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要約

我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。

要約

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

概要

タンパク質 - タンパク質相互作用は、多くの生物学的機能において重要な役割を果たしています。このように、これらの相互作用は、シグナル伝達に関与しています。細胞膜を横切るタンパク質輸送;細胞代謝; DNA複製、DNA損傷修復、組換え、および転写1、2、3、4を含む、いくつかの核プロセス。これらの相互作用に関与するタンパク質を同定することは、これらの細胞プロセスの理解を進めることが重要です。

免疫沈降（IP）は、タンパク質 - タンパク質相互作用を分析するために使用される検証技法です。共免疫沈降したタンパク質の同定を容易にするために、質量分析がしばしば利用されて5、6、7、8、9。抗体とタンパク質複合体の既知のメンバーを標的とすることにより、タンパク質複合体を単離するために、続いて質量分析を介して、その未知の成分を同定することが可能です。 ARIP4（アンドロゲン受容体相互作用タンパク質4）、転写補調節因子は、文脈に依存した方法9、10でその標的プロモーターを活性化または抑制するために、核内受容体タンパク質と相互作用します。より良いこれらの核因子を支配する転写調節機構を理解するために、我々は、精製し、LC-MS / MSシステムを使用してARIP4相互作用するタンパク質を同定するための包括的方法を記載しています。

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プロトコル

1.トランスフェクション

  1. 100 mmの培養プレートでHEK293細胞を播種（2×10 6細胞/皿）。培養10％ウシ胎児血清、100μg/ mlのストレプトマイシン、および100単位/ mlのペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中の細胞。 5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
  2. 翌日、製造業者の指示11に従ってトランスフェクション試薬を40μlを用いて、FLAGタグ付きARIP4プラスミド10μgの細胞をトランスフェクト。

2.タンパク質抽出

  1. 約36時間のトランスフェクション後、氷冷PBSで細胞を洗浄し、スクレーパーを用いて細胞を採取します。 1.5 mltubeに細胞を移し、4℃で2分間、8,000×gで、それを遠心します。吸引した上清と5倍に細胞ペレットを再懸濁し、0.4MのKClバッファーのペレット体積（高塩緩衝液：20mMのトリスHCl（pH8.0）、0.4 MのKCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、0.1％NP-40、10mMのB -メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 4℃で20分間、混合物を回転させます。
  2. 4℃で10分間、17,700×gでチューブを遠心。
  3. 新しい2 mLのチューブに上清（全細胞抽出物）を転送し、3×0 MのKCl緩衝液（希釈緩衝液の初期容量追加：20mMのトリス-HCl（pH8.0）に、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、 0.1％NP-40、10mMのβメルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。
  4. 別の遠心分離（4℃で10分間、17,700×gで）を実行し、新しい2 mlチューブに上清（全細胞抽出物）を転送。

3.免疫沈降

  1. 遠心分離（2.4）中、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液で2回洗浄し、続いてPBSで抗FLAGビーズ、0.1 Mグリシン - 塩酸、次いで1 Mトリス塩酸、50μlの洗浄：20mMのトリスを塩酸液（pH 8.0）、0.1 MのKCl、5mMのMgCl 2を、10％グリセロール、0.1％NP-40 10 m個Mβ-メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。この洗浄工程の遠心分離を4℃で1分間、2,000×gで行われます。
  2. 全細胞抽出物でFLAGビーズの50μLを混合し、穏やかに2-4°C（全細胞抽出物を1％ステップ2.4からは、将来の使用のために-80℃で維持されるべきで4時間混合物を回転させます）を入力として。
  3. マイクロスピンカラム（重力落下）にサンプルを転送します。 （入力フロースルーウェスタンブロット分析を使用して、両方のタンパク質レベルをチェック）、1.5mlチューブにフロースルーを保つ液体窒素を用いて凍結し、-80℃で保管します。
  4. FLAGビーズ（重力落下）を洗浄するために、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液）の1ミリリットルを追加します。
  5. 3.4少なくとも4回（5回の洗浄の合計のための）手順を繰り返し。

4.溶出

  1. それは1分間2,000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に列を配置します。ビーズが乾燥します。
  2. の底部キャップ列。
  3. 0.1 Mグリシン-HCl（pH2.5）の（FLAGビーズの容積に等しい）50μLを加えます。
  4. 穏やかに室温で10分間混合物を振ります。
  5. 新しい1.5 mlチューブにカラムを置き、1分間2000×gでそれを遠心します。
  6. 溶出した溶液を1 Mトリス-HCl（pH8.0）10μlので中和します。ピペッティングによりまたは渦機を用いてよく混ぜます。

5.アルキル化し、トリプシン処理

  1. 混合物（112μlの総容量）に100mMのNH 4 HCO 350μlの、CH 3 CN10μlの、及びジチオスレイトールの2μLを加えます。
  2. 56℃で30分間、試料をインキュベートします。
  3. 10分間、室温でサンプルを配置します。
  4. ヨードアセトアミドサンプルに333 mMと10μlを添加して、37℃で30分間、暗所でそれをインキュベートします。
  5. 混合物にトリプシン10μlの（33 ngの/μl）を加え、37℃で一晩静置します。

6。 LC-MS / MS分析

  1. 一晩のトリプシン処理後、LC-MS / MS機能または分析12のためにサードパーティの質量分析研究所に、最終製品を輸送します。

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結果

私たちは、160 KDaの周りに、強いARIP4信号を識別し、同様にモックサンプル制御および他のいくつかの未知のタンパク質（ 図1）のもの。 LC-MS / MS分析は、FLAGビーズ（ 表1）の画分内ARIP4複合ペプチド及び潜在的なペプチド補因子の両方を同定しました。 P62（Sequestosome1）、既知ARIP4補因子11は、このシステム11?...

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ディスカッション

効率的なトランスフェクションは、このプロトコルで成功した結果を得ることが不可欠です。したがって、我々は免疫沈降FLAGタグ付きタンパク質レベルを決定するために、ウェスタンブロット分析を使用することをお勧めします。このステップでは、IPが正常に実行されたこと、また、興味のあるタンパク質が適切に過剰発現していることを確認し、することができます。 FLAG標識タンパク?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin ColumnsBIO-RAD732-6204

参考文献

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

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