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要約

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

要約

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

概要

力の影響を受けやすい、遺伝的にコードされたFRETセンサーは、最近、生細胞の引張ベースの力を測定するタンパク質1、2、3、4の両端に印加されている方法を機械的な力への洞察を提供するための重要なツールとして浮上しています。これらのツールを使用して、研究者は、従来の蛍光顕微鏡を使用して、生きた細胞における非侵襲的に画像細胞内力することができます。これらのセンサは、弾性ペプチド3によって分離されたFRET対（ドナー及びアクセプター蛍光タンパク質、最も頻繁青色ドナーおよびアクセプタ黄色）から成ります。 C-またはN末端タグとは対照的に、このセンサーは、分子歪みゲージとして挙動、タンパク質を横切って伝達される機械的な力を測定するためにタンパク質の内部部位に挿入されます。 FRET-Pとの間の距離の増加にセンサ結果を横切って機械的張力を増加させ空気減少FRET 3で得られました。結果として、FRETは逆の引張力に関連しています。

これらの蛍光ベースのセンサは、焦点接着タンパク質（ビンキュリン3及びタリン4）、細胞骨格タンパク質（αアクチニン5）のために開発されており、細胞-細胞接合タンパク質（E-カドヘリン6、 図7は 、VEカドヘリン8、及びPECAM 8）。これらのバイオセンサーにおいて最も頻繁に使用され、よく特徴付け弾性リンカーはTSmodとして知られており、スパイダーシルクタンパク質の鞭毛から得られた40個のアミノ酸、（GPGGA）8、の反復配列から構成されています。 TSmod引張力3の1〜5 pNでのFRET応答と、線形弾性ナノスプリングとして動作することが示されています。鞭毛の異なる長さは、動的Rを変更するために使用することができますTSmod FRET力感度9のアンジュ。鞭毛に加えて、スペクトリンは、（HP35として知られている）5とビリンヘッドピースペプチド4を繰り返し、同様の力バイオセンサ4におけるFRET対の間に弾性ペプチドとして使用されてきました。最後に、最近の報告ではTSmodも圧縮力10を検出するために使用することができることを示しました。

我々は最近、内因性と同様に動作ミニNesprin2G（ 図2C）として知られている、以前に開発された切断型Nesprin2Gタンパク質に挿入TSmodを使用して、核-細胞骨格（LINC）複合タンパク質Nesprin2Gのリンカーの力センサを開発しましたNesprin-2G 11。 LINC複合体は核ラミナに細胞質細胞骨格をつなぐ、核の外側から内側につながる複数のタンパク質が含まれています。 Nesprin-2Gは、両方に結合する構造タンパク質であります細胞質内及び核周囲空間にSUNタンパク質へのアクチン細胞骨格。私たちのバイオセンサーを使用して、我々はNesprin-2Gは、NIH3T3線維芽細胞2におけるアクトミオシン依存テンションの対象であることを示すことができました。これは、その力は直接核LINC複合体中のタンパク質間で測定した初めてだったし、メカノにおける核の力の役割を理解するための重要なツールになる可能性があります。

以下のプロトコルは、哺乳動物細胞におけるNesprin張力センサ（Nesprin-TS）の発現を含むNesprin-2G力センサ、ならびにNesprin-を発現する細胞のFRET画像の取得および分析を使用する方法の詳細な方法を提供しますTS。スペクトル検出器を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用して、スペクトルアンミキシング及びレシオメトリックFRETイメージングを用いて増感発光FRETを測定する方法の説明が提供されます。出力レシオメトリック画像は相対的な資格を作るために使用することができますntitative力の比較。このプロトコルは、線維芽細胞におけるNesprin-TSの発現に焦点を当てているが、それは、細胞株および初代細胞の両方を含む他の哺乳動物細胞に容易に適合可能です。また、画像取得およびFRET分析に関連するこのプロトコルは、容易に他のタンパク質のために開発された他のFRETベースの力のバイオセンサーに適用することができます。

プロトコル

1. Nesprin-2GセンサーDNA及び他のプラスミドDNAを得ます

  1. 商業的供給源からNesprin-2G TS（張力センサ）、Nesprin-2G HL（ヘッドレス）制御、mTFP1、ビーナス、およびTSmodを得ます。全てのDNAプラスミドを伝播し、先に12、13のように、そのようなDH5-αのような標準的な大腸菌株を使用して精製します。

Nesprin-2G及び他のプラスミドDNAと2トランスフェクト細胞

  1. 温度（37°C）とCO 2（5％）の調節と、標準的な細胞培養インキュベーター中で6ウェル細胞培養皿に70〜90％コンフルエンスにNIH 3T3線維芽細胞を成長させます。細胞増殖培地については、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用します。
  2. 細胞培養フード中で、培地を除去し、減血清細胞培地の約1 mLで各ウェルをリンスします。各ウェルに減少し、血清細胞培地の800μLを追加そしてインキュベーター中で6ウェルチャンバーを置きます。
  3. 脂質キャリア溶液35μLと1.5mlチューブに還元血清細胞培地のピペット700μL「はlipomix」を形成します。ピペッティングにより混和します。 「L」でチューブにラベルを付けます
  4. 6本の1.5 mLチューブに収集し、各チューブに還元血清細胞培地の1 6を介してピペット100μLそれらを標識します。
    1. mVenus 5.ピペット1μgのチューブ内チューブ3,4ピペット1 mTFPμgの内管1と2ピペット2 Nesprin-HLμgのにステップ1、ピペット2 Nesprin 2G-TSのμgのからのプラスミドDNA濃度を用いてチューブ6に再使用しないでくださいピペットチップをDNAの異なる種類をピペットとき。
  5. 各標識されたチューブ（1-6）に「L」チューブからlipomixのピペット100μLとを繰り返しピペッティングにより混合します。各チューブのためのクリーンなピペットを使用してください。 10〜20分間インキュベートします。
  6. 70〜90％コンフルエントで6ウェルチャンバーの各標識されたチューブからウェルに200μLを加えます細胞。対応するDNAを用いて、各ウェルの上部にラベルが追加されました。 4~6時間インキュベーター中で6ウェルチャンバーを置きます。
  7. 培地を吸引し、洗浄するために減血清細胞培地の1~2ミリリットルを加えます。 、減血清細胞培地を吸引し、各ウェルにトリプシン2 mlを加え、そしてインキュベーター（5〜15分）で6ウェル皿を置きます。
  8. 細胞は、インキュベーター内でリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解した20μgの/ mlの濃度でフィブロネクチンの層で被覆6ガラス底観察皿を取り外しています。細胞培養フード（約20分）で被覆する皿に表面を可能にします。
  9. 細胞が剥離された後DMEMを2mLを添加することによってトリプシンを中和します。
  10. ウェル標識15 mL遠心管にそれぞれの内容を転送し、スイングローター遠心機で5分間90×gでスピンダウン。上清を吸引し、ピペット混合によるDMEM 1,000μLの各細胞ペレットを再懸濁。
  11. からフィブロネクチン混合物を吸引ガラス皿とピペットガラス皿に各細胞懸濁液を1,000μL。
  12. 細胞をガラス皿（〜15分）の底に沈殿した後、各ウェルの細胞インキュベーター内の場所に+ 10％FBS + 1％ペニシリン - ストレプトマイシンDMEMの別の1 mLを加え。細胞が付着し、少なくとも18〜24時間センサーを発現することを可能にします。
    注：細胞は、（ 材料の表を参照）は、市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされます。代替的に、安定な細胞株は、毒素に対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドを用いて選択することができる（Nesprin-TSと-HLためのpcDNAプラスミドはジェネティシン耐性を発現する細胞は、（ 材料の表を参照）を提供するDNAリポジトリウェブサイト上で利用可能です）。また、ウイルス感染法（レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）をトランスフェクトすることが困難である細胞内センサーを発現させるために利用することができます。
  13. Nesprin-TSに加えて、ゼロためNesprin HLと追加の細胞をトランスフェクトステップ2.1から2.12に記載のようにCE制御、。 TSmodもゼロ力制御として使用することができ、Nesprin-HLと同様のFRETを示すべきです。
  14. スペクトル指紋（ステップ4参照）を生成するmTFP1と金星で細胞をトランスフェクトします。
    注：mTFP1と金星は、典型的にはNesprin-TSより高いレベルで発現し、そのようなものとして、DNAのより低い量は、同様の発現レベルを達成するために、トランスフェクトされる必要があるかもしれません。

3.トランスフェクション効率を確認してください

  1. おおよそ18〜24時間のトランスフェクションを完了した後、図中の細胞（通常5~30％）の総数に蛍光細胞の数を比較することにより、トランスフェクション効率を調べるために、倒立蛍光顕微鏡を使用します。
    1. 462ナノメートル（mTFP1）または525 nmの（金星）と492 nmの（mTFP1）または525 nmの（金星）付近に中心発光フィルターの近くに励起周波数を備えた蛍光顕微鏡を使用します。
      注：また、GFPフィルターセットはmTFP1の組み合わせをキャプチャしましますNUSの排出量およびトランスフェクション効率の確認が可能になります。
  2. トランスフェクション後48時間以内に画像生細胞。
    1. あるいは、5分間、PBS中の店舗、および48時間後8ビューの（カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS）で4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定。
      注：48時間を超えて、信号の品質と強度が減衰します。細胞を固定する8を発現さFRETを含め、その状態を保持し、媒体を装着すると、FRET 14に影響を与える可能性がしかし、細胞のみ、PBSで画像化されるべきです。発現の変化があってもよいように固定された細胞のみが、他の固定された細胞と比較することができます。
      注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。

スペクトルアンミキシング4. mTFP1のキャプチャスペクトル指紋と金星フルオロフォア

  1. 細胞培養フード内で、撮像mediuと細胞培地を交換10％ウシ胎児血清を補充したM（HEPES緩衝化）。
  2. 温度制御（37°C）共焦点顕微鏡のステージに表示皿を置き。
  3. 1.4の開口数60X倍率でオイル対物上mTFP1トランスフェクト細胞とガラス視聴皿を置き。
    注記：オイルは密接ガラス基板の屈折率に似せて60X対物レンズでレーザ走査型顕微鏡に使用されます。油は、対物レンズの上に置かれ、カバーガラスと直接接触しています。
  4. mTFP1は、458 nmの励起源から500nmに中心発光帯域通過フィルタで発現細胞見つけ。
  5. 視野中の蛍光細胞と、（ここで使用されるソフトウェア中の「ラムダモード」）スペクトル検出モードを選択して分光画像（ 図3-1）を取り込みます。 10nmの増分（ 図3-3）を使用して458 nmで超えるすべての周波数を含みます。明るいfluorescを選択細胞（20ピクセル半径）でENT領域（ROI）。
    注：mTFP1発現ROIのスペクトル形状は、セルを横切って比較的一定のままであるべきです。形状が大きく変化する場合、信号対雑音比を改善するために、レーザおよび利得設定を再調整します。
  6. クリックすることで、スペクトルのデータベースに、蛍光ROIが意味する正規化強度を追加「データベースにスペクトルを保存します。」
  7. レーザパワーを最適化し、良好な信号対雑音比が達成されるように得ます。設定が異なる機器によって異なります。背景参照として非蛍光、非トランスフェクト細胞を使用してではなく、検出器（飽和点）のダイナミックレンジを超えて、細胞が明るくなるまで利得及び電力を増加させます。背景細胞は平均化した後に検出可能な蛍光を持つべきではありません。
  8. 以下の例外を除いて金星トランスフェクト細胞のためのプロセスを繰り返します。
    1. 励起周波数は515 nmであることを確認し、帯域通過フィルタは、CEであることビーナス発現細胞の位置を特定する際に530 nm付近ntered。
    2. 「スペクトルモード」の代わりに458 nmで515 nmの励起周波数を使用します。

5.キャプチャ未撹拌の画像

  1. 撮影モードの切り替え「スペクトルアンミキシング。」
  2. アンミキシングチャネル（ 図3、矢印-2）に金星とmTFP1のスペクトル指紋を追加します。
  3. バック458 nmのアルゴンソースへの励起レーザを設定します。
  4. 60X油客観上記Nesprin-TS見て料理を置きます。
  5. 十分に明るい式を有する蛍光細胞に焦点を当てた後、信号対雑音比を最適化するゲインとレーザパワーを調整します。
    注：Nesprin-TSのFRET効率が20％近くにあるので、非混合ビーナス画像は非混合mTFP1画像よりも実質的に調光器であるべきです。許容可能なパワーとゲイン設定が反復的に決定された後は、これらのパラメータは、すべての画像CAPTのために一定のままでなければなりませんured。
  6. 比較的近い明るさでNesprin-TS細胞の15-20画像の最小値をキャプチャし、（すべての飽和画素が画像処理中に除去される）過度の画素の飽和を避けます。
  7. 同じ撮像パラメータを用いNesprin-HL細胞を用いた撮影処理を繰り返します。

6.画像処理および比画像解析

  1. オープンソースのImageJ（フィジー）ソフトウェア（http://fiji.sc/）を使用して、BioFormats Readerを使用してネイティブ形式の画像を開きます。
  2. 前処理画像と以前に確立されたプロトコル15を使用して比画像を計算します。

結果

上記のプロトコルに従って、プラスミドDNAは、DNAリポジトリから取得し、 大腸菌細胞に形質転換しました。センサDNAを発現する大腸菌は、LB /アンピシリンプレートから選択し、液体LBブロス中で増幅しました。ベクターの増幅後、DNAプラスミドは、標準的な、市販のDNA単離キットを使用して、TRIS-EDTA緩衝液に精製しました。分光光度計を用いて、精製さ...

ディスカッション

Nesprin-2G、核LINC複合体中のタンパク質を横切る機械的張力の生細胞イメージングの方法及び実証は、上記に概説しました。前にこの作業を、そのようなマイクロピペット吸引、フローサイトメトリー、磁気ビーズ、および顕微鏡レーザアブレーションのような種々の技術が、細胞核に歪みを適用するために、そのバルク材料特性16、17、18

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

この作品は、トーマスF.と（12月に）ケイト・ミラー・ジェフレスメモリア信託（DEC）はNIH助成金R35GM119617によってサポートされていました。共焦点顕微鏡イメージングは​​VCUナノキャラクタリゼーションコア（NCC）施設で行いました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Nesprin-TS DNAAddgene68127Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNAAddgene68128Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNAAddgene54613Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNAAddgene27793Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNAAddgene26021Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent CellsBiolineBIO-85026
Liquid LB MediaThermoFisher10855001https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture PlatesSigma-AldrichL5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
AmpicillinSigmaA9518
SpectrophotometerBiorad273 BR 07335SmartSpec Plus
quartz cuvetteBiorad1702504Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kitMacherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dishFalcon-Corning353046Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell mediaGibco11995-065DMEM(1x)
Bovine SerumLife Technologies16170-078
reduced serum cell mediaGibco31985-070Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solutioninvitrogen11668-019Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tubeDenvillec2170
TrypsinGibco25200-0560.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dishIn Vitro ScientificD35-20-1.5-N35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
FibronectinThermoFisher33016015fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tubeGreiner bio-one188261
swinging rotor centrifuge Thermo electronCentra CL2Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hoodForma Scientific1284
climate controlled cell culture incubatorThermoFisher3596
inverted LED widefield fluorescent microscopeLife technologiesEVOS FL
Clear HEPES buffered imaging mediaMolecular ProbesA14291DJ
Fetal bovine SerumLife technologies10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources Zeiss LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth MediaNewengland BiolabsB9020s
NIH 3T3 FibroblastsATCCCRL-1658

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