aと称する）の10mlの乾燥した脂質フィルムを水和。
      注：この段階で脂質濃度は、全く損失がこれまでに発生していないはずですとして5.25 mMのことが予想されます。
   4. 周波数Oで室温で10分間水浴中懸濁液を超音波処理40 kHzのF。解決策は、やや明確になります。
   5. 押出機を用いて、200 nmの細孔サイズを有する膜を介して4パスで押し出しの第2サイクルに続いて、400 nmの細孔サイズを有する膜を通して懸濁液を10回通過します。
      注：結果LUVをの平均直径は〜175 nmです。必要であれば、たLUVのサイズおよび均質性は、製造業者の指示に従って、動的光散乱によって確認することができます。
   6. 1.2節で説明したように）LUV懸濁液のリン脂質濃度を定量化します。
      注：押出時の損失のため、濃度は通常約3.6 mMであるため。
   7. すぐに使用しない場合は、約4℃で2週間LUVを保管してください。
2. リン脂質定量
   注：リン脂質再構成するために使用LUV懸濁液の濃度だけでなく、最終的に生成されたプロテオリポソー​​ムのことを決定するために、試料のアリコートはsubjeです過塩素酸による酸化にCTED。この手順は、その後、標準²³と比較して比色アッセイによって定量化された無機リン酸を放出するためにリン脂質を分解します。
   1. 脱イオン蒸留水にリン酸ナトリウム（のNa ₂ HPO _4）の40mMのストック溶液を準備します。
   2. 4 mMのと校正標準となるソリューションをワーキング0.4 mMのを得るために、脱イオン蒸留水で原液を希釈します。
   3. 作業溶液を用いて、50μlの最終体積で0から80までの13×100 mm ²のガラス管中で基準nmolのリン酸ナトリウムを調製します。
   4. LUVおよびプロテオリポソームサンプルのそれぞれを定量化する10μLを取り、13×100ミリメートル²ガラス管中のddH ₂ O40μlので希釈しました。
      注：LUVをし、プロテオリポソー​​ムの脂質濃度が範囲内にあるように2.5-5μM、10μlのサンプルは、25-50ナノモル脂質のリンを含むべきです。
   5. 加熱ブロック中で145℃で1時間の標準およびサンプルや熱のそれぞれに300μlの過塩素酸を追加します。蒸発を防ぐために、チューブにビー玉を入れてください。
   6. チューブを室温まで冷却してみましょうとのddH ₂ Oの1ミリリットルを追加
   7. 400μlの新たに調製した12グラム/ Lのモリブデン酸アンモニウムと50グラムの各/ミックスするLアスコルビン酸ナトリウムと渦を追加します。
   8. チューブの上にビー玉で100℃で10分間加熱します。加熱ブロックからチューブを取り外し、それらを室温まで冷却しましょう​​。
   9. 797ナノメートルの波長での分光器でブランク（0 nmolのリン酸ナトリウムを含む標準試料）に対するサンプルの吸光度を測定します。
   10. 校正標準曲線に対するサンプルのリン酸含量を決定します。
3. オプシンの再構成
   注：これらは、同様に、界面活性剤の性質に依存するように、再構成のための最適な膨潤条件を決定する必要がありますLUVをの脂質組成や濃度など。 LUVをプロセス膨潤にそれらの光散乱特性を変更するとリゴーとレヴィ²⁴とGeertsma ら ²⁵によってレビューとして吸光度（ 図2）を測定することによってモニターすることができます。
   1. ピペットLUVを800μlの（セクション1.1から、押出成形後の脂質回収率が70％であるとして、LUVをの予測濃度が3.6 mMのリン脂質である）2ミリリットルマイクロチューブに。
   2. バッファAの5.3μlを、10％の34.7μlを添加し（w / v）のDDMは、緩衝液Aに溶解しました
   3. 転倒混合しながら室温で3時間インキュベートします。
   4. 一方、ポリスチレンビーズを準備します。
      1. サンプルあたりのビーズの400ミリグラムを使用し、ガラスビーカー中でそれらを量ります。
      2. 水、メタノールで二回三回洗っ一度緩衝液Aを用いて、各洗浄工程で使用するための液体を5ml、10分間ゆっくり撹拌します。
         注：ポリスチレンを準備することをお勧めします一度に複数のサンプル、 例えばのためのビーズは、ビーズの6グラムで重さと液体の75ミリリットルで洗浄します。過剰のビーズは数日間冷蔵庫で保存することができます。
   5. サンプルあたり、NBD-PC（クロロホルム中1 mg / mlで、9.5μlのは0.4モル％をもたらす：小胞の不安定化の最後の30分の間、スクリューキャップのガラス管（ '再構成ガラス管'）におけるNBD標識リン脂質を乾燥総リン脂質の）ガラス管に、窒素気流下で乾燥させ、続いて緩衝液A中の0.1％の45μL（w / v）のDDMで溶解
   6. 小胞の不安定化の3時間後、DDM可溶化タンパク質を溶解-NBD標識リン脂質を追加し、1 mlの最終容積は、 すなわち 、7 mMの、DDM（w / v）の0.36パーセントを含有するようにバッファ。
      1. したがって、（0.1％DDMに溶解）NBD-PCの45μlを、0.1％のDDMとバッファAの55μlと60μlを添加（対照サンプルとして使用される）タンパク質を含まないリポソームを生成します。プロテオのための試験のために、追加しますPLE、0.1％DDMで（〜110 ngの/μlでの典型的なストック溶液から）は、タンパク質の40μlを、NBD-PCの45μlを（0.1％DDMに溶解）を、0.1％DDMとバッファAの55μlの20μlの。
         注：記載されている添加の順序は次のようになります。
   7. 室温で端部の上に追加の時間の終わりのためのサンプルを混ぜます。
   8. 準備されたポリスチレンビーズの80ミリグラムを追加し、転倒を室温で1時間混合したサンプルをインキュベートします。
   9. 次ポリスチレンビーズの追加の160ミリグラムを追加し、転倒を室温でさらに2時間混合しながらインキュベートします。
   10. 新鮮なポリスチレンビーズの160 mgのガラススクリューキャップチューブに（背後に費やされたポリスチレンビーズを残して）サンプルを移し、4℃で一晩を混ぜます。
       注：サンプルを転送し、ビーズを吸い取っ回避する最も簡単な方法は、小さな正の圧力でガラス管の底に押されたパスツールピペットを使用することです。ピペットの先端がでしっかりとしたらチューブの底部は、その後、サンプルは、ビーズからの干渉を受けることなく、容易に取り出すことができます。
   11. 翌朝は、スクランブラーゼ活性アッセイの準備のために氷の上でビーズや場所に運ぶことなく、マイクロチューブにサンプルを移します。

2.スクランブラーゼ活性アッセイ

注：緩衝液Aで希釈したリポソームまたはプロテオリポソー​​ムの蛍光強度は、蛍光分光計で亜ジチオン酸を添加して経時的にモニターされます。安定した開始強度を得るために、蛍光を絶えず撹拌試料に亜ジチオン酸塩を添加する前に、少なくとも50秒（または安定した信号が得られるまで）のために記録され、その後、亜ジチオン酸塩を添加した後、少なくとも500秒間続きます。

1. ミニ撹拌棒を含むプラスチックキュベットに緩衝液Aの1950μLを加えます。
2. 準備されたプロテオ（リポソーム）の50μLを加え、サンプルは蛍光分光で平衡化しましょういくつかの秒間一定に撹拌しながらメートル。
3. 2つの標本がマイクロチューブに亜二チオン20mgを秤量し、使用直前に114μlの氷冷0.5 Mトリスに溶解し、次の氷上に保つために一方0.5 Mバッファなしのトリス（ 例えば、1 M亜ジチオン酸の溶液を調製サンプル）。
   注：亜ジチオン酸溶液は新たに調製されなければならないと調製後20分以上を使用するべきではありません。多くの測定が行われるべき場合、ジチオナイトのアリコートを、予め秤量し、使用直前に溶解させることができます。
4. （励起470nmで、発光530nmで幅0.5 nmのスリット）蛍光モニタリングを開始します。
5. 記録蛍光（可能であればキュベットチャンバーの蓋にセプタムを使用）を開始した後、キュベット50秒に1 M亜二チオン酸溶液40μlを加え、さらに400から600秒間蛍光を記録し続けています。
6. セクション3で説明したようにデータを分析します。

3。データ分析

1. スクランブルの速度論
   1. 初期蛍光を定義することによって、スクランブ活性アッセイによって得られた各試料の蛍光トレースを特徴付ける_、F、I、亜ジチオン酸塩を添加すること、およびエンドポイント蛍光Fは、到達する前に> 400秒後。 F _iは 、前の亜ジチオン酸の添加30秒の期間についての蛍光の平均値として、各サンプルについて決定されます。
   2. _私は 、蛍光減少の程度に対応するエンドポイントデータを決定し、R = 100•F / _F。我々はオプシン含有プロテオのためにタンパク質を含まないリポソームおよびR _Pのための用語のR _Lを使用します。
2. 機能的に再構成スクランブラーゼの分子量を測定します
   1. 蛍光減少データは、以下の式に従って変換します。
      P（≥1スクランブ）=（R _P - R _{L）/（R 最大} -のR _L）（式1）
      注意：R _maxは 、十分なタンパク質が試料中のすべての小胞は、少なくとも一つの機能スクランブを有するように再構成されたときに得られる最大の減少であり、pは、再構成された試料中の特定の小胞は、「スクランブ活性」される確率である場合、 すなわち 、それは、少なくとも1つの機能スクランブを有しています。 R _{maxは、（R maxは}実験的>に1mg /ミリモルのPPRとオプシンプロテオのために決定することができる）の代わりに期待100％で、一般的に82.5パーセント³であるのに対し、R _Lの値は、一般的に^45％3です。 R _maxと<100％は、小胞の亜集団は、再構成に対して不応性であることが想定されます。 R _最大 = 82.5パーセントのために、タンパク質を受け入れることができない小胞の割合は0.35です。
   2. 次のようにポアソン統計によりp（≥1スクランブラーゼ）およびPPR（mgタンパク質/ミリモルのリン脂質）との関係を説明します。
      P（≥1スクランブ）= 1 - 電子 -m = 1 - EXP（-PPR /α）（式2）
      注：ここで、M =小胞あたりscramblases数およびmgタンパク質/ミリモルのリン脂質の単位でα=単一指数フィット定数。
   3. 小胞の割合としては、（説明を参照）でも高いPPRでスクランブルに寄与しないに式を変更します。
      P（≥1スクランブ）= 1 - expの（-PPR * /α）（式3）
      注：PPR * = PPR /（1- f）は 、fは小胞の耐火集団であるか、この場合には、PPR * = PPR / 0.65（式4）。
      注：適合定数αは単一指数関数とPPR *に対するP（≥1スクランブ）のグラフをフィッティングすることによって決定されます。オプシン（分子量41.7キロダルトン）は機能的に175 nmの直径の小胞に再構成する場合は、モノマーとして、α= 0.187ミリグラムミリモル^-1（各小胞は28万リン脂質^26を有しています）。スクランブラーゼ活性の小胞を得るために^3を再構成のためにオプシンの二量化は、従来であれば、その後α= 0.37ミリグラムミリモル^-1。 PPRはなくPPR *は、分析のために使用された場合には、対応するαの値は、0.122と0.244ミリグラムミリモル^-1です。 αのためのこれらの予測値は、すべてのオプシン分子が機能的に有能であることを前提としています。分子の一部のみが、脂質をスクランブルする能力である場合、αの対応する値が大きくなります。

結果

我々は、蛍光ベースのアッセイを使用して、そのスクランブ活動を特徴づけるためたLUVへオプシンの再構成を説明します。私たちは、スクランブルオプシン媒介リン脂質の速度に下限を配置するとオプシンは、機能的に小胞に再構成したオリゴマー状態を決定するために、結果を分析します。

最適な再構成条件を特定す?...

ディスカッション

スクランブラーゼ活性アッセイは、オプシンは、リン脂質スクランブラーゼ活性^2を持っているかを決定するために、もともと私たちを可能にしました。アッセイはまた、（私たちは、図1AにNBD-PCのために示すように、アシル鎖にNBDで標識されたようなNBD-ホスファチジルエタノールアミンなどのNBD標識化レポーター脂質、さまざまなを使用、または上で私たちは、特異性?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 ml Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS