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Erratum Notice

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要約

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

要約

マウスモデルにおける遺伝物質の心筋送達を通して、特定の遺伝子の発現または活性を制御する遺伝子機能の調査を可能にします。心臓におけるそれらの治療可能性を決定することもできます。マウス心臓におけるin vivo分子介入のための限られたアプローチがあります。組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベースのゲノム工学は、インビボ心臓遺伝子操作のための不可欠なツールとして利用されています。この技術の具体的な利点は、最小の高効率、高特異性、低ゲノム組込み率を含みます 免疫原性、および最小の病原性。ここでは、パッケージを構築し、rAAV9ベクターを精製するための詳細な手順を説明します。新生児の仔へrAAV9の皮下注射は、肝臓や他の組織に強い発現またはマウス心臓における目的の遺伝子（複数可）の効率的なノックダウンになりますが、ありません。心臓仕を使用しましたC TnnT2プロモーター、心臓におけるGFP遺伝子の高発現が得られました。さらに、rAAV9-U6-shRNAをを利用したときにmRNAが中心部に阻害されたターゲット。 rAAV9技術の知識を作業は、心血管の研究に有用であり得ます。

概要

様々な生物学的システムにおける特定の遺伝子の発現または活性を制御する遺伝子機能1の研究に貴重な戦略となっています。この目標を達成する直接的な手段は、ヌクレオチド配列を操作し、突然変異対立遺伝子を生成することです。生きた細胞のゲノムに正確な、ターゲットに変更を加えることはまだですが、 時間がかかり、労働集約的な練習、強力なTALENおよびCRISPR / Cas9ツールの開発は、ゲノム編集2-5の新時代を開きました。遺伝子操作のためのより多くのルーチンの実験室方法は、対象1,6の遺伝子（複数可）を発現またはノックダウンするために細胞に遺伝物質（DNAおよびコード配列またはsiRNAを/ shRNAを含有するRNA）の導入に焦点を当ててきました。

多くの場合、遺伝子操作のための主要なボトルネックは、細胞へのDNA、RNA、またはタンパク質の送達です。 in vitro試験、効率的なtransfectiに関してシステム上の多くの培養細胞株で確立されています。しかし、特に、マウスモデルにおいて、 インビボでの遺伝子送達は、より困難です。外因性の試薬の効率的な細胞取り込みを達成するためにバイパスする必要が細胞外および細胞内の障壁のシリーズがあります。追加の障害物は、急速なクリアランスと納入材料7,8の短い期間が含まれます。これらの問題を回避する1つの戦略は、 インビボ遺伝子送達のための「担体」または「ビヒクル」としてウイルスベクターを使用することです。ウイルスの自然に進化した伝達特性は、細胞7,9,10への目的の遺伝子の効率的な送達を可能にします。ウイルスベクターの多くのタイプが開発されたマウスにおける異なる細胞型および器官におけるインビボ遺伝子操作で柔軟可能にされています。

最も一般的に使用されるウイルス系は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含みます 11アップ。レトロウイルスは一本鎖RNAウイルスであり、標的細胞および器官12-14における形質導入遺伝子の生涯の発現の可能性を提供し、有糸分裂中に安定的に宿主細胞ゲノムへの遺伝物質を導入することができます。しかし、レトロウイルスの多くのタイプは、分裂細胞に感染し、非分裂細胞におけるそれらの有効性は、15非常に低いです。これは、遺伝子送達のためのそれらの有用性を制限します。レンチウイルスは、 レトロウイルス科の属です。他のレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、分裂および非分裂細胞の両方に感染することができ、広く有糸分裂後、高度に分化した細胞16への遺伝子導入に使用されています。レンチウイルスのライフサイクルは、宿主ゲノムへのベクターDNAの統合を含みます。このように、レンチウイルス媒介遺伝子送達は、形質導入された遺伝的要素16-18の安定的かつ長期間の発現を可能に。しかし、この機能は、二重Eを表すことができますベクターDNAの統合は、挿入変異誘発につながる可能性として、遺伝子発現を操作するためのこれらのウイルスの使用でdged剣 そして宿主細胞に人為的な影響を引き起こす可能性があります。アデノウイルスは、他の広く使用されている遺伝子送達系です。レトロウイルスおよびレンチウイルスとは異なり、アデノウイルスは、非統合され、宿主細胞8,10,11,19のゲノムの完全性を妨げることはありません。また、アデノウイルスは、多くの細胞型にDNAをトランスフェクトすることができ、感染が活発な細胞分裂19に依存しません。ウイルスベクターは19,20を複製する能力を有するようにアデノウイルスの別の重要な特徴は、ベクター精製の容易さです。しかし、このシステムの主要な警告は、アデノウイルス感染は、特に遺伝子治療の研究において、多くの研究におけるその使用を制限し、標的細胞と臓器19における強力な免疫応答を誘発することができることです。

これらの異なるタイプと比較してウイルスベクターのSは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、理想的な遺伝子送達系21,22であるように見えます。それは、最小限の免疫原性および病原性23,24を示します。また、rAAVのは、分割および非分裂細胞の両方を含む広範囲の細胞型に感染します。ほとんどの場合、のrAAVは、宿主ゲノムに組み込まれません。従って、標的細胞における望ましくない遺伝子またはゲノムの変化の危険性が低い22です。

最近では、rAAVのシステムが正常マウス心筋23,25-29にタンパク質をコードするDNA、miRNAは、shRNAは、およびCRISPR-gRNAsのインビボ送達のために使用されています。この方法論は、心血管研究の分野における基本的な調査と遺伝子治療の研究を容易にしました。ここでは、詳細な手順を効率的に記述された過剰発現またはマウス心臓における目的の遺伝子をノックダウンrAAV9ベクトルを生成します。プロトコルは、簡単かつ効果的な方法を提供しますマウス実験モデルにおける心臓遺伝子発現を操作します。

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プロトコル

すべての記載されたステップは、バイオセーフティ委員会とボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で行われました。ボストン小児病院は、規制明/暗サイクル、室温調節器が病原体を含まないマウス施設を併設しています。獣医や動物のケアスタッフの変更ケージとマウスの健康を確保します。施設はAAALAC認定され、アクティブな動物福祉保証の認証（AAALACの認定は1992年2月24日に付与された動物福祉保証番号。：A3303-01）を有しています。マウスには、圧縮ガス源から送達CO 2により安楽死させました。組織サンプルは、心拍数、動き、動物の呼吸が止まったことを確認した後に採取しました。新生児げっ歯類は、CO 2安楽死に耐性があると鋭いハサミを使用して断頭により安楽死させました。これらの方法は、アメリカの獣医メディカの安楽死に関するパネルの勧告と一致していますリットル協会。

プラスミド骨格へのcDNAまたはshRNA発現カセットをクローニングすることによってrAAV9構築物の1世代

注：rAAV9プラスミド、AAV2の逆方向末端反復配列（ITR）を含有する、遺伝子の過剰発現のために使用されるニワトリTNNT2を保有するように改変されています 形質導入された遺伝子25,26,29の心筋細胞特異的な発現を可能にするプロモーター（rAAV9.cTNT）、。ユニークなNheIおよびKpnI部位は、プロモーターの下流に、プラスミドに導入されています。関心対象の遺伝子をコードするcDNA断片を、これら2つの制限部位25,26,29を用いrAAV9バックボーンにクローニングすることができます。ここでは、一例として、マウス心臓におけるGFP遺伝子の過剰発現のためにrAAV9ベクターを作製しました。得られたプラスミドは、2 ITRのサイト（ 図1）によって隣接cTnTの:: GFPカセットを含みます。 rAAV9.U6 ::のshRNA構築物25をノックダウンする遺伝子に使用しました。使用したデザインのshRNAオンラインのshRNAの設計・サーバー。 rAAV9.U6 ::のshRNAは、「シームレス」アニールによりおよびU6プロモーターを保有制限酵素消化rAAV9ベクターにDNAオリゴ含有shRNA配列を連結、またはロングレンジPCRおよび分子内ギブソンアセンブリベースのいずれかによって生成することができます建設30。得られたプラスミドは、2 ITRのサイト（ 図2）により隣接U6-shRNAのカセットを含むべきです。ここでは、一例として、rAAV9.U6 :: shRNAベクターは、mRNAのTRBP（：GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG TRBP shRNA配列）をノックダウンするために構築しました。スクランブルshRNAをネガティブコントロール（CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG）として使用しました。

  1. rAAV9のプラスミド骨格へのcDNAまたはshRNA発現カセットを複製します。コンピテントE. coli細胞25にDNAを変換します。
    注：望ましくないITR再結合を最小限に抑えるためにrAAV9 DNA形質転換のために使用しSTBL2またはstbl3 大腸菌細胞。
  2. ピックアップ形質転換された大腸菌細胞からの陽性クローン。リリー・バーネット培地500ml中に文化を増幅し、細菌細胞25-30からrAAV9プラスミドを抽出します。
    注：MIDI /マキシは、DNA（>100μgの）の高い量を得るためにrAAV9プラスミドを分取ウイルスを生成する前に、常に（http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html）前述のように、制限消化及びアガロースゲル電気泳動によりAAVプラスミドの配列の完全性を分析します。

rAAV9プラスミドとHEK293細胞の2トランスフェクション

  1. リニアポリエチレンイミン（PEI）の溶液を1μg/μLを準備します。 70〜80℃に加熱されたエンドトキシンフリーのdH 2 O中のPEI粉末を溶かします。 RTまで冷却後、1M HClでpHを7.0に溶液を中和します。フィルター滅菌し（0.22μm）のソリューション。 1μg/μlのPEIストック溶液（1400μL/チューブ）を等分し、solutを保存-20℃でのイオン。
  2. 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で培養HEK293細胞。 5±0.5％の二酸化炭素（CO 2）で培養物を37℃のインキュベーター中で細胞。
  3. 2希釈：0日目に、10 150-mmディッシュに1で分割> 90％コンフルエント細胞によるトランスフェクションの前に18-20時間をHEK293細胞をプレート。
    注：1日目に、細胞が90％コンフルエンスに到達する必要があります。
  4. 1日目に、rAAV9プラスミド（ 例えば、rAAV9.cTNT :: GFPまたはrAAV6.U6 :: shRNAの構築）、広告ヘルパープラスミド、およびPEI 25,26,29を使用して、AAV-REP /キャッププラスミドでHEK293細胞をトランスフェクション。
    1. 90％コンフルエンスで細胞の10皿のために、AAV-REP /キャッププラスミド、70μgのPF rAAV9プラスミド、および50mlの遠心管中でのAd-ヘルパープラスミド200μgの70μgのを混ぜます。
    2. 細胞が少ないコンフルエントであれば、比例DNAの量を調整します。例えば、細胞が75％コンフルエントである場合、軽減DNAの量に比例し（ステップ2.4.1に示す量の90分の75）：70のx 90分の75 = 58.3μgのAAV-REP /キャッププラスミドの、70 rAAV9プラスミドのX 90分の75 = 58.3μgの、および200×を混ぜます50-ml遠心チューブ内のAd-ヘルパープラスミドの90分の75 = 166.7μgの。
    3. 50 mlチューブに（FBSを含まない）RT DMEMの49ミリリットルを加え、よく混ぜます。
    4. PEIを作るためにPEI溶液の1360μLを加える：1：DNA比（w / vでは）4です。よく混ぜます。 30分 - 15 RTでインキュベートします。
    5. 各150-mmディッシュ（10 150-mmディッシュのための混合物の50ミリリットル）にステップ2.4.4で調製した混合物の5ミリリットルを追加します。
  5. 文化60-72時間、5±0.5％のCO 2で37℃のインキュベーター内で細胞。

トランスフェクトしたHEK293細胞とrAAV9ベクターの精製の3収穫

  1. トランスフェクション後、細胞を60から72時間を収穫。取り除くとサスペンド皿で細胞をピペッティングすることにより、培養培地とダウン。滅菌にすべての細胞懸濁液を移し50 mlチューブ。
  2. 5分間、500×gで細胞を遠心。各チューブに5mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁一50mlチューブにすべての細胞懸濁液を組み合わせます。
  3. 5分間、500×gで細胞を遠心。上清を捨てます。このステップでは、-80℃で細胞ペレットを保存するか、すぐにステップ3.4から3.15に記載されているように、ペレットからAAVを浄化します。
  4. 150mMのNaClおよび20mMのTris-HCl、pHが8.0：溶解バッファーを準備します。フィルター滅菌し（0.22μM）。 4°Cでバッファに保管してください。
  5. 溶解緩衝液10mlでペレットを再懸濁。
  6. それ融解37℃で、-80℃で、またはドライアイス/エタノール浴中で溶解液をフリーズします。 1分間ボルテックス。溶解液を3回凍結融解。
  7. （溶解物中のMgCl 2の最終濃度が1 mMのこと作る）を解凍し、溶解物へのMgCl 2溶液を加えます。 250 U / mlの最終濃度にヌクレアーゼを追加します。 DNA /タンパク質AGGRを溶解し、15分間37℃でインキュベートegation。
    注：DNA /タンパク質凝集をヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ処理後に溶解されない場合は、ダウンスライセートを20回均質化します。
  8. 4℃で20分間、4800×gでサンプルを遠心。上清を収集します。
  9. 一方、イオジキサノール勾配溶液を調製：
    1. 10倍の5 mlのPBS、1 MのKClの1 MのMgCl 2、0.125ミリリットル、5 M NaClを10ミリリットル、及び勾配培地ofdensity 12.5ミリリットルの0.05ミリリットルを混合することにより、勾配液の17％を準備します。 H 2 Oを使用して、50ミリリットルの総容量を調整
    2. 10×PBSを5ml、1MのMgCl 2を0.05 mlの1 MのKCl 0.125 mlの密度勾配培地20ml、および0.5％0.2ミリリットル（w / v）のフェノールレッドを混合することにより、25％の溶液を調製します。 H 2 Oを使用して、50ミリリットルの総容量を調整
    3. 10×5mlのPBS、0.05 1 MのMgCl 2 mlの1 MのKCl 0.125ミリリットル、および密度勾配媒体33.3ミリリットルを混合して40％溶液を調製します。使用して、50ミリリットルの総容量を調整H 2 O.
    4. フェノールレッド（w / v）の1 MのKCl、1MのMgCl 2 0.125 mlの0.5％の密度勾配培地50ml、0.1 mlの0.05 mlと混合することにより、60％の溶液を調製します。
  10. 針およびシリンジを用いて、底部から出発して、17％の5 mlを、25％の5 mlを、5 mlの40％と60％の5ミリリットルのためにポリプロピレンチューブにイオジキサノール勾配溶液を読み込みます。勾配の上にステップ3.8（14〜16ミリリットル）から得られた全てのライセートをロードします。下から上に記載されている勾配は、60％、40％、25％、17％、および溶解物層です。溶解緩衝液でチューブを記入し、コルクでそれをカバーしています。
  11. 16℃で90分間、185,000×gで遠心分離します。
  12. シリンジを用いて、ウイルス画分（40％の層）を収穫。わずか40％の層を吸引し、40％および60％の画分との交点に針（21ゲージ）を挿入します。
    注：25％層のいずれかを吸引しないでください。
  13. 滅菌ポリオキシエチレン - polyoxyproでウイルスの割合をミックス15 mlに総容量まで：pyleneブロック共重合体のPBS溶液（10,000 PBSで希釈した10％ポリオキシエチレン - ポリオキシプロピレンブロックコポリマーストック1）。フィルターチューブ（カットオフMW = 100 kD）の中に、混合物をロードします。 4℃で30分間、2000×gで遠心分離します。
  14. 一番下で溶液を捨てます。 15 mlに全量をポリオキシエチレン - ポリオキシプロピレンブロックコポリマーPBS溶液とフィルターチューブを補充。 4℃で20分間、2000×gで遠心分離します。このステップをさらに2回繰り返します。精製されたrAAV9ウイルス（フィルタ上記分数）を収集します。
  15. 1.7-mLのチューブにフィルターチューブに精製rAAV9を転送します。精製rAAV9をアリコート（100から400μL/チューブ、AAVのボリュームと力価に応じて）および-80℃でウイルスを保管してください。
    注：繰り返しの凍結解凍を避けてください。

rAAV9の力価の4測定

  1. 標準DNAサンプルを準備します。
    1. 具体的かつ効率的なPCRをデザインrAAV9ベクターのためのプライマーおよびPCR条件を最適化します。
      注：本研究で使用したプライマーは、「フォワード：TCGGGATAAAAGCAGTCTGG;リバース：TCGGACGGAGATACGTGAGT "です。 PCR反応を以下の条件で行った：95℃で3分間の初期変性。 20秒、15秒、60℃、10秒間72℃、95℃の35サイクル。そして72℃で10分間の最終伸長。 rAAV9ベクターの挿入図の配列がPCR 31の特異性および効率に影響を与える可能性がしかし、最適化されたプライマー及びPCR条件は、プラスミド特異的です。
    2. ステップ4.1.1に示す条件でPCR反応を行います。ゲル抽出キットを用いてPCR産物を精製します。
    3. 分光光度計を使用して精製DNAの濃度を測定します。 PCR生成物の分子量/長さに基づいて、DNA分子の数の濃度を計算します。
      1. MO：以下の式を用いた分子の濃度を計算しますlecular濃度（DNA分子またはその断片/ mlで）= 6.23×10 23モル-1 Xコン。 ×10 -6 / MW。注：（6.23×10 23モル-1 Avagadroの数であり、コン：DNA濃度/ mlの中で、MW：グラム/モルの分子量）。 PCR生成物の得られた濃度は、100μg/ mlのであり、その長さは200 bpである場合、例えば、二本鎖DNAの分子量は、各ヌクレオチドの2×200×310 = 124,000（平均分子量であります一本鎖DNAは、約310グラム/モル）です。分子濃度（DNA分子/ ml）を6.23×10 23モル-1×100 / mlの×10 -6 / 124,000グラム/モル= 5.18×10 14 DNA分子/ mlに=。
      2. DNAフラグメントの希釈系列を行い、10 13分子/ mlの濃度の標準試料を準備し、10 12分子/ mlで、10 11分子/ mlで、10 10分子/ mlで、10 9分子/ mlで、10 8分子/ mlで、10 7分子/ mlです。 （ステップ4.6で、定量PCR）定量PCR用の各標準試料用の溶液1μlを使用してください。
  2. 10倍のDNAseバッファーを5μl、DNアーゼの1μlの（10,000 U / ml）を、およびのddH 2 Oを39μlの総体積は50μlのであるべきで精製したrAAV9溶液5μlを混ぜます。
  3. 残留パッケージされたプラスミドDNAを除去するために30分間37℃でバイアルをインキュベートします。
  4. 10分間95℃でDNアーゼを不活性化します。ソリューションをクールダウン、H 2 Oの44μlを、10倍のDNAseバッファーを5μl、およびプロテイナーゼKのストックを1μl（10mg / ml）を追加します。
  5. 2時間、50℃で溶液をインキュベートします。反応を停止し、95℃で10分間プロテイナーゼKを不活性化します。
  6. 定量的PCR（定量PCR）アッセイのための試料1μLを使用してください。力価を計算します。
    1. サンプルのFRを使用して、ステップ4.1.1に設計されたプライマーを用いて定量的PCR（定量PCR）を実行しますオムステップ4.1.4（標準試料）、ステップ4.5から（サンプルが測定されます）。
      1. 各反応について、（Taqポリメラーゼ、dNTPミックス、バッファー、MgCl 2を、そして緑の色素を含む）2×グリーンマスターミックス10μlの、フォワードプライマー（5μM）の0.5μlを、逆方向プライマー（5μM）の0.5μLを混ぜますH 2 O8μlの、試料の1μlを測定します。以下の条件で定量PCRを実行します。2分および10分間95℃、50℃でサンプルを保持します。 1分15秒間、60℃で95°Cで40サイクルを実行します。溶融段階のために、30秒、15秒60℃、95℃でサンプルをインキュベートします。標準試料（ 図3）のC T番号に基づいて標準曲線を生成します。
    2. 標準曲線に対するAAVサンプルの分子濃度/力価を計算します。 rAAV9は、一本鎖DNAゲノムを有しているので、分子の濃度よりも2倍高くなります算出された値（2×電力（10、y）は、 図3B）。また、精製rAAV9の力価が原因DNアーゼとプロテイナーゼK反応（100μlの合計で5μl）をにおけるウイルスの1時20希釈に計算から得られるものよりも20倍高くなります。

ハート新生児マウスおよび遺伝子発現アッセイで5 rAAV9インジェクション

  1. ポリオキシエチレン - ポリオキシプロピレンブロックコポリマーPBS溶液中rAAV9ワーキング溶液を調製します。 1-7×10 12粒子/ mlの力価を有するウイルスストックを作ります。
    注：皮下注射することにより、各生後日に0.5から1.5にマウスをrAAV9液の50〜70μLを配信します。効率的な遺伝子の過剰発現またはノックダウンを達成するために、注入されたAAVの量を最適化するために、それぞれの研究のためのパイロット試験を行うことが推奨されます。バイアスを最小限に抑えるために、それぞれの研究のためにrAAV9.cTNT ::リュックやrAAV9.U6 ::スクランブルコントロールの同じ量を使用してください。
    注：私たちは、1〜1.5を使用しました×10 11粒子/子犬過剰発現のためおよび2.5 -生後0.5から1.5マイルCE）でのノックダウンのための5×10 11粒子/子犬。
  2. 皮下注射によってP0.5-P2.5でrAAV9で新生児マウスを扱います。
    1. rAAV9溶液と29G1 / 2、0.33のx 12.7ミリメートルのインスリン注射器を事前に記入してください。気泡を除去するように注意してください。
    2. 親指と人​​差し指で片手で低温麻酔子犬を保持します。注射の前に、無菌状態を維持するために、70％イソプロピルアルコールで飽和した綿棒スティックと子犬の背部皮膚をスワイプします。 5〜10°の角度で動物の前部 - 背部皮下に注射針を挿入します。インスリンシリンジを用いてrAAV9溶液の50-70μLを注入します。
      注：rAAV9はまた、腹腔内または静脈内注射26,27を介してマウスに送達することができます。心の中で配信する遺伝子の効率的な発現を得ることができます。しかし、腹腔内注入イオンは時々、肝臓における漏出性発現をもたらすことがあります。注射後、仔の状態を毎日モニターしました。
  3. 心臓における遺伝子発現のレベルは、定量PCR、免疫蛍光、またはウェスタンブロット（代表的な結果を図4及び5に示されている）25,26で監視することができます。
    注：マウスは、圧縮ガス源から送達CO 2により安楽死させました。組織サンプルは、動物の心拍数、運動、呼吸が停止したことを確認した後に採取しました。新生児げっ歯類は、CO 2安楽死に耐性があると鋭いハサミを使用して断頭により安楽死させました。この方法は、アメリカ獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。

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結果

rAAV9.cTNT :: GFPまたはrAAV9.U6 ::のshRNAプラスミドのrAAV9構築のための戦略は、それぞれ図1及び2に示されています。例として、rAAV9ベクターは、マウス心臓にGFP遺伝子を過剰発現するように生成されました。得られたプラスミドは、2 ITRのサイト（ 図1）によって隣接cTnTの:: GFPカセットを含みます。 rAAV9.U6 :: shRNAベクターがTRBPのmRNAを?...

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ディスカッション

プラスミド構築の際に望ましくないITR再結合を最小限にすることが重要です。ウイルスを生成する前に、人は必ず制限消化及びアガロースゲル電気泳動を使用してAAVプラスミドのITRの完全性を監視しなければなりません。 100％完全なプラスミドを得ることは不可能であるが、再結合率が可能な限り少なくする必要があります。 20％未満が成功rAAV9包装のために許容可能です。注目すべきは、?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)Polysciences, Inc. #23966-2
Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)Beckman Coulter, Inc# 362183
Nuclease, ultrapureSIGMA#E8263-25KU
Density Gradient Medium(Iodixanol)SIGMA#D1556-250ML
Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membraneEMD Millipore Corporation#UFC910008
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hubSIGMA#CAD7942-12EA
Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution)SIGMAP5556-100ML
Proteinase KSIGMA3115828001
DNase IRoche10104159001
Centrifuge machineThermo Scientific75004260
Centrifuge SystemBeckman Coulter363118
UltracentrifugeBeckman Coulter
DMEM mediumFisher ScientificSH30243FS
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals              S11150
rAAV9 vectorPenn Vector CoreP1967

参考文献

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.

One of the authors names and affiliation was corrected from:

Jian-Ming Jiang3,4
3 Department of Genetics, Harvard Medical School
4 Howard Hughes Medical Institute

to:

Jianming Jiang5
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

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