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要約

ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。

要約

タンパク質またはペプチドと無機材料との間の相互作用は、いくつかの興味深いプロセスにつながります。例えば、無機物でタンパク質を結合する独特の特性を有する複合材料の形成をもたらします。また、生物付着の好ましくないプロセスが表面上の生体分子、主にタンパク質の吸着によって開始されます。この有機層は、細菌のための接着層であり、それらは表面と相互作用することを可能にします。有機 - 無機界面での相互作用を支配する基本的な力を理解することは、研究の多くの分野のためには重要であると、光学機械的および生物医学的用途のための新しい材料の設計につながる可能性があります。本稿では、ペプチドまたはアミノ酸と明確に定義された無機表面のいずれかとの間の接着力を測定するために、AFMを利用して単一分子力分光法の技法を示しています。この技術は、AFMに生体分子を付着するためのプロトコルを含みます原子間力顕微鏡による共有結合柔軟なリンカーおよび単一分子力分光測定を通じて先端。また、これらの測定値の分析が含まれます。

概要

タンパク質および無機鉱物との間の相互作用は、独特の特性を有する複合材料の構築につながります。これは、高い機械的強度、または独自の光学特性を有する材料を含みます。例えば、 図1、 図2は 、鉱物ヒドロキシアパタイトとタンパク質コラーゲンの組み合わせは、異なる機能のための軟質または硬質の骨のいずれかを生成します。 3短いペプチドはまた、特異性の高い無機材料をバインドすることができます。 4、5、これらのペプチドの6特異性は、結晶を成長させる、9ナノ構造材料を製造する、8、7、新たな磁気及び電子材料を設計するために使用されています、 10とナノ粒子を合成します。 図11は、ペプチドまたはタンパク質と無機材料との間の相互作用の根底にあるメカニズムを理解することは、したがって、私たちは改善された吸着特性を持つ新しい複合材料を設計することができるようになります。免疫応答とインプラントの間期は、タンパク質によって媒介されるので、また、より良い無機物質とタンパク質の相互作用を理解することは、インプラントを設計する当社の能力を向上させます。無機表面と相互作用するタンパク質が関与するもう一つの重要な領域は、防汚材料の製造です。 12、13、14、15生物付着生物が表面に付着する望ましくないプロセスです。それは私たちの生活に多くの有害な影響を与えます。例えば、医療機器上の細菌の生物付着は、院内感染につながります。ボートや大型船舶の海洋生物の生物付着が増加します燃料の消費量。 12、16、17、18

単一分子力分光法（SMFS）は、AFMを用いて、直接アミノ酸または基質とペプチドの間の相互作用を測定することができます。このようなファージディスプレイ、27、28と19、20、21、22、23、24、25、26他の方法 水晶微量天秤（QCM）29または表面プラズモン共鳴（SPR）29、30、31、32、REF "> 33小節バルク中の無機表面へのペプチドおよびタンパク質の相互作用。34、35、36 これは、これらの方法により得られた結果は、分子または凝集体の集合に関連することを意味します。 SMFSでは、1つまたは非常に少数の分子は、AFMチップに固定されており、所望の基材との相互作用が測定されます。このアプローチは、表面からのタンパク質を引っ張ることによって、タンパク質のフォールディングを研究するために拡張することができます。また、細胞タンパク質およびそれらのリガンドに対する抗体の結合との間の相互作用を測定することができます。 37、38、39、40本稿では、シラノール化学を用いてAFMチップにペプチドまたはアミノ酸のいずれかを接続する方法を詳細に説明しています。また、紙は力の測定を実行する方法および分析する方法について説明します結果。

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プロトコル

1.ヒント修正

  1. 購入窒化シリコン（Si 3 N 4）、シリコンチップとAFMカンチレバー（〜2nmの公称カンチレバー半径）。
  2. 20分間無水エタノールに浸漬して、各AFMカンチレバーを清掃してください。室温で乾燥しました。その後、5分間O 2プラズマにそれらを暴露することによってカンチレバーを扱います。
  3. 15の割合で（3センチ）を含む溶液メチルトリエトキシシラン、3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン上記のきれいなヒントをサスペンド：1（v / v）の不活性雰囲気（窒素やアルゴンのいずれか）の下でデシケーター中とにデシケーターを接続真空ポンプ。混合したシラン化合物のこれら2つのタイプの単層を形成するために2時間真空。
  4. ホットプレート上でのヒントを配置する（このプロセスのために作製）金属製のチップホルダーを使用します。その後、大気条件下で、70℃で10分間のヒントを乾燥させます。使用前に、エタノールを使用して、ホットプレート、金属製のホルダーとピンセットを清掃してください。
  5. 部屋tでのヒントをクールemperature、その後で1時間、0.5％（v / v）のトリエチルアミンを含有するクロロホルム中の5 mMの濃度で、フルオレ-PEG-N-ヒドロキシカルボニル（Fmoc-PEG-NHS、MW 5,000 Da）での溶液にチップを浸漬室温。
  6. 5分間クロロホルムでヒントを浸漬した後、さらに5分間、ジメチルホルムアミド（DMF）中に浸します。結合したPEG分子のFmoc基を脱保護するために、30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にヒントを浸します。 4分間DMF中でチップを浸漬した後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中でさらに4分間。 3回浸漬シーケンシャルを繰り返します。
  7. アミノ酸のカップリングのために、N末端保護アミノ酸（AA）/ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）/ 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムhexafluophosphateを含む溶液にチップを浸漬1.5時間5mLのNMP中の30mMの総濃度で、1：1：1のモル比で（HBTU）。
  8. ペプチドカップリングのために、5 mL溶液の続きにヒントを浸し保護されたペプチド40mgのaining（N末端及び側鎖、例えばのFmoc-Glnを（Trtの）-Pro-ALA-のSer（tBuで）-Ser（tBuで）-Arg（PBF）-Tyr（tBuで）-COOHを。） 、15mgの2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、および2時間NMP中DIPEA 5mLの。
  9. 4分間のNMP中のヒントを浸します。 1及びNMP中0.65 Mの合計濃度：次に、アセチル基によってリーマ無料/未反応NH 2を保護するために、モル比4で無水酢酸/ DIPEAの混合物中で30分間のヒントを浸します。
  10. ペプチドカップリングのために、二つの追加の手順を実行します。
    1. 、ペプチドの側鎖を脱保護し、1時間、95％TFA、2.5％のトリイソプロピルシラン、2.5％の水を含む溶液にチップを浸漬し、次いで、クロロホルムおよびDMFで洗浄するためです。
    2. 30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にチップを、ペプチドのFmoc基を除去浸漬するためです。
  11. 順次ペプチド/アミノ酸 - 官能ディップDMF（ペプチド）またはNMP（アミノ酸など）、クロロホルム、50％のエタノールと水の4つの分間、Dヒント。最後に、空気中のチップを乾燥させます。

2.表面の準備

  1. マイカを準備します。スコッチテープを使用して、各使用前に基質（9.9ミリメートルの直径）を切断します。その後、三重蒸留水（TDW）で表面を洗います。
  2. TiO 2被覆シリコンを準備します。
    1. ダイヤモンドペンを用いて2cmの正方形にシリコンウェハ（100）を切断します。
    2. アセトンを充填した15mLの試験管内に基板を配置し、超音波浴中で5分間、それを超音波処理します。次いで、イソプロパノールを充填した15 mLの試験管にこの表面を置き、5分間、それを超音波処理。窒素を使用して基板を乾燥させます。
    3. 5％（重量/容量）溶液を調製し、エタノール中の界面活性剤（ 例えば 、BYK-348）を溶解します。その後、2 mLの30の％のTiO 2分散液に界面活性剤溶液の0.02 mLを加え。
    4. 得られた溶液から、ドロップキャスト0を。清浄なSi基板上に2 mLです。
    5. 空気中で2時間、250℃でこれらのドロップキャスト表面をアニール。 41

3.シングル分子力分光測定

  1. 市販の二成分接着剤でAFMの金属製のホルダーに所望の表面を取り付けます。小さなペトリ皿のように形作られているAFM、ガラスホルダーに金属製のホルダーを配置します。トリス緩衝液（50mMのpH = 7.4）、または任意の媒体と、このホルダーを記入してください。そして、チップホルダ以下AFMステージ上にホルダーを配置します。
  2. 約10％の絶対的な不確実性（AFMソフトウェアに含まれる）熱揺らぎ法26を使用して10から30 PN / nmの範囲のバネ定数とAFMカンチレバーのキャリブレーションを行います。
  3. それが圧縮された基板に接触するまで、基板にアミノ酸又はペプチド官能先端に近づくことにより、相互作用の力を測定〜200 pNでの力と直ちに〜200nmの距離のために、0.1〜0.8ミクロン/秒から、様々な速度で先端を撤回。

4.データ解析

  1. フォトダイオードの感度（V / m）を乗算し、実験的に決定されたばね定数を使用して強制的に偏向値（V）に変換します。 42これは、AFMソフトウェアによって自動的に行われます。
    1. 1単一分子イベントとFD曲線を得るためには、曲線の数百（800-1,500）を記録。単一分子曲線に2つのピークを取得します。最初のピークは、表面と分子の特異的な相互作用に先端部と表面と第2のピークに相当するとの間の非特異的な相互作用を示しています。 FD曲線は、これら2つのピークを超えて含有する場合、最も可能性の力の計算からそれらを捨てます。
      注：つだけ接着イベントは（曲線の10〜30％の）考慮されます。 43
  2. は、その後のヒストグラムを調製するために使用された積載率のセットを取得する直前に破裂に明らか負荷率、ワームのようなチェーン（WLC）モデル44との距離曲線対フィット少なくとも50の力を計算するために、見かけの負荷率。基板からカンチレバーを分離した後力のジャンプからのペプチド/アミノ酸と表面との間のバインド解除力を求めよ。

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結果

図1は、先端変更手順を示します。第1のステップでは、プラズマ処理は、窒化シリコンチップの表面を変化させます。先端はOH基を提示します。これらのグループはその後、シランと反応します。このステップの終了時に、チップの表面は、遊離-NH 2基により覆われます。これらの遊離アミンは、その後のFmoc -PEG-NHS、共有結合性リンカーと反応し?...

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ディスカッション

1.3の手順、プロトコル1.4と1.7は、大規模な注意を払って、非常に穏やかな方法で行われるべきです。ステップ1.3において、チップは、シラン混合物と接触してはならず、シラン化処理は、不活性雰囲気（無水）で行われるべきです。 45これは、多層の形成を防止するために、シラン分子が容易に水分の存在下で加水分解を受けるために行われます。 45

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tipsBruker (Camarilo, CA, USA)MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm 
Methyltriethoxysilane Acros Organics (New Jersey, USA)For Silaylation of the AFM tip 
3-(Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)For Silaylation of the AFM tip
TriisopropylsilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)Used for peptide deprotection
N-EthyldiisopropylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
TriethylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
PiperidineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip Fmoc deprotection
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)Used as the covalent flexible linker  (MW = 5,000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)Alfa Aser (Heysham, England)Used as a coupling reagent. 
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)Acros Organics (New Jersey, USA)Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)Merck (Darmstadt, Germany)Used as Solvent in Tip modification procedure
ChloroformBio-Lab (Jerusalem, Israel)Used as Solvent in Tip modification procedure
Ethanol (Anhydrous)Gadot (Netanya, Israel)Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydrideMerck (Darmstadt, Germany)
PeptidesGL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine Biochem (Darmstadt, Germany) 
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation
Mica substratesTED PELLA, INC. (Redding, California, USA)9.9 mm diameter

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