蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

要約

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

要約

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

概要

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

プロトコル

注：このプロトコルのために、我々はNの表皮にストロミュール周波数を測定することに焦点を当てていますベンタミアナの葉。 FNRtp：EGFP ¹³とNRIP1：セルリアン ⁶いくつかの安定したトランスジェニック系統は_、PRO 35Sを含め、この目的のために使用することができる生成されています。これらの線の両方が広範囲の条件の下で成長した葉の葉緑体ストロマにおける蛍光体の強い発現を示しました。また、葉緑体を標的とするフルオロフォアは一過Nに表現することができますアグロバクテリウムを使用してベンタミアナは ^13を変換します。 アグロバクテリウム浸潤がNでいくつかの基礎的な防御反応を誘発するので、これは、トランスジェニック株未満理想的ですアグロバクテリウム ベンタミアナとの相互作用は、潜在的に結果の解釈を複雑にし、葉¹⁴にストロミュール周波数を変更することができます。最後に、in vitroでストロミュール形成を可視化し、以下のセクション5で説明したように葉緑体は、遺伝的にコードされたフルオロフォアまたは蛍光色素のいずれかを使用して、任意の植物種から抽出することができる^。9,15

注：植物栽培のための詳細な方法は、以前に記載されている¹⁶簡単に言えば、Nを育てます良好な排水を提供する任意のプロの土壌混合物を充填した4 "ポットでbenthamiana植物。。発芽のための湿潤環境を提供する最初の10-14日のための明確なプラスチック製のドームで苗をカバー14-に、製造元の指示に従って、任意の標準的な肥料ミックスを追加します。日齢の植物。〜100マイクロモル光子メートル^-2秒^-1の光強度を用いて、白色光の下で植物を育てる。水植物定期的に。

可視化のための1.準備葉試料

注：ストロミュールダイナミクスは^8を負傷の影響を受けているので、組織標本は、ストロミュールを可視化する直前に行われるべきです共焦点蛍光顕微鏡によってS。理想的には、サンプルは、植物から取り出した後15分で可視化する必要があります。

1. 非常に鋭いカミソリの刃を使用して、葉の小さな部分をカット。常に一貫性のために、葉の同じ領域を使用し、全ての実験において（向軸または背軸）と同じ面を視覚化するようにしてください。
2. すぐに水で満たされた5ミリリットル無針注射器で葉の部分を水没、葉の部分を切断した後、注射器から空気を除去し、指で注射器のオリフィスをカバーし、プランジャーを引くことにより真空を適用します。
   1. 葉の部分を損傷しないように静かにプランジャーを解放します。この2〜3回繰り返して、または空気の大部分が除去されているまで、葉は、深い緑であるように見えます。
      注：この手順はstromulesの正確な可視化を妨害する可能性が葉内の空気を除去します。
3. スライドに一滴の水を追加し、このドロップ上の葉の部分を配置します。その後、別のDRを追加葉の上部に水のオペアンプ、および葉の上にカバースリップを配置。気泡がある場合、それらが削除されるまで、静かにカバースリップをタップします。スライドは現在、顕微鏡検査のために準備ができて、すぐに可視化する必要があります。

共焦点蛍光顕微鏡2.可視化Stromules

1. 透過光では、（離れてかみそりの刃により損傷を受けた細胞からの）葉部の中心付近の視野に焦点を当てます。多くの葉緑体を同時に可視化することができるように、20X対物レンズを使用してください。細胞型は、後で識別できるように、必要に応じて、透過光で画像を保存します。
2. 使用している蛍光団のために適切な励起及び発光フィルターをレーザーに照明源を切り替えます。例えば、488nmのレーザーでGFPを励起し、500 nmから525 nmの間の排出量を収集します。
   1. 顕微鏡のソフトウェアを使用して、GFPのチャンネルを選択し、1愛にピンホール開口を調整するためにクリックRYユニット。 、レーザ走査を選択し、サンプルを可視化を開始し、その後、まだ明確stromulesを可視化しながら、レーザーパワーを最小化するために、レーザー強度および検出器の利得を調整するためにGFPチャンネルをクリックします。これらの設定が決定されると、それらはすべての実験を通じて、可能な限り一貫しておきます。
3. 視野内の葉の表皮を通過した一連の画像を収集するのz -stack実験を準備します。
   1. z -stackについては、（葉の表面付近の葉緑体は、試験した条件の下でより多くのstromulesを持っている場合、たとえば）のバイアスを回避するために、視野内のすべての表皮葉緑体が含まれます。
   2. すべてstromulesを含みますが、zの -stackに必要な時間を最小限に抑えることができますその最大間隔可能で画像を取ります。例えば、もし1エアリーユニットは、すべての2ミクロンの可能性が高い理想的な画像を撮影、2μmの深さでの合焦共焦点部分に相当します。
      注：葉epidermisが凹凸面であるので、サンプルによって異なります-stack のzの合計深さ;ほとんどのz -stacksは10月20日の画像が必要になりますが、それ以上を含むことができます。
   3. 走査速度と（可能ならば、通常5〜10分以内） のz -stackを迅速に収集されていることを確認するために、必要に応じて画像の解像度を調整します。後の分析のためのz -stackを保存します。

3.画像処理

1. 任意の画像解析ソフトウェアを使用してストロミュール周波数を決定します。このプロトコルのために、我々は、国立衛生研究所（http://imagej.nih.gov/ij/）、またはImageJを、フィジーの人気のアップグレードから公的に入手可能であるImageJを、（http://fiji.scを使用することをお勧めします/フィジー）。
2. ソフトウェアにおける最大値投影を使用して、単一の画像へのz -stackをマージします。
3. 特定し、手動でイメージ内のすべての葉緑体を数えます。
4. 各葉緑体について、目視か一つ以上のstromulesを決定マージされたZ -stack画像内の葉緑体から伸びる見られています。例については、 図1を参照してください。
   注：stromulesの生物学的機能が知られていないので、葉緑体から任意の薄い、間質で満たされた、管状延長が長さに関係なく、「ストロミュール」と考えることができます。それは約1μm、長さ⁷の大部分に沿って直径よりも小さい場合、原則として、葉緑体から間質で満たされた拡張子はストロミュールです。 1人が葉緑体がストロミュールを持っているかどうかを決定する際の主観的な差異を制御するために、すべての画像を分析していることを確認してください。第二の研究者は、独立して、さらに主観的な偏りを減らすためにストロミュール周波数を確認する必要があります。

4.実験計画およびサンプリング

注：ストロミュール周波数は葉の間に非常に可変であるが、いくつかの報告がINDIVI内ストロミュール周波数でほとんど変化があることを示唆していますデュアル葉^9,17。

1. 1つのリーフの1つの視野からのリーフストロミュール周波数を計算します。葉を捨てて、この独立したサンプルを検討してください。独立したサンプルのように1つのリーフからの眺めの別々のフィールドを考慮していません。
   注：そこストロミュール活動のどのように最良の指標の変化には強いコンセンサスがなく、stromulesの機能をより明確に定義されるまで、研究者はストロミュールダイナミクスを定量化することで創造的であり続けなければなりません。文学全体の比較のために、しかし、報告の一般的な基準は、より創造的なアプローチに加えて使用する必要があります。最低でも、必ず一つ以上のstromulesを持っている葉緑体の頻度を報告しています。
2. 視野内のstromulesを持っている葉緑体の頻度を決定します。視野内の全ての葉緑体を識別するためのImageJを使用してください。その後、各葉緑体のために、葉緑体は、少なくとも1ストロミュールを形成しているかどうかを判断します。 percentaとしてストロミュール周波数を報告ストロミュールと葉緑体のGE。
   注：一部の研究者は、ストロミュール周波数を報告する前に、アークサイン変換を持つ例えば、パーセンテージを変換します。これは統計分析のためのオプションであるが、ストロミュール周波数のアークサインは、直感的な値ではなく、研究の主なテキストまたは数値で報告する必要はありません。
   1. 別のアプローチとして、stromulesの合計数をカウントし、葉緑体の合計数で割り。
      注：ほとんどの状況下では、これは4.2に近づくように、同様の結果が得られます。単一葉緑体は多くstromulesを形成した場合には、しかしながら、ストロミュール頻度を過大評価することができます。代表的な結果の下に示す例では、例えば、いくつかの葉緑体は（87分の33のストロミュール対周波数）87分の40に葉緑体当たりstromules数を上げ、二つ以上のstromulesを持っています。
   2. また、代わりにストロミュール周波数のストロミュールの長さを決定します。長さを測定することができます。ImageJの中のフリーハンドラインツールでストロミュールをトレースすることもできます。
      注：stromulesの生物学的役割は不明のままであるので、それはストロミュール長さは、その機能に影響を与えることは明らかではありません。 （4.2に記載されているように）、それらが認められた場合ストロミュール長さに有意差を報告するだけでなく、ストロミュール周波数を報告しています。
      注：ストロミュール周波数が同じ成長条件下での異なる葉の間で高度に可変することができます。したがって、時間のかかることがストロミュール周波数を決定するが、実験は慎重に大きなサンプルサイズを含むように設計されるべきです。我々の研究室からのデータセットを用いて、標準で（各処置について少なくとも16の植物のサンプルサイズは、2つの条件の間でストロミュール周波数の少なくとも1.5倍の変化の統計的有意差があるかどうかを決定するために、通常は十分に強力であると判断しα= 0.05、β= 0.80）。
3. 結果の統計的分析。
   1. 私を比較するために、2つの治療のストロミュール周波数、（また、異分散t検定または不等分散を仮定し、t検定として知られている） ウェルチのt検定を使用します。
      注：このテストは、従来のスチューデントのt検定ほど強力ではありませんが、それはストロミュール頻度分布の分散は、治療間類似していることを想定していないので、 ウェルチのt検定が有利です。
      注：ストロミュール周波数が「割合」であるので、その標本分布は、理論的にスキュー統計分析を、サンプルサイズが非常に低い場合、またはストロミュール周波数（近い0％に）または非常に非常に低い場合に可能性があり、二項はなく正常であると予測されます高い（100％に近いです）。いくつかのレポートは、正規分布に二項分布を変換し、したがって、 スチューデントt検定またはANOVAの標準的な要件を満たすように意図されている統計的分析の前にアークサイン変換を使用しています。実際には、しかしながら、rcsine変換は、統計分析にほとんどまたは全く影響を持っているので、お勧めできません。代わりに、統計的検出力を増加させ、データの解釈の誤りを減少させるサンプルサイズを増加させるために実験を繰り返します。
   2. 統計的手法が使用されているものは何でも、慎重にサンプリング戦略、サンプルサイズ、統計的検定、および各実験のためのp値を報告してください。
      注：研究者は確実に得る正確なp値を報告する必要がありますが、生物学の他の分野と同様に、0.05未満のp値は、「統計的に有意な」と考えることができます。 Pは、2つまたは3つの実験でサンプルサイズを増加させる、わずかに0.05を超える場合観察された差は、再現性と統計的に有意であるかどうかを明確にするために役立つことができます。

5.ストロミュールダイナミクスを可視化するために無傷葉緑体の抽出

注：いくつかの方法試験管 ¹⁵ 内ストロミュール形成に関する最近の研究では、わずかに異なるプロトコルを含む、葉から葉緑体を単離するために使用されてきました。以下に詳述するプロトコルは、生化学的に純粋な葉緑体のサンプルが得られない、比較的簡単な方法を使用しますが、その代わりに、無傷の、健全な葉緑体^9,18の大量を分離ありません。

1. 50mMのヘペスのNaOH、330 mMのソルビトール、2mMのEDTA、1.0のMgCl _2、および1.0mMののMnCl _2：コールド抽出緩衝液を準備します。使用前のNaOHとHCl、および冷蔵で6.9にpHを調整します。
   注：冷たいバッファを使用し、可能なが無傷の葉緑体の高い比率をもたらすときにサンプルを氷上で維持し、必要ではないが。
2. 50mMのヘペスのNaOH、330 mMのソルビトール、2mMのEDTA、1.0mMののMnCl _2、1.0のMgCl _2、10mMのKClと1.0のNaCl：分離バッファを準備します。使用前にNaOHおよびHClおよび冷蔵で7.6にpHを調整します。
3. 葉がない場合はジメチルスルホキシド（DMSO）中の50mM CFDAストック溶液（1.0ミリリットルDMSOあたり2.3ミリグラムのCFDA）：遺伝的にエンコードされた間質蛍光団を発現している、カルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）溶液を調製。
   注：正確な濃度は重要ではありません。すべての回で暗所にCFDA在庫を保管してください。 -20℃で50 mMのCFDAの少量のアリコートを保管してください。
4. 葉緑体を単離するために、いくつかの植物から〜5〜10グラムの葉を除去し、簡単に冷たい水ですすいでください。すぐに50ミリリットルの冷抽出緩衝液に移します。いくつかの短いパルスでブレンダーを使用して葉を挽きます。 （50ml×2回）遠心管に抽出葉緑体を分割し、葉の破片を除去するために、チーズクロスの二、三の層を通して濾過し、750×gで1分間遠心。
5. 上清を捨て、10mlの単離緩衝液中で緑の葉緑体を懸濁します。 750×gで1分間再び遠心分離し、上清を捨て、そして5ミリリットルに最終容量をもたらすために分離バッファに葉緑体を懸濁します。
6. 転送201;スライドに葉緑体のlは、カバーガラスでカバーし、顕微鏡検査を開始します。
   注：プラスチド標的蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック植物からの葉緑体は現在、共焦点蛍光顕微鏡による可視化のための準備が整いました。
7. stromulesを可視化するためにプラスチド標的に蛍光タンパク質を発現していない植物から葉緑体を染色します。
   1. 5ミリリットル単離緩衝液中に葉緑体懸濁に50 mMのCFDAの株式の5μlを添加します。 50μMに最終濃度を持参してください。
   2. 葉緑体を5分間インキュベートし、その後、スライドに少量（〜50μl）を転送し、カバースリップでカバーし、顕微鏡検査を開始することを許可します。
   3. FITCまたはGFPフィルターセットを使用してください。単一の孤立した葉緑体を可視化するために、同時に多くの葉緑体を可視化する20Xの目的、またはより高い目標を使用します。
      注：CFDAは無傷の葉緑体のストロマ内部に蛍光を発します。
   4. 強いバックグラウンドの蛍光が存在する場合、chloを洗いますCFDA、750×gで1分間遠心分離器で5分間のインキュベーション後に10ミリリットル単離緩衝液中で再びroplasts、上清を捨て、そして5ミリリットル単離緩衝液中に再懸濁。

結果

このプロトコルは、若いNの子葉に一日で、夜はストロミュール周波数を視覚化するために使用されましたベンサミアナタバコの苗。 Z-スタックからのスライスは、単一の画像（ 図1A）に併合されました。間質が（ 図1B）、黒表示されるように、視覚的な目的のために、その画像は彩度と反転しました。葉緑体は全くstromule...

ディスカッション

stromulesを調査すると、三つの重要な要因は全体で考えなければならない：植物組織の（ⅰ）操作は最小限に抑える必要があり、（ii）の実験システムの一貫性が保たれなければならない、および（iii）サンプリング戦略は慎重に計画する必要があります堅牢な、再現性のあるデータが分析されていることを確認します。

Stromulesが著しく動的である：彼らは拡張し、顕微?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images