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要約

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

要約

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

概要

ここ数十年では、イメージング技術は、医師が病気を診断し、監視する方法に革命をもたらしてきました。これらのイメージング技術は、しかしながら、例えば、陽電子放射断層撮影（PET）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（SPECT）、コンピュータ断層撮影（CT）、磁気共鳴イメージング（MRI）などの全身画像化システムに大きく制限されています。特に注意は、がんが注目されている、技術イメージングブレークスルーを大幅にこの病気を診断し、治療される方法を改善しています。手術室：これらの進歩にもかかわらず、これらのイメージング技術がちょうど収まりきらない一つの場所があります。全身イメージング技術は、手術計画に役立つことができますが、それらは一般的に、腫瘍組織の全てが除去された又は残留腫瘍組織を切除縁1に隠されたままかどうかを医師がリアルタイムで決定するのに役立つのに十分に高い空間分解能を欠いています。ノー浸潤がしていることを確認し腫瘍マージンが最も重要な外科的な目標の一つであり、外科医は、厳格かつ慎重な組織切除の間にタイトロープを歩く必要があります残されています。あまりに多くが除去されると、患者に対する望ましくない副作用が悪化します。少なすぎるが削除された場合、再発率は2、3に増加しています。したがって、正確な腫瘍のマージンを描くために重要であり、我々は、化学発光術中イメージングは​​、そうでなければ、確立された技術で検出されない状態になる可能性があり、悪性組織を可視化するために外科医を支援することにより、腫瘍のマージンの識別の精度を向上させるために助けることができると信じています。

現在術中イメージングシステムとしてのそれらの可能な有用性について研究されている多くのイメージング技術があります。これらは、β-およびγ線放出プローブ4、光学蛍光5、ラマン分光法6を含みます> 7、及びチェレンコフ発光8、9。しかし、今日まで、これらのいずれも、標準的な臨床ツールとして確立されていません。光学蛍光イメージングは​​、これまで、これらの技術の中で最も有望であることが判明している、したがって、最も探索されます。既に多くの用途のための貴重なツールであることが示されているが、それには限界がないわけではありません。確かに、その主な欠点は、本質的に自家蛍光生体組織によって生成されたバックグラウンド蛍光です。このバックグラウンド自己蛍光シグナルは、蛍光シグナルの生成に必要な外部光源により、フルオロフォアに加えて、周囲の組織の励起との積です。実用的な観点から、この自己蛍光は、潜在的に手術室では、この技術の有用性を制限することができる低信号対雑音比をもたらすことができます。

校長蛍光画像上の化学発光画像化の利点は、励起光が必要でないことです。その結果、バックグラウンド自己蛍光はありません。化学発光イメージングでは、励起エネルギーは、代わりに、化学的に生成されます。このプロセスには意図されないバックグラウンド信号を生成しないので、より高い信号対雑音比をもたらすことができます。これは、最終的に切除縁のより精密かつ正確に検出される可能性があります。やや驚くべきことに、術中イメージング技術として、このアプローチの有用性は、10未踏のままです。実際、この手法に最も近い例は、マウス11、12、13におけるミエロペルオキシダーゼによるルミノールの酸化です。化学発光生物医学イメージングは​​、したがって、次のような利点を提供できる研究のかなり未踏の領域です：ハイとローバックグラウンド信号が得られる（1）最小限の自家蛍光gher信号対雑音比。 （2）可視光から近赤外までの化学発光放出の調整可能な波長を、 （3）リンカ技術とすでに存在している標的とする生体分子と結合し、官能化化学発光錯体を、対象となる分子イメージングプローブ14の全体のライブラリへのアクセスを提供します。

この証明の原理研究は、ルテニウムベースの造影剤を使用して、生物医学的環境において化学発光画像化の潜在的な有用性を示しています。この化合物の化学発光特性は、よく1960年代半ば15にさかのぼる調査で、研究されています。化学的活性化の際に、薬剤は、医療用イメージングのために適している約600 nmの16の光を生成します。活性化エネルギーは、励起状態の水17 -follで650ナノ秒の寿命を有するに至る酸化還元反応によって提供されますこの励起状態の緩和時に光子の生成によって負っ。特別に設計されたリモートネブライザーの使用を介して、我々は、化合物の両方のエキソビボおよびインビボで検出することができました。最初の実験の結果は、この技術のさらなる調査を示唆し、非常に有望です。

プロトコル

倫理の声明：承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター（MSK）施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理ガイドラインの下に従って行った説明in vivo動物実験のすべて。

噴霧装置の1建設

  1. 2本のネジ（×25 mm 2と4）を使用して、パートB（12.7 X 10.7 X 1.8センチメートル3）の中央に直立木質部A（12.5 X 2.5×1.8センチメートル3）を取り付けます。 1本のネジを使用して、パートA（12.5 X 2.5×1.8 cm 3）での中央に木部C（11×2.5×1.8 cm 3で）を取り付け、その結果、C部（1.8×11×2.5cm 2の3）はまだ移動することができます。 図1を参照してください。
  2. 二つのループ、どちらかに1を形成するために介して2つの穴のプラスチック3オンスミニ噴霧器（D）のスプレーボトルトリガの下部先端のドリルスルーとステンレス棒をプッシュ（1/16 "鋼10センチ）（E）トリガーの側面。
  3. 抜けケーブルタイを防止するために、ダクトテープ（F）でスプレーボトルの底部を包みます。 2プラスチック製のケーブルタイを使用して、木質部C（11のx 2.5×1.8センチメートル3）（28センチメートル）（G）へのスプレーボトルを取り付けます。
  4. 011サーボモータ（I）を遮断し、サーボ制御（H）のケーブルが緩んでいないでそれを再接続します。そして、ダクトテープを使用して、木質部A（12.5 X 2.5×1.8センチメートル3）の上部にサーボモータを接続します。
  5. ペーパークリップ（K）を使用して、サーボモータレバーに鉛筆（J）を取り付けます。しっかりとプラスチックカバーされツイスト線（L）を使用して、スチールロッドループに鉛筆の最も外側の部分を接続し、ダクトテープと鉛筆の端を固定します。
  6. サーボモータ制御装置の磁気ケーブルコネクタ（M）を遮断し、スピーカーケーブル（N）に再接続します。そして、木質部B（12.7 X 10.7 1.8×cm 3）とするサーボモータ制御装置をテープ。半分に磁気コネクタ付きW1ケーブルをカットし、銅sの緩い最後に1部を添付ピーカーケーブル（1メートル）。 （磁気）12トグルスイッチとp1の電源が利用できW1ケーブルと9Vバッテリーに接続します。

法の2.感度決意

  1. 1.5 mLのマイクロ遠心チューブでは、260μgの（347ナノモル）、52μgの（69ナノモル）、26μgの（34ナノモル）の量で逆浸透水（100μL）の[3のRu（bpyで）]のCl 2の溶液を調製、5μgの（6.9ナノモル）、3μgの（3.5ナノモル）、520 ngの（694ピコモル）、260 ngの（347ピコモル）、52 ngの（69ピコモル）、26 ngの（34ピコモル）、5 ngの（6.9ピコモル）、および3 ngの（3.5ピコモル）。
  2. 各100μLをミックス[のRu（bpyで）3]顕微鏡スライド上の硝酸セリウムアンモニウムの水溶液100μL（（NH 4）2 Ceの（NO 3）6）の水（25 mM）のでのCl 2溶液。
  3. イメージングソフトウェアを初期化することにより、生物発光リーダーに買収を設定します。
    1. ユーザプロファイルにサインインし、アックイを探しますジションコントロールパネル。 「初期化」をクリックすると、機器の準備ができるまで待ちます。
    2. チェックされ、「画像表示モード」を探し、「発光」と「写真」がチェックされていることを確認し、その「蛍光」。
    3. 20秒に「発光」の設定「露出時間」に変更します。 「発光」のための残りの設定を設定し、次のように：「ビニング」：中。 「F /ストップ」：1。そして、「発光フィルタ」：オープン。
      注：露光時間は、提示さ設定と異なる場合は、使用機器および実験設定に応じて適応させることが必要になる場合があります。
    4. 「露出時間」：次の設定を使用」、写真」のためのオート。 「ビニング」：ミディアム。および「F /ストップ」：8.「フィールドビューの「ドロップダウンメニュー用のtarget.Lookを画像化するに従って、「件名の高さ」を調整してください。初期設定は「C」でありますCとの間の「B」に変更します（14センチメートル距離アメーラと試料ステージ）。
  4. 酸化剤から保護するために撮影室の床に黒い画用紙のシートに顕微鏡スライドを配置することによって、噴霧器を設定します。 [のRu（bpyで）3]の100μLdroplet（NH 4）の水溶液100μLでのCl 2 -溶液を混ぜる2のCe（NO 3）6.緑色のボックスの十字線を観察します。
    1. 関心領域は、試料ステージ上に表示される緑色のライトボックスの十字線の中央にあるように、黒画用紙に被写体を配置します。木製のサポートから、プラスチック製のスプレーボトルを取り外して噴霧器を準備します。そのプラスチック製のリザーバーに、木製のサポートにそれを再接続します（水/エタノール中3 1）のトリエチルアミンの溶液を埋めます。
    2. 生物発光リーダーの内部噴霧器を配置し、電源コードがネブライザーコードから切り離されていることを確認します。その電源スイッチを確認してください上で、トグルスイッチがオフになっている、と赤色のLEDが点灯します。スプレーノズルヘッドによる被写体に向けてカメラからの眺め閉塞を最小限に抑えながら、噴霧流は、被写体上の関心領域に向かって指摘されるように噴霧器を置きます。
    3. スプレーからそれらを保護するために、任意の潜在的なホットスポット（顕微鏡スライドまたは注射部位に例えば、白マーク）の上に画用紙の小さな黒い駒を置きます。場所が撮像対象、噴霧器、または磁気ドアラッチと干渉しないように、撮像チャンバ内部ネブライザ遠隔コードの少なくとも40センチ、。イメージングシステムのドアを閉じます。
      注：十字線がで設定」ビューのフィールド」に基づいてサイズを変更します」リビングイメージ; "これは「B」に設定されていることを確認してください。
  5. 撮像シーケンスを開始することにより画像を取得します。で、「取得」をクリックして「取得コントロールパネル。」第1の撮像sequ上レンスは、必要に応じて自動保存を有効にする（推奨）とデータフォルダを選択します。シーケンスの最後まで「編集イメージングラベル」ダイアログを無視します。
    注：制御ソフトウェアは、機器のアクションは、ステップバイステップでリアルタイムに表示されます。測定を調製し、正しい位置に試料ステージを移動した後、それはカメラのシャッターを開き、測定時間をカウントします。シャッター開口部は、機械によって生成され、クリック音によって聞くことができます。
  6. 化学発光を生成するために、トグルスイッチを3回切り替えることにより：シャッターが開くと、トリエチルアミンの溶液の3バースト（水/エタノールで3、スプレーバーストあたり0.24±0.04 mLの1）をスプレー。
    注：試料ステージは、測定中に移動します。これを可能にするために、機器の内部に十分な（最小40センチメートル）ケーブルを残します。解決策は、上昇管によって熱望することができ、噴霧器によって噴霧されることと配管内に気泡がないことを確認します。いくつかの予備バッテリー含みを持っています必要な場合には準備ができてネブライザーのための。

全身静脈内注射後のin vivoイメージング3

  1. 1.5 mlのマイクロ遠心管中で、[Ruの（BPY）3] Cl 2をナノモル8〜33を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液100μLを調製します。同時に、（NH 4）の水溶液2のCe（NO 3）水に6（25 mm）を準備します。
  2. 静脈内に健康なマウスの尾静脈に[のRu（bpyで）3] Cl 2を100μLを注入した（n = 5）。
  3. CO 2窒息を介してマウスに注射後10分を安楽死させます。
    1. 心臓や肺を露出するようにU字状に肋骨弓を削除した後、胴体からYカットで皮膚を取り除きます。右心房にコンセントを切断し、左心室18に24ゲージの針を介してPBSの20mLのを注入することにより、マウスを灌流。慎重に腹を切って皮膚や腎臓および肝臓を露出させます。目に見えるカットを作成するために臓器を通って長手方向にカットします。
  4. 以下の変更を行い、ステップ2.3から2.6に記載されているように買収を設定します。
    1. 十分ネブライザプラスチックリザーバを洗浄した後、代わりにトリエチルアミン水（NH 4）2の溶液のCe（NO 3）6（25ミリモル）でそれを埋めます。
      注：徹底的に（NH 4）2 Ceの（NO 3）6は、いくつかの使用後にスプレーノズルを破壊する可能性を結晶化するので、使用するたびに、ネブライザーノズルを洗浄することが重要です。
  5. 動物全体または器官のサンプルは、イメージングのために使用します。
    1. 腹部全体イメージングのために、カメラ、機器の背面を指して頭に直面して開いた腹部とマウスの死体を置きます。緑色のライトボックスの十字線で画像化される臓器（ 例えば、肝臓や腎臓）を中央に配置します。
    2. Fまたは臓器イメージングおよび定量個々の、イメージング装置からマウスを削除し、それを突き止めます。すでにオープンした体腔から出発し、内部器官（ 例えば、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、脳、および心臓）を切り出します。筋肉組織を切除するために後肢の皮膚を介してカットします。慎重に脳を切除するメスで頭蓋骨を開きます。
      1. 関心のある器官は、肝臓、腎臓、脾臓の場合は、縦方向に半分にすべての器官をカットし、黒画用紙のシャーレまたは片に各臓器を置きます。
    3. 単一臓器のための化学発光トレーサーの相対発光を確立するためのステップ2.3から2.6に記載されている手順に従ってください。

リンパ節のin vivoイメージング4.

  1. [のRu（bpyで）3] Cl 2を80ナノモルを含むPBS溶液10μLを準備します。水溶液（NH 4）2 Ceと準備（NO 3）6ワシントン州同時にター（25 mM）の。
  2. 健康なマウスの後肢に皮下溶液10μLを注入した（n = 5）。陰性対照として、純粋なPBSの10μLと反対側の足を注入。 15分注射後、CO 2窒息を介してマウスを生け贄に捧げます。膝窩リンパ節までのリンパ運河を露出するために、両方の後ろ足の皮膚を取り除きます。
  3. ステップ3.4で説明したように買収を設定します。
  4. 定量化のために、両方の後肢からの膝窩リンパ節を除去半分にそれらを切断し、ペトリ皿上に酸化剤とそれらをスプレー、前述したように（ステップ3.5.3）。

結果

プロトコル項1に記載のネブライザーシステムは、低コストで容易に入手可能な材料から構成することができます。リモートトリガ生物発光リーダー（ 図1）の内部に還元/酸化剤の噴霧用のインセットであることが意図されます。私たちのデザインは、レンズ〜14センチの距離での生物発光リーダー内の噴霧器の安全な操作を可能にします。レンズのない?...

ディスカッション

ここでは、光学的、化学発光レポーターによって作成された光子の放出を介して組織の輪郭を描くことのできる技術を提示しています。他のとは対照的に、多くのこの化学発光レポーター系は、非放射性であり、非常に高感度レベルでの検出を容易に画像化プローブを用い、技術4、5、6、7、8?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayerBed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
Paper clipOffice Depot221720
speaker cableRCA Inc.AH1650SN
Energizer 9V alkaline batteryEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NameCompanyCatalog NumberComments
28 cm plastic cable tiesGeneral Electric Inc.50725
Duct tape3M Inc.3939
littleBits w1 wirelittleBits Inc.w1 wire
littleBits p1 powerlittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 toggle switchlittleBits Inc.i2 toggle switch
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm plastic covered wire twist tiesFour Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.224758
Ammonium cerium(IV) nitrateSigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoraneBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EthanolSigma-Aldrich2854
TriethylamineSigma-Aldrich Inc.T0886
WaterWater was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) miceJackson Laboratories1929age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence readerCaliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Microscope slidesThermoScientific4951PLUS4

参考文献

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