バイオフィルム除去窒素パージすることなく、二酸化炭素エアロゾルを使用します

要約

Biofilms on surfaces can be effectively and rapidly removed by using a periodic jet of carbon dioxide aerosols without a nitrogen purge.

要約

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. Therefore, it is highly desirable to remove biofilms from surfaces. Many studies on CO₂ aerosol cleaning have employed nitrogen purges to increase biofilm removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning. However, in this study, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from polished stainless steel surfaces. CO₂ aerosols are mixtures of solid and gaseous CO₂ and are generated when high-pressure CO₂ gas is adiabatically expanded through a nozzle. These high-speed aerosols were applied to a biofilm that had been grown for 24 hr. The removal efficiency ranged from 90.36% to 98.29% and was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm as the treatment time was varied from 16 sec to 88 sec. We also performed experiments to compare the removal efficiencies with and without nitrogen purges; the measured biofilm removal efficiencies were not significantly different from each other (t-test, p > 0.55). Therefore, this technique can be used to clean various bio-contaminated surfaces within one minute.

概要

Biofilms are complex bacterial community structures in which bacterial cells are embedded within self-produced matrices of extracellular polymeric substances, held together, and protected from the external environment. Biofilms can present a public health risk and cause economic losses because they can form on various surfaces, including medical implant materials and devices, food processing equipment, and heat exchangers. In fact, biofilms have been found to be associated with 65% of all bacterial infectious diseases in humans, according to the Centers for Disease Control and Prevention¹.

Autoclaves and disinfectants such as chlorine have generally been used for the inactivation of biofilms. However, the use of an autoclave is limited for surfaces that can neither withstand high temperature steam nor be placed into the autoclave. Disinfectants are not suitable for surfaces sensitive to chemical treatment or prone to collecting toxic oxidation products². In addition, the biofilm should not only be inactivated, but also removed in order to prevent the attachment of new cells onto the surface, thereby forming a new biofilm³. However, it is difficult to remove biofilms using methods based on viscous fluid shear because the flow velocity near the surface is almost zero and the shear force usually cannot overcome the adhesive forces of micron- and submicron-sized substances. Moreover, the biofilm matrix is known to act as a physical and chemical barrier¹.

Many physical and mechanical techniques have been developed to remove biofilms from surfaces, including ultrasonic vibration¹, electric currents⁴, laser irradiation⁵, and high-pressure water sprays⁶. Each technique has its own pros and cons. Ultrasonic vibration and electric current can be used to control biofilm formation; however, they require a particular configuration and conductive surfaces, respectively, requiring additional shear stress^{1, 4}. Laser irradiation can be applied to a limited area and to hard surfaces; however, some live and dead cells remain on the surface⁵. High-pressure water sprays effectively remove biofilms; however, their high momentum can cause damage to soft substrates⁶.

Biofilm removal using CO₂ aerosols has been previously proposed. It has shown promising results, with high removal efficiencies within a short time^7-11. CO₂ aerosols are generated by adiabatic expansion of a high-pressure CO₂ gas through a nozzle, and they are applied to the surfaces contaminated with a biofilm. This cleaning technique utilizes the momentum transfer of solid CO₂ particles and the solvent action of the melted CO₂ liquids, followed by the aerodynamic shear force of the CO₂ gas¹². Compared with high-pressure N₂ gas jets, CO₂ aerosol jets at the same stagnation pressure are much more effective in removing E. coli biofilms⁷. Moreover, although the momentum of the solid CO₂ that is delivered to the bacteria is considerably high, the momentum of the total aerosol jet applied to the solid surface is substantially lower than that of water jets. Therefore, damage-free cleaning is possible using this CO₂ aerosol technique.

In this protocol, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from a polished stainless steel surface. In fact, nitrogen purges have been used in many CO₂ aerosol studies to increase the removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning, even though heating with a hot plate or infrared lamps and employing dry boxes have also been adopted¹². The surface biofilm formation and the optimized cleaning procedures are described below. The removal efficiency was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm on the surface.

プロトコル

バイオフィルム形成のための表面の調製

1. 機械式カッターでチップ（10×10ミリメートル^2）に1 mm厚の304ステンレス鋼板をカットします。
2. 10分ごとに、アセトン、メタノール、および脱イオン（DI）水を順次内のチップの超音波洗浄を行ってください。有機汚染を除去するために、ガラスのような物質で作られた耐溶剤性容器を、使用してください。
3. 3-5秒間DI水を流しながらチップを洗浄します。
4. 3~5秒間N ₂ガス流を用いてチップを乾燥させます。

細菌培養物の調製

1. P.を取りますプチダ KT2440（親切教授宋東国李、UNIST、韓国によって提供される）-80°Cディープフリーザーに保存されている株式。
2. 1分後に室温で解凍し、凍結した原液の最上層はスラッシュになります。原液の溶融層にループを浸し。
3. ルリア上にストリークに細菌をこのループを使用します1.5％寒天を含む-Bertani（LB）プレート。
4. 細菌コロニーを成長させるために30℃で一晩プレートをインキュベートします。
5. 新鮮なループを使用してプレートから単一コロニーを採取。
6. 単一の細菌コロニーを含むループで50ミリリットルコニカルチューブにLBブロスの10ミリリットルを接種します。
7. 30℃で16時間および160 rpmで振とう培養器で培養液をインキュベートします。

表面上3.バイオフィルム形成

1. 各チップの表面を殺菌するために、1-2秒ごとに5回をピンセットで準備された各チップをピックアップし、70％エタノールでそれらを浸し。チップは浸漬中にピンセットで開催されていることを確認してください。
2. 、オートクレーブ滅菌DI水にし、LBブロス順次に各チップを浸し1-2秒ごとに、5回、残りのエタノールを除去します。
3. 2チップを搭載した6ウェル培養プレート中でこれらのチップを置き、ウェルあたり5ミリリットルのLBブロス。
4. LBブロスが到達中の濃度まで、細菌培養物を希釈8×10 ⁸細胞/ ml（600 nmの波長での光学密度：〜0.8）。
5. 希釈した細菌培養物の50μlの各ウェルに接種します。
6. バイオフィルムの形成のために24時間振盪せずに30℃で培養します。

4. CO ₂エアロゾルクリーニング

1. ゆるく取り付けられ浮遊細菌を除去するために、10mM酢酸アンモニウム緩衝液中のバイオフィルム形成のチップ（揮発性に）5回浸します。
2. 空気は穏やかに流れて安全キャビネットでこれらのチップを乾燥させます。
3. 乾燥直後に、ジェットの軸に沿ってCO ₂ノズルから20ミリメートルである積載場所、上のチップを配置します。 40°の角度にジェット軸を傾けます。
4. ガス圧力調整器を使用して、それぞれ5.3 MPaで0.7 MPaのにCO ₂とN ₂ガスの停滞圧力を設定します。
5. チップの中央部にエアロゾルジェットを適用します。固体CO ₂を含むホワイトエアロゾルはすべき見えるように。 5秒間のCO ₂用の電磁弁を「オン」にしてから、3秒間「オフ」に回し：定期的に手動で制御されるスイッチを使用して（サイクル8秒）。窒素パージを使用する必要がある場合、N ₂の連続的な供給のための電磁弁をオン。
6. 窒素パージでとすることなく、CO ₂ 16のためのエアロゾル、40、および88秒でチップを扱います。陰性対照として処理せずにチップを保持します。

除去効率5.分析

1. 制御およびエアロゾル処理されたチップ上の細菌の細胞を染色するためにDI水中：1μM緑色蛍光核酸染色（500分の480 nmの励起/発光波長）を準備します。
2. 染色液にチップを置きます。
3. 37℃で30分間光せずにインキュベータ内のチップをインキュベートします。
4. インキュベーション後、穏やかに過剰な蛍光色素を除去するために流れるDI水でチップを洗浄します。
5. チップのwiを乾燥目のN ₂ガス流量。
6. 落射蛍光顕微鏡、40X対物レンズ、CCDカメラを使用して、各チップのためのビューの5ランダムフィールドの蛍光顕微鏡像（321×240μmの^2）を取ります。
7. 例えば、ImageJのような画像処理ソフトウェアを使用して各画像の蛍光強度を得ました。 ImageJのでは、「プロセス」メニューの「減算背景」機能を使用し、「分析」メニューの「測定値の設定」ウィンドウ内の「統合密度」を選択します。蛍光強度を得るために、「分析」メニューの「測定」を行います。
8. 以下の式に従ってバイオフィルム除去の効率を計算する：100％×（制御チップのIを -処理されたチップのIを ）/ Iが計算された蛍光強度である（制御チップのI）。
9. 平均除去効率と標準偏差を取得します。で使用してください各ケースの少なくとも4チップ。

結果

CO ₂エアロゾルは、Pを除去するために使用されましたSUS304の表面（ 図1）からプチダバイオフィルム。表面の大部分は、成長の24時間後にバイオフィルムで覆った。バイオフィルムの大部分はCO ₂エアロゾル（ 図2）を用いて除去しました。予想されるように、 図3は、増加したCO ₂エアロゾル処理時間などのバイオフィ...

ディスカッション

Previously, we conducted optimization studies on CO₂ gas pressure, jet angle, and distance to the solid surface in CO₂ aerosol cleaning⁷. Unlike our previous studies, in the present study, a nitrogen purge was not included in the aerosol (Figure 1). Moreover, 304 stainless steel was used in this protocol, since it is one of the most common stainless steels and is widely used in the food industry. The polished surface is beneficial for fluorescence analysis because of a un...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
304 stainless steel	Steelni (South Korea)		Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6-well culture plate	SPL Life Sciences (South Korea)	32006
Ammonium acetate buffer	Sigma-Aldrich (USA)	667404	10 mM
Dual gas unit	Applied Surface Technologies (USA)	K6-10DG	One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (USA)	Invitrogen	Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope	Nikon (Japan)	Eclipse 80i
40X objective lens	Nikon (Japan)	Plan Fluor	NA: 0.75
CCD camera	Photometrics (USA)	Cool SNAP HQ2	Monochrome