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要約

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論に簡単な詳細を示します。

要約

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

概要

遺伝子制御ネットワーク（GRNs）とシグナル伝達経路は、成体動物の体の計画を構築するために使用される胚発生の間の遺伝子の空間的および時間的発現を確立します。細胞から細胞へのシグナル伝達経路は、細胞が通信する手段を提供し、これらの調節ネットワークの重要な構成要素です。これらの細胞の相互作用は、胚発生1、2中の様々な地域でとの間の規制および分化遺伝子の発現を確立し、改良します。分泌された細胞外調節因子（リガンド、アンタゴニスト）、受容体および共受容体の間の相互作用は、シグナル伝達経路の活性を制御します。細胞内分子の品揃えは、遺伝子発現の変化、分割、および/または細胞の形で得られたこれらの入力を伝達します。主要な経路で細胞外および細胞内のレベルで使用する鍵分子の多くがあるが既知の、個々のシグナル伝達経路の複雑さに大部分の不完全な知識です。加えて、異なるシグナル伝達経路は、多くの場合、細胞外、細胞内での正または負のいずれかで互いに相互作用し、転写レベル3、4、5、6。重要なことには、シグナル伝達経路のコアコンポーネントは、非常にすべての後生動物種で保存され、特に密接に関連門の生物を比較する場合、著しく、主要なシグナル伝達経路の大部分は、多くの場合、多くの種において類似の発達機能を実行7、8、9、 10、11。

開発中にシグナル伝達の研究では、任意の生物で困難な作業であり、そしてそこに脊椎動物では、大きな可能性リガンドと受容体/共変調器の相互作用の数、細胞内伝達分子、ならびにがあります1）：ほとんどの新口動物モデル（脊椎動物、無脊椎動物脊索動物、半索動物、および棘皮動物）でシグナル伝達経路を研究するためのいくつかの重要な課題がありますゲノム12の複雑さに起因する異なるシグナル伝達経路の間の潜在的な相互作用、13、14; 2）脊椎動物の複雑な形態および形態形成の動きは、多くの場合、それはより困難でかつシグナル伝達経路間の機能的相互作用を解釈することを可能にします。 3）ほとんどの非棘皮動物無脊椎動物の新口動物モデル種における分析は、いくつかのホヤ種15、16を除いて妊娠の短いウィンドウによって制限されています。

ザウニ胚は、上記制限のいくつかを持っており、 生体内でのシグナル伝達経路の詳細な分析を行うために多くのユニークな資質を提供しています。これらは、以下のものが挙げられる：1）ウニゲノムの相対的なシンプルさが大幅に可能なリガンド、受容体/共受容体と細胞内伝達分子の数を減少させる17の相互対話します。 2）胚葉および主要な胚軸の仕様およびパターニングを制御GRNsはよく信号18、19セル受信/地域の規制状況の理解を助ける、ウニ胚で確立されています。胚は、その形態を分析するのが容易である単層上皮で構成されたとき3）多くのシグナル伝達経路は、早期に切断し、原腸ステージ間で研究することができます。 4）分子が関与しますウニ内シグナル伝達経路中のdは、容易に操作されています。 5）多くのウニは、10〜11ヶ月〜1年（ 例えばStrongylocentrotusのpurpuratusとLytechinusのvariegatus）のために妊娠しています。

ここでは、体系的かつ効率的に指定し、ウニ胚のパターン領土は、いくつかの無脊椎動物モデル系が複雑な分子メカニズムの研究に提供する利点を説明するためにシグナル伝達経路の構成要素を特徴づけるための方法を提示します。

プロトコル

1.高スループットモルホリノデザイン戦略

  1. 目的の遺伝子（複数可）（ 例えば 、候補遺伝子アプローチ、シス調節分析、RNAseqおよび/またはプロテオミクス差動画面）を特定します。
  2. 頻繁に更新されるウェブサイト上で利用可能なゲノム、トランスクリプトーム、および遺伝子発現データを使用してください（ 例えば SpBase http://www.echinobase.org 20とS. purpuratusゲノム検索のhttp：///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .htmlの）時空間的発現プロファイルは、問題の発生機構とオーバーラップすることを決定しました。全く発現データが利用可能でない場合には、定量PCRプライマーおよび/または遺伝子の発現パターンを評価するための現場プローブアンチセンスを発生させます。
  3. 空間的および時間的発現パターンを決定した後、ゲノムのウェブサイトからのDNA配列を得ます。
    1. 翻訳ブロッキングモルホリノオリゴヌクレオチドを生成するための、配列Oを得ます5 '非翻訳領域（5' UTR）は、f直接上流SpBaseまたはS purpuratusゲノム検索のウェブサイト上で利用可能な発現配列タグ（EST）データベースからの開始コドンから。この情報は、目的の遺伝子のために使用できない場合は、5 'RACEを行います。
    2. スプライスブロッキングモルホリノ、SpBaseまたはS purpuratusゲノム検索ツールで足場のblastnツールを使用して、エクソンおよびイントロンを含むゲノム配列の検索を設計します。
  4. 目的の25塩基対のモルホリノシーケンスを設計するために、オリゴヌクレオチドの設計ウェブサイトhttp://oligodesign.gene-tools.comを使用してください。
    1. 翻訳ブロッキングモルホリノについては、翻訳の標的配列の供給源として、5 'から3'のmRNA配列を使用します。 5 'UTR配列（転写開始部位の上流の約70ヌクレオチド）プラス著しいのwi開始コドンと（開始部位の下流）コード領域の25塩基を含みます番目の括弧（ATG）。
    2. スプライスブロッキングモルホリノについては、イントロン - エクソンまたはエクソン - イントロン境界のシーケンスを選択して、境界領域の周りの50塩基（エキソン配列の25塩基およびイントロン配列の25塩基）が挙げられます。シーケンスが一意であることを確認するために、モルホリノ配列とゲノムをスキャンします。

モルホリノオリゴヌクレオチドの2マイクロインジェクション

  1. 300ナノモルホリノバイアルにヌクレアーゼフリー水100μLを添加することにより、モルホリノオリゴヌクレオチドの3 mMのストック溶液を準備します。
    注：ピロ炭酸ジエチルがモルホリノに損傷を与えることができるので、再懸濁のためにDEPC処理水を使用しないでください。
  2. フルスピードで30秒のための株式オリゴヌクレオチドを含む溶液をバイアルダウン最初の再構成のスピンのための（14,000 - 16,000 XG）、簡単に渦、5〜10分間65℃で熱、簡単に渦を、ルームでモルホリノ株式を保ちます少なくとも1時間、温度。モルホリノ原液 sが4℃に-20°Cから格納されます。
  3. 所望の濃度でモルホリノオリゴヌクレオチドを含む注射液を準備します。このソリューションは、通常20％グリセロールまたはキャリアとして125 mMのKCl及び15％（フルオレセインイソチオシアネートデキストラン万MWの2.5mg /μLのストック溶液）FITC-デキストランが含まれています。 FITCデキストランおよび他の蛍光デキストラン複合体は、日常的にエピ蛍光顕微鏡により注入された胚を識別するために使用されます。 -20℃で保存の注射溶液。
  4. 5分 - 少なくとも2つのヒートブロックまたはウォーターバス中で65℃でモルホリノ溶液を加熱します。
  5. （ - 16,000 XG 14000）、フルスピードで1分間遠心操作のための渦 - 少なくとも10分間（14,000 16,000×gで）簡単に言えばフルスピードで30秒間モルホリノ液をスピン。
  6. モルホリノ溶液で注射針をロードします。詳細なマイクロインジェクションプロトコルの場合Stepichevaや歌、2014年21、乾杯とEttensohn、2004を参照してください。"> 22。

S. purpuratus胚で24時間ポスト受精（HPF）で3固定とその場プロトコルで

注：このプロトコルは、アレナス・メナらから変更されています。 2000年23およびセティら。 2014年24。

  1. 固定
    1. 、胚を含有するウェルに（下記参照）固定液を数滴を追加し、ピペッティングにより穏やかに混合し、それらを解決することができます。固定溶液を外し、固定剤の二つの追加180μLの洗浄で胚を混ぜます。
      注：それは徹底的に穏やかなピペッティングを数回上下することにより回の洗浄中に胚を混合することが重要です。 そうしないと、信号対雑音比を低下させることができます。
    2. 10mMのMOPS pHは7.0、0.1％のTween-20、および人工seawateからなる4％の電子顕微鏡グレードパラホルムアルデヒド中で室温（RT）で1時間に50分間の第二固定液の洗浄に固定するために胚を残しますR（ASW）。最良の結果を得るために毎回このソリューションは、新鮮なことを確認します。また、使いやすさと実用性のための胚を96ウェルプレートに固定されています。
      1. 20 mLのための固定剤を使用5mLの16％パラホルムアルデヒド、15 mLのASW、200μLの1 M MOPS pHが7.0、および20μLのTween-20。
    3. 0.1 M MOPSのpHは7.0、0.5 M NaClおよび0.1％のTween-20、少なくとも5分間、または胚は、ウェルの底に落ちるまでから成る180μLMOPSの洗浄緩衝液で室温で洗浄を5回。ここでも、徹底的に優しく上下に数回ピペッティングすることにより、洗浄緩衝液に胚を混合することが重要です。 MOPS洗浄緩衝液は4℃で保存した場合、2日間使用することができます °C。
      1. 40mLのMOPS洗浄緩衝用の4 mLの1 M MOPS pHは7.0、4 mLの5 M NaClを、32 mLののdH 2 O、および40μLのTween-20。
      2. 固定された胚は、2日間、4 O℃で保存することができます。
        注：より長い固定胚を保存する場合は、細菌の増殖を防止するために、MOPS洗浄緩衝液中の0.2％アジ化ナトリウムを加えます。
  2. プレハイブリダイゼーション
    1. MOPSは、洗浄緩衝液吸引し、2の180μLを追加します、ハイブリダイゼーションバッファにバッファ穏やかにピペッティング数倍液に胚を混合し、室温で少なくとも20分間インキュベートウォッシュMOPSの1の比率。ハイブリダイゼーション緩衝液は、70％ホルムアミド、0.1 M MOPS pH7.0の、0.5MのNaCl、1mg / mlのBSAおよび0.1％のTween-20で構成されています。
      1. 40 mLのハイブリダイゼーション緩衝液用の4 mLの1 M MOPS pHは7.0、4 mLの5 M NaClを、4 mLののdH 2 O、0.04グラムのBSA、および40μLのTween-20。再びボルテックスでよく混ぜ、28 mLのホルムアミドを追加し、渦。
    2. MOPS洗浄およびハイブリダイゼーション緩衝液の1の比率と1の180μL追加：2を取り外しMOPSの2比を、ハイブリダイゼーションバッファーにバッファー液に胚を混合し、室温で少なくとも20分間インキュベート洗います。
    3. ハイブリダイゼーション緩衝液の150μL - プローブハイブリダイゼーションの前に軽く100に胚を混ぜます。少なくとも1つの、50℃で胚をインキュベート時間。
      注：一晩胚をインキュベートすることは許容可能です。インキュベーションの前に、蒸発を防ぐために、接着シートでウェルを密閉します。
  3. 交配
    1. その後、渦が静かにプローブ溶液を作成するには、ハイブリダイゼーション緩衝液にプローブおよび500μgの/ mLの酵母tRNAの0.3 ngの/μL - 別のチューブに0.1を追加します。酵母tRNAは、アンチセンスプローブの非特異的結合を減少させるためにプローブ溶液に添加します。この50°Cの解決策、および吸引ハイブリダイゼーション緩衝液を予熱。
    2. 、プローブ溶液100μLにプレハイブリダイズ胚をミックス粘着シートで密封し、プローブに応じて、2〜7日間50℃でハイブリダイズ（foxq2プローブは、2日間インキュベートすることができます）。
      注：インキュベーション時間は、プローブをオフに異なります。低レベルで発現されるいくつかの遺伝子は、7日間のインキュベーションまで必要とします。 adhes場合、96ウェルプレートは、蒸発に対する保険として湿度ボックス内に配置することができアイブシートが適切に密封するために失敗しました。
    3. 作りたてのMOPSは3時間の合計洗浄緩衝液を180μLに50℃で5回洗浄します。その後、室温で180μLMOPSの洗浄緩衝液で3回（15分間）洗浄します。静かに数回ピペッティングすることにより、各バッファ時間洗浄に胚を混合することを忘れないでください。
  4. 抗体インキュベーション
    1. 吸引しMOPSは、MOPSで10％正常ヒツジ血清および5mg / mLのBSAからなるブロッキング緩衝液180μLに胚をバッファリングし、混ぜる洗浄は、バッファー、一晩RTまたは4℃で少なくとも45分間インキュベート洗います。
    2. ブロッキング緩衝液外し、1含むブロッキング緩衝液に胚を混ぜる：ブロッキング緩衝液で希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体の1500希釈。蒸発を避けるために密閉されたプレート中、室温で一晩インキュベートします。注：一晩以上の抗体を放置しないでください。
    3. 胚を6回洗浄（5分または胚がドロップするまで）MOPSにRTでバッファを洗います。胚できます4℃で一晩保存します。
  5. その場開発で
    1. 0.1MトリスpH9.5中、100mMのNaCl、50mMのMgCl 2を、1mMのレバミゾール、および0.1％のTween-20からなる新たに作られたpH9.5の緩衝液を用いて室温で胚を3回（10分間）洗浄します。
      1. 20 mLのpHが9.5バッファ使用2 mlの1 MトリスpHは9.5、400μL5MのNaCl、1 mLの1 MのMgCl 2、20μLのTween-20、16.6ミリリットルのdH 2 O、および0.0048グラムのレバミゾール。
    2. 光から保護し、染色緩衝液中で37℃で胚をインキュベートします。染色バッファは、新たに作られたpH9.5の緩衝液中10％ジメチルホルムアミド、4.5μL/ mLの4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）、3.5μL/ mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - リン酸（BCIP）からなります。
      1. 染色バッファー1mLのために100μLのジメチルホルムアミド、4.5μLNBT、および3.5μLのBCIPを使用しています。
    3. MOPS中で3~5回洗浄することによりアルカリホスファターゼ反応を停止し、バッファを洗います。反応のwifoxq2プローブは、典型的には、1時間に30分を要し番目。いくつかのプローブは、RTまたは4℃のいずれかで一晩のインキュベーションが必要な場合があります。
    4. 70％のMOPS洗浄し、30％グリセロールの溶液に胚を混ぜます。グリセロールは、顕微鏡検査のために必要な屈折率を提供します。胚は、数週間のために、この溶液中で保存することができます。蒸発を防ぐためにプラスチック製のパラフィンでプレートをシール。
  6. スライドの調製及び撮像
    1. スライド上にストリップ間の小さなギャップを持つ三角形に両面テープの三つの小さなストリップを配置することにより、スライドを準備します。
    2. 三角形の中央に70％のMOPS洗浄し、30％グリセロール溶液中で胚を移し、カバーガラスでカバーしています。
    3. カバーガラスのエッジの周りマニキュアの層を適用することにより、カバースリップをシール。
    4. 20Xの対物レンズと取り付けられたカメラを有する化合物の光学顕微鏡を用いて画像をキャプチャします。

結果

ウニ胚では、3つの異なるWntシグナル支店（のWnt /βカテニンは、Wnt / JNK、およびWnt / PKC）4、25相互作用は前後（AP）パターニングを支配するWntシグナル伝達ネットワークを形成することが示されています。これらのシグナル伝達イベントの中で最も重要な結果の一つは、初期広く発現し、前方神経外胚葉（ANE）GRNは、原腸形?...

ディスカッション

ここで紹介する方法は..多くのラボが分析する早期ウニ開発時に同様のアッセイを使用している基本的な発達のメカニズムを支配するシグナル伝達経路とGRNsを理解するために、脊椎動物未満ゲノムおよび形態学的な複雑さに胚を使用してのパワーを示している例です。他の細胞運命指定イベント（ 例えば、ノッチ、ヘッジホッグ、TGF-βの、及びFGFシグナリング）に関与する経路

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholinoGene Tools LLCCustomizedMore information at www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamideSigma Aldrich47671-1L-F
Yeast tRNAInvitrogen15401-029
Normal Goat SerumSigma AldrichG9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibodyRoche11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-10
Magnesium chlorideSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphateRoche11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11 383 213 001
Dimethyl FormamideSigma AldrichD4551-500mL
Potassium ChlorideSigma AldrichP9541-5KG
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761-500G
Magnesium SulfateSigma AldrichM7506-2KG
Calcium ChlorideSigma AldrichC1016-500G

参考文献

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