無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em&gt; ex vivoで</em&gt;生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

要約

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

要約

生体材料の開発は、膵臓β細胞を含む、細胞および組織型の様々な標的化薬物送達の可能性を大幅に増加しています。また、生体材料の粒子、ヒドロゲル、および足場はまた、培養及び移植された組織モデルでβ細胞に対する持続的な、制御可能な薬物送達を管理するためのユニークな機会を提供します。これらの技術は、無傷の膵島と翻訳関連システムを使用して、候補β細胞増殖因子の研究を可能にします。また、培養系でβ細胞増殖を刺激するための候補因子の有効性と実現可能性を決定することは、in vivoモデルを楽しみに移動する前に重要です。ここで、我々は、関心のある生分解性化合物（COI）で無傷のマウスの膵島は、その場放出 O の持続的効果を評価する目的で、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）ミクロスフェア-loaded共培養する方法が記載さβ細胞の増殖に対するF分裂促進要因。この技術は、市販の試薬を用いて所望のカーゴを含有PLGA微小球を生成する方法を詳細に記載しています。記載された技術は、例えば、組換えヒト結合組織成長因子（rhCTGF）を使用しながら、COIの多種多様を容易に使用することができます。さらに、この方法は、β細胞増殖を評価するために必要な試薬の量を最小限にするために96ウェルプレートを使用します。このプロトコルは、容易にそのような細胞生存および分化の状態のような代替の生体材料及び他の内分泌細胞の特徴を使用するように適合させることができます。

概要

膵β細胞は体内で唯一のインスリン産生細胞であり、血中グルコース恒常性を維持するために重要です。健康な個体は、十分なβ細胞塊を有し、適切に血糖値を調節するように機能するが、糖尿病を有する個体は、不十分なβ細胞の質量および/または機能^1,2を特徴とします。 β細胞の増殖を誘導することは、最終的にβ細胞量を増加させ、糖尿病の³を有する個体においてグルコース恒常性を復元することができることが提案されています。効果的な治療法が開発される前に、しかし、無傷の膵島における潜在的なβ細胞増殖性化合物の評価と検証が必要です。糖尿病を持つ個人に死体ヒト膵島の移植はしばらくの間、血中グルコース恒常性を復元しますが、この実験手順の可用性と成功は、移植のために利用可能なヒト膵島の不足によりおよび膵島の後方におけるβ細胞死によって妨げられていますER移植^4。でもインスリン産生細胞の増殖を誘導する因子の発見で、主な課題は、まだin vivoでの関連サイトにこれらの要因を配信中に存在します。 β細胞増殖化合物の持続的局所送達のための1つの戦略は、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）です。 PLGAは、高い安全性、生分解性、および持続放出動態⁵による薬物送達製品を承認FDAに使用の歴史を有します。具体的には、PLGAは、 インビボまたは天然に体内で代謝産物を発生している乳酸およびグリコール酸への培養物のいずれかの水で加水分解により劣化ラクチドとグリコリドの共重合体です。封入された薬物化合物は、拡散および/または分解制御放出機序の両方によって、周囲の環境に放出することができます。 COIのカプセル化はunencapsulaに比べ試薬の生物学的利用能を向上させる、酵素分解に対する保護を提供していますテッドCOI ^5。我々は、PLGAミクロスフェアは、培養において、最終的にインビボで無傷の膵島に候補化合物を投与するために使用され得ることを示唆しています。移植プロトコルが模索される前に、ex vivoでの膵島するβ細胞マイトジェンを管理するためにPLGAの有効性をテストすることが重要です。

現在、生きた動物におけるβ細胞の増殖を測定するために何の技術がありません。 in vivoでの潜在的な増殖性化合物の有効性を評価するための実験は、したがって、免疫標識のための膵臓のその後の解剖および処理で、動物を生きるために、これらの化合物の投与を必要とします。そのようなプロトコルは、高価で面倒であり、そしてそれらは島に到達するという保証なしに、全身的に投与される化合物を必要とします。逆に、いくつかの不死化β細胞株は、培養物中のインスリン産生細胞の研究に利用可能であるが、これらの細胞株は、膵島アーキテクチャとenvironmenを欠きますtは生物⁶で見つかりました。不死化β細胞株はまた、このようにして増殖を誘導する化合物の分析を複雑に、 インビボでの内因性のβ細胞よりも複製の非常に高い程度を有することを特徴とします。本研究では、成体マウスから単離された無傷の膵島を使用するプロトコルを記述します。 β細胞株とは異なり、無傷の膵島は、通常の膵島アーキテクチャを保持しています。同様に、培養された無傷の膵島に直接増殖性化合物を投与すること、in vivoで行った実験とは対照的には、かなり正確にβ細胞増殖を測定する必要がある試薬の量を減少させます。

現在の研究は、この例では、COIを投与するためにPLGAを使用し、組換えヒト結合組織成長因子（rhCTGF）。それは目への化合物の継続的な放出を可能にするとして、ここで説明する方法は、培養された膵島への原料化合物を投与する上で重要な利点を付与します電子メディア。特に、このアッセイは、タンパク質と、無傷島に対する目的の抗体の多種多様を投与するために改変することができます。 α細胞を含む他の内分泌細胞型への影響も分析することができます。

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プロトコル

すべての手順は、承認され、ヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会に従って行われました。

フルオロフォアで1ラベリングCOI（オプション）

1. マイクロスフェアの貨物を可視化するために、このようなスクシンイミジルエステルまたはフルオレセイン誘導体として（タンパク質に、 例えば ）無料の第一級アミンと反応する蛍光色素を、選択してください。ジメチルスルホキシド（DMSO）200μlの中に蛍光体の（COIのモル数に対して）8倍速モル過剰に溶解します。
2. 再懸濁ビヒクル溶液中の800μlの最終容量（62.5 ngの/μlの最終濃度）までのCOI 50mgの。ビヒクル溶液はCOIのソースに依存して変化します。
   注：典型的なビヒクル溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはDMSOを含みます。
3. ステップ1.1からフォア/ DMSO溶液のすべてを追加し、COIを懸濁します。ボルテックス4℃で一晩。あるいは、反応混合物を室温でボルテックス4時間（RT）。
4. 標識反応の後、脱塩カラムを使用して、過剰な蛍光団を削除します。
   1. 脱塩カラムから保存バッファーを排出し、脱イオン水16ミリリットルですすいでください。介してすべてのフローを捨てます。
   2. 脱塩カラムに蛍光標識されたCOIを追加します。脱イオン水1.2ミリリットルで溶出し、フロースルーを収集します。
   3. 反復溶出工程をさらに4回、毎回脱イオン水1.2 mlで添加し、別個のサンプルとしてフロースルーを集めます。
   4. -80℃でサンプルを介して収集されたすべてのフローを凍結し、24時間、製造業者の説明書に従って凍結乾燥。

2.水中油中水エマルション液中乾燥法を介してマイクロスフェアの準備をCOI-ロード

1. 最初の水相（W1）を形成するために脱イオン水100μlに1ミリグラムの蛍光標識されたCOIを追加します。
2. ポリ（乳酸 - コ - グリコールACIの65ミリグラムを溶解させますD）（50:50ラクチド：グリコリド、分子量が54000 - 69000）マイクロ遠心チューブ中のジクロロメタン750μlのインチ10 Ultrasonicate - 30秒（160 Wで）完全にPLGAを溶解します。これは、油相（O）を形成します。
3. 滴下方法でO相にステップ2.1で生成されたW1段階のすべてを追加します。 W1 / O相を形成するために30秒間20,000rpmで手持ち式ホモジナイザーを用いて乳化します。
4. 30秒間20,000rpmで1％15mlの（重量/体積）水性ポリ（ビニルアルコール）（PVA）の溶液に滴下様式でW1 / O相のすべてを追加し、手持ち式ホモジナイザーを用いて乳化。
5. 溶媒を除去し、水相を生成するために1時間ロータリーエバポレーターを用いて635 mmHgで真空200 mlの丸底フラスコに、被験者を、ステップ2.4において生成乳剤の全てを転送します。
6. アリコート14マイクロ遠心チューブにステップ2.5で生成された水相の1ミリリットル。 7500でのマイクロ遠心チューブ中の水溶液を遠心分離8分間のXG。
   注：このステップでは、マイクロスフェアは、残りの水溶液中に存在し、マイクロチューブの底部に集中しています。
7. マイクロチューブの底にマイクロスフェアを乱さないように注意しながら、マイクロピペットでマイクロ遠心チューブからピペット操作を水溶液の900μLを削除します。
   1. 各マイクロチューブに脱イオン水を1ミリリットルを添加することにより、過剰PVAのマイクロスフェアを洗います。マイクロチューブの底にマイクロスフェアを乱さないように、8分間の7500×gで遠心分離し、そして再び慎重に、マイクロピペットでマイクロ遠心チューブからピペット操作を水溶液の900μLを削除します。
      注：残りの100μlの水溶液が生成されたマイクロスフェアが含まれています。
8. -80℃でのステップ2.7で生成された水性マイクロスフェア液をフリーズします。
9. メーカーのに従って凍結乾燥機を使用して凍結乾燥マイクロスフェア-20℃での命令とストア。
   注：完全にPLGAミクロスフェアを溶解し、遊離タンパク質⁷の標準曲線にタンパク質濃度を相対的に決定することにより、COIの積載効率を測定します。
10. 陰性対照として、（以下、コントロールミクロスフェアとも呼ばれる）「ブランク」微小球のバッチを生成します。
    注：コントロール微小球の生成はステップ1.2でビヒクル溶液800μlのに無COI加えて、親水性のCOIを充填したミクロスフェアの生成と同じです。 β細胞マイトジェンアッセイのためのCOI-ロードPLGAミクロスフェアへのPLGAの質量濃度のマッチ制御粒子。

膵島培養培地とプレ検定メディアの調製

1. 無傷のマウスの膵島の培養のために200ミリリットルのメディアを準備します。あるとして11 mMグルコース、10％ウマ血清、100 U / mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシン（を加えたRPMI 1640培地は、以下に言及）培地をしましょう。
   注1：ウシ胎児血清（FBS）とは異なり、ウマ血清は、胎盤ラクトゲン、増殖アッセイにおいて分析し混乱させるβ細胞増殖の誘導因子を欠いています。
   注2：PLGAミクロスフェアを使用する前に滅菌されていないように、培地に抗生物質の添加は、微生物汚染を避けるために重要です。
2. 50ミリリットルコニカルチューブの電子ピペッターと場所で膵島培養培地の25ミリリットルを削除します。予備アッセイ培地を生成するために0.2mMのEGTAの最終濃度で50mlコニカルチューブ中の膵島培養培地25mlのを補います。
   注：EGTAの添加は、穏やか膵島アーキテクチャを変更することなく、膵島における細胞 - 細胞接触を緩めます。これは、島の内側の細胞に到達することができCOIを確保することができますし、中央の島の壊死を防ぐのに役立ちます。

無傷のマウス膵島の4培養

1. 事前に選択された菌株、性別、AGから無傷の膵島を分離しますE、および膵臓^8,9のルーチンコラゲナーゼ消化後のマウスの遺伝子型。プールは一緒にサンプルなどから膵島。
2. アリコート膵島培養培地200μl中、96ウェル組織培養プレートの1ウェルに40小島。ウェルあたり視覚サイズマッチ小島（サンプル間の膵島等価（IEQ）の正確な評価は必要ありません）。蒸発バッファを提供するために、200μlの滅菌水で小島を有するウェルのすぐ隣に空の井戸を埋めます。培養物は、95％空気および5％CO ₂の雰囲気下で一晩37℃で培地中で膵島。

COI-ロードされ、制御PLGAミクロスフェアの5.再サスペンション

1. 一晩膵島回復した後、再懸濁したマイクロスフェアマイクロチューブ内のCOIの最終濃度は、所与の量では10ng /μlの（COIの存在量であるように、凍結乾燥COI-ロードPLGAミクロスフェアの1つのアリコートに予め検定メディアを追加することにより、生成されたマイクロpheresはステップ2.9）で決定しました。 4℃で10秒の長いパルスで160 Wで10分間、氷水浴中で再懸濁COIを充填したミクロスフェアを超音波処理します。
2. 凍結乾燥制御PLGAミクロスフェアの等質量にプリアッセイ培地の同じボリュームを追加することによって再懸濁制御PLGAミクロスフェア。 4℃での10秒の長いパルスを160 Wで10分間、氷水浴中で再懸濁制御PLGAミクロスフェアを超音波処理します。
3. 視覚的にマイクロスフェアは、2をカバーガラスの間に再懸濁させたマイクロスフェアの2μLをピペットで分散していることを確認します。落射蛍光または明視野顕微鏡で40倍の対物レンズを用いたマイクロスフェアを可視化します。
4. 微小球の有意な凝集がまだ表示されている場合は、4℃で10秒の長パルスおよび再懸濁したマイクロスフェアの繰り返し可視化とW 160でさらに10分間、氷水浴中で超音波処理。

COI-ロードまたは制御PLGAミクロスフェアと島の6治療

1. よくCOIを充填したミクロスフェアを用いて治療される毎に、100μlの及び予め決め最終濃度の最終体積を10ng /プレアッセイ培地で再懸濁COIマイクロスフェアのμLを希釈することによってアッセイ培地を調製します。
   注：タンパク質の最適な最終濃度は、このアッセイに使用される各COIごとに異なります。理想的には、最終濃度の範囲を試験します。
2. 各ウェルをコントロールとして使用されるためには、ステップ6.1でCOIを充填したミクロスフェアを希釈するために使用したのと同じ希釈体積のステップ5.2で生成された再懸濁した制御PLGAミクロスフェアを希釈することによって制御アッセイ培地を準備。
   注：コントロールアッセイ培地で処理された膵島は、ブランクマイクロスフェアは、実験結果に持つかもしれない影響の検出を可能にするために、陰性対照として機能します。
3. 慎重に何の膵島をウェルから除去されないように、マイクロピペットで各ウェルからの膵島培養培地100μlのを削除します。静かに100μを追加各ウェルにアッセイ培地またはコントロールアッセイ培地100μlをリットル。
4. 三日間、95％空気および5％CO ₂の雰囲気下、37℃で島をインキュベートします。

7.顕微鏡スライド上に無傷の膵島を分散

1. 3日後、膵島を除去しないように慎重にすべてのウェルからアッセイ培地を除去し、廃棄するためにマイクロピペットを使用しています。ゆっくりアッセイ培地のそれらを洗浄する小島に200μlのPBSを追加します。慎重に取り外し、マイクロピペットでPBSを捨て、ゆっくりと追加の200μlのPBSで再び島を洗います。
2. 削除し、マイクロピペットでPBSを破棄し、0.025％トリプシンを100μl、2mMのEDTA溶液を追加します。 3分間室温でインキュベートします。ピペットは、トリプシン-EDTA溶液アップと小島が視覚的に単一細胞に分散していることが確認されるまで、ダウン2分ごとに島を光学顕微鏡を用いて、（細胞のいくつかの小さな塊がまだ存在していてもよいことに注意してください）。各ウェルの個々のボリューム全体を転送LY標識 - マイクロ遠心チューブに。
3. トリプシン媒介細胞解離を停止するには、各マイクロチューブに膵島培養培地400μlのを追加します。
4. 微量遠心管の底に膵島細胞をペレット化するために4℃で100×gで5分間遠心サンプル。
5. 静かにマイクロピペットを用いて上清を除去し、200μlの新鮮膵島培養培地中でペレットを再懸濁。
6. CYTO-遠心分離機を用いて、遠心分離は、帯電した顕微鏡スライド上に3分間140×gで島を解離しました。
7. 室温で空気乾燥したスライドは、10分間、その後、疎水性マーキングペンで解離した島の周りにボックスを描画します。
8. 室温で10分間75μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定してください。 4％PFAを外し、静かに75μlのPBS 2回で細胞を洗浄します。洗浄後、75μlの0.2％トリトンX-100 PBS中で10分間で細胞を透過性。その後、75μlのPBSで細胞を洗浄。
   注意：PFAは、アレルギー性の発癌性、および毒性があることが知られています。

インスリンおよび細胞増殖マーカー、Ki67について解離島の8免疫蛍光標識化

1. 100スライド容量顕微鏡スライドボックスの下部に2湿った紙タオルを置くことによって、湿潤チャンバーを準備します。
2. 場所は、加湿チャンバー内でダウンフラット（上を向い細胞）をスライドさせます。検体に対する抗体の非特異的結合をブロックするために、各スライドに（PBS中の5％正常ロバ血清（NDS））マイクロピペットを用いて、前の洗浄段階からPBSを吸引し、ブロッキング溶液の75μlのを追加することによって、標識化のためのサンプルを準備します。 RTで1時間ブロッキング溶液中でスライドをインキュベートします。
3. 静かに吸引マイクロピペットを使用し、モルモット抗インスリン及びウサギ抗Ki67の抗体を含む一次抗体溶液の75μlを添加するブロッキング溶液、PBS中の5％NDS中に1μg/ mlで希釈しました。室温で1時間インキュベートします。
   注：細胞増殖の代替マーカーは、増殖細胞核抗原（PCNA）およびホスホが含まれますohistone H3（PH 3）、
4. 静かにマイクロピペットを用いて一次抗体溶液を吸引し、75μlのPBSで細胞を洗浄します。吸引除去し、PBSは、マイクロピペットを使用し、75μLのPBSで、細胞を毎回2回以上すすいでください。 RTで1時間ブロッキング溶液中の2μg/ mlに希釈した75μlの抗モルモットCy5の二次抗体と抗ウサギのCy3二次抗体と、各サンプルをインキュベートします。
   注：すでにマイクロスフェアを標識するために使用したのと同じまたはスペクトル重複フルオロフォアで標識された二次抗体を使用しないでください。
5. マイクロピペットを用いて吸引し、二次抗体溶液を、室温で3分間、PBS中の300 nmのDAPI75μlの中でインキュベートします。吸引しDAPIは、マイクロピペットを用いて、5分間脱イオン水ですすぎます。
6. 静かにマイクロピペットを用いてサンプルから水を吸引除去します。ガラスカバースリップ上の退色防止剤を含む速乾性マウントソリューションの滴（約100μl）をスポット。 O、ダウン顕微鏡スライドのサンプル側を反転マウントソリューションNtoを。ゆっくりと気泡を除去し、ソフトなクリーニングティッシュで余分な液体を拭き取るためにピペットチップを使用して、スライドに対するカバーガラスを押してください。カバースリップを室温で一晩乾燥することができます。

9.画像取得と解析

1. 画像取得のため取り付けられたカメラと落射蛍光顕微鏡を使用してください。各フルオロフォアについて、最適露光時間（ - Ki67にインスリンのための80ミリ秒、250ミリ秒DAPIための典型的には20ミリ秒、40）を決定します。画像取得パラメータは、すべての試料について同じであることを確認してください。
2. 各サンプルについて、手動で3000インスリン陽性細胞をカウントし、それらのまたのKi67陽性であり、どのように多く数えます。明確に定義されたと明らかに目に見える核を持っているインスリン陽性細胞のみをカウントします。インスリン陽性細胞の総数でのKi67陽性/インスリン陽性細胞の数を割り、100を掛けることにより、各サンプルのβ細胞増殖の割合を計算します。
3. Dの後、各サンプルについて、β細胞増殖の割合をetermining、β細胞増殖の統計的に有意な差は市販の統計ソフトを使用して、一方向ANOVAを用いた結果を分析することにより制御し、実験試料との間に存在するかどうかを決定します。

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結果

図1は、上記のプロトコルを使用して生成されたマイクロスフェアを視覚的に表現したものです。ここで説明するプロトコルは、様々なサイズのrhCTGFを充填したミクロスフェアが得られます。いくつかのマイクロスフェアは、（ 図 2）大きいかもしれませんが微小球の最大の画分は、直径が1〜10μmの間であろう。所望の場合、マ?...

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ディスカッション

培養中のβ細胞増殖の研究は、一般的にいくつかの困難によって妨げられています。まず、不死化β細胞株は、生膵島における内因性β細胞で見られるものよりも、増殖の高い程度によって特徴付けられます。さらに、これらの不死化細胞株は通常のβ細胞機能のための重要な正常な構造を欠いています。これらの2つの事実は、結果が、インビボまたは全体の島で試験したとき、真の保?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer	ThermoFisher Scientific	O6149	For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl Sulfoxide	Fisher BioReagents	BP231-1	For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000	Sigma-Aldrich	739960	Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000	Sigma-Aldrich	341584	Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640	Thermo Scientific	11879-020	For culturing islets
Dextrose Anhydrous	Fisher BioReagents	200-075-1	Supplement for islet media
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotics for islet media
Normal horse serum	Jackson ImmunoResearch	008-000-121	Supplement for islet media
96-well tissue culture plate	Corning	3603	For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378	Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	For spinning cells onto microscope slides
EZ Single Cytofunnel	Thermo Scientific	A78710020	For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher BioReagents	BP118-500	Used in dissociating islets
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cells
Triton  X-100	Fisher BioReagents	BP151	For permeabilizing cells
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibody	abcam	ab15580	For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin	Dako	A0564	For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig	Jackson ImmunoResearch	706-175-148	For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher Scientific	D1306	For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-Mount	Lerner Laboratories	13800	Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System	Labconco	7382020	For lyophilization of microspheres