JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

要約

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

概要

医学研究では、多くの注意が脂質相互作用の様々な関与、内因性または外因性のいずれかの、膜タンパク質に焦点を当てています。脂質相互作用タンパク質を操作するような洗剤、amphipols 1、または小さいタンパク質2などの脂質への代替を選択する、または可溶性および活性タンパク質を保持する膜の代用品を見つけるのいずれかが含まれます。リポ膜代替物は、リポソームおよびナノディスク（ND）3、4を含みます。

ナノディスクは、天然に血液中に発生する高密度リポタンパク質（HDL）のタンパク質部分、アポA-1を操作することによって開発され、ネイティブに近い膜のプラットフォームです。アポA-1は、短い両親媒性αヘリックスの243残基長鎖状であり、無脂質可溶性コンホメーションを持っています。 in vitroでの脂質の存在下で、タンパク質アポA-1の2つのコピーが自発的にhydrを取り囲むように並べ替えるとき脂質二重層のパッチ5のophobicアシル鎖部分。アポA-1の操作されたバージョンは、一般的に、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれ、数は増加し、プラスミドとして、または精製されたタンパク質として市販されています。 6長いか短い7膜足場タンパク質中のアポA-1、結果の繰り返しまたはαヘリックスの欠失を有します。これにより、直径が17ナノメートル〜8 6nmで7の周りにディスクを形成することができます。ナノディスク3,9のためのアプリケーションの種類があります。最も一般的に使用されるアプリケーションは、以前に3,9レビュー内在性膜タンパク質8の安定化のために、ネイティブに近い膜環境を提供することです。あまり探求使用は、研究のためのナノスケールの膜表面を提供することを目的とします周辺膜タンパク質10、11、12、13、14、15、16、17。プロトコルの第1節は、以下のリン脂質や膜骨格タンパク質から構成されるナノディスクを作成するための手順を可視化します。

サンプル調製は、ほとんどのメソッドのボトルネックです。メソッド固有のサンプルは、特定の情報を追加することができ、彼らはまた、結果の比較が困難になります。試料がマルチモーダルであり、いくつかの異なる方法で直接使用することができる場合したがって、簡単です。ナノディスクを用いて一つの利点は、リポソーム（ 例えば、サンプルは直接本プロトコルのように、TEMおよび非変性ゲル電気泳動の両方のために使用することができる）と比較して、ナノディスクの小さいサイズです。

小胞およびリポソームは、長い膜相互作用タンパク質の機能を理解するために使用されています。構造研究と可視化のために、リポソーム中の膜貫通型タンパク質の構造的決意の例は、18利用可能です。しかし、リポソーム膜に埋め込まれたmonotopic膜タンパク質のない高解像度の3D構造は、我々の知る限りでは、まだ公開されていません。金ナノ粒子または抗体は、TEM 19を用いてリポソームまたは小胞に結合するタンパク質を可視化するために使用することができます。これらのプローブは、非常に特異的であるにもかかわらず、彼らは膜結合部位をベーリングしたり、柔軟な部品で関心のある分野をマスキングすることにより、膜結合タンパク質を妨害する可能性があります。金標識又は抗体複合体を形成するタンパク質は、おそらくゲル上で分析することができ、これは実験のコストを増加させます。

リポソームは優れたプラットフォームであるが、一つはポップと確信することはできませんピュレーションは、リポソームあたりのタンパク質の特定の比率、ナノディスク20を使用することによって探索することができるという特徴を持っています。リポソームでは、補因子および基質は可溶性の内部に捕捉することができます。膜溶解性である物質は、膜模倣体の両方のタイプのための同じ運命を共有します。二重層領域がナノディスクに小さくなるようにもかかわらず、物質の少量を、ナノディスクの膜を飽和させるのに必要とされます。

原子構造の決意を介してタンパク質の機能を理解することは、研究の多くの分野のために不可欠となっています。タンパク質構造決意するための方法は、X線21を含みます。核磁気共鳴（NMR）22、23。透過型電子顕微鏡（TEM）極低温で24、cryoEM。 cryoEMによって解像度が最近大幅に主に起因する直接電子デの使用に、改善されました26、25 tectors。巨大分子は、ネイティブに近い状態で薄く、ガラス質氷27に結像されます。 200 kDaの - しかし、生体分子の低コントラストのために、彼らは100のサイズ範囲で検出が困難になります。適切なサイズのサンプルについては、データ収集を行うことができ、単一粒子の再構成の方法は、構造体28を得るために適用することができます。

しかし、TEMによるタンパク質構造の決意は、多段階プロセスです。これは通常phosphotungstenのような重金属の塩を使用して負染色TEM 29（PT）30やウラン31によるサンプル単分散性の評価から始まります。ネガティブ染色高分子の低解像度モデルの再構築は、通常行われ、分子構造29に関する重要な情報をもたらすことができます。並行して、cryoEMを使用してデータ収集を開始してもよいです。アーチファクト形成の誤解を避けるために、ネガティブ染色TEMデータを評価する際には注意が必要です。一つの特定のアーチファクトは、側面33から見たコインのスタックに似た長い棒の形成をもたらし、リン脂質およびリポソーム32にPTの汚れの影響です。 （以下、「スタック」と表記）は、このような「連銭」または「スタック」は、HDL 34早期に観察し、それ以降もナノディスク35のためにしました。

膜の積層と整形は多くの理由で発生することがあります。例えば、モリブデン酸アンモニウム染色36でTEM画像で示される銅のような補因子によって誘導することができます。リポソーム中の膜脂質の割合は、このように銅イオンを添加した後、リポソームを積層し、EDTAによって金属錯体を模倣イミノジ酢酸頭部基を含有しました 36アップ。スタッキングも（使用ステインが言及されていない）脂質二重層内または上のタンパク質によって37タンパク質間相互作用に起因する可能性があります。 PTによるリン脂質のスタック形成は早い段階で観察されました。しかし、それ以降の作業は、このアーティファクト形成38を削除するか、廃止に焦点を当てています。

ここでは、TEMによる膜結合タンパク質の研究のために積み重ねNAPTによって誘発されるナノディスクを利用する方法を提案します。要するに、ナノディスクに結合タンパク質が積み重ねからナノディスクを防止するであろう。スタッキングの理由は明らかではないが、それはお互いに（ 図1A）に固執するディスクを引き起こし、リン脂質およびPTのホスホリル基との間の静電相互作用があることが39提案されました。私たちのプロトコルの背後にある仮説は、タンパク質は、ナノディスクに結合すると、リン脂質表面の大部分はご利用できないということですタンパク質による立体障害によりPTとの相互作用についてBLE。これは、スタックの形成（ 図1B）を防止するであろう。二つの結論を引き出すことができます。まず、積層の予防は、対象のタンパク質が膜に結合したことを意味します。第二に、タンパク質ND複合体は、複合体の大まかな形態を得るために、標準的な単一粒子処理方法24、40で処理することができます。また、非変性ゲル電気泳動または動的光散乱のような方法によって分析を行うことができます。

この仮説を実証するために、我々は、多くの炎症性疾患41,42に関与する膜結合タンパク質5-リポキシゲナーゼ（5LO）を使用しました。この78-kDaのタンパク質は、その膜43にバインドするためにカルシウムイオンを必要とします。この膜結合は、リポソームを用いて広く研究されているもののS = "外部参照"> 44、45、46、膜画分47、これらは、TEM分析および構造決意するために使用することができません。

ナノディスクの調製は、界面活性剤コール酸ナトリウムに再懸濁脂質とMSPを混合することによって開始されます。 1時間氷上でインキュベートした後、界面活性剤をゆっくりと吸着樹脂を使用して再構成混合物から除去されます。この種の材料は、しばしば小さなビーズに成形ポリスチレンで作られています。彼らは比較的疎水性であり、脂質の48に比べて洗剤を結合するための強力な好みを持っています。疎水性ビーズを除去し、遠心分離を用いて説明を行った後、ナノディスクは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製します。精製されたナノディスクは、（滴定用またはいくつかの比率）等モル比でmonotopic膜タンパク質（および可能な補因子）と混合されているとrに残っていますEACT（15分）。 TEMによる分析は、グロー放電、炭素被覆グリッド上に試料をμL-量を適用することによって、その後、NAPTでネガティブ染色を行うことによって行われます。アリコートをTEMグリッドに適用した場合の同じサンプルは大きな変化で、非変性またはSDS PAGEゲル電気泳動によって、並びに活性測定の各種による分析のために使用することができます。

プロトコル

ナノディスクの調製

  1. 膜足場タンパク質8、35の発現および精製
    1. フラスコ中の大腸菌 BL21（DE3）T1R pRARE2株にHisタグMSP1E3D1を発現します。 37℃で50μg/ mlのカナマイシンを補充したLB培地で50 mLの一晩スターター培養を準備します。 50μg/ mLのカナマイシンを補充した素晴らしいブロス培地の2 Lで一晩スターター培養物を希釈します。
    2. 600ナノメートル（OD 600）での光学密度が約3 18℃で3時間、0.5 mmのタンパク質発現イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を誘導に達するまで37℃で細胞を増殖させます。
    3. 溶解バッファー（; 100mMのNaCl、10％グリセロール、100mMのトリス-HCl、pH8.0）に調製します。使用直前に1 mMのTCEPを追加します。
    4. 18℃での誘導の3時間後、4,500×gで10分間の遠心分離により細胞を回収4°C。 、上清を捨て採取した細胞を比較検討し、細胞のグラム当たりの溶解緩衝液を2mLの割合で溶解緩衝液中で再懸濁それら。
    5. 80％の振幅で3分間（ON 4秒、4秒OFF繰り返し率）、パルス超音波処理によって溶解細胞。
    6. 49,000×gで、4℃で20分間溶解物を遠心分離します。この遠心分離からのペレットを捨てます。
    7. 好ましくは4℃に保っ自動液体クロマトグラフィーシステムに接続された5ミリリットルのNi +キレートカラムに上清を注入します。
    8. Hisタグ化MSP以外のすべてのタンパク質を除去するために、次の3 - 溶出工程（ステップ1.1.9）の前に、バッファ1でカラムを洗浄します。精製プロセスを追跡する280 nmでのタンパク質含有量を監視します。 280nmでのUV記録は、各洗浄後にベースラインに戻る行く必要があります。
      1. 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％トリトン、pHが8.0：洗浄緩衝液1で洗浄しました。
      2. 40mMのトリス-HCl、300mMの：洗浄バッファー2で洗浄NaCl、20mMイミダゾール、及び50mMコール酸ナトリウム、pHは8.0。
      3. 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および50 mMイミダゾール、pHは8.0：洗浄緩衝液3で洗浄します。
    9. 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および500mMイミダゾール、pH8.0でMSPを溶出します。
    10. ゲルろ過8、35、標準緩衝液（0.5 mMのEDTA; 100mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、pHが7.5）MSPするバッファを変更します。バッチあたりの収量は約7ミリグラムLであるべき-1。
  2. リン脂質原液の調製
    1. 1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（POPC）の305μLをガラスビーカーに25ミリグラム/ mLの濃度でクロロホルムに溶解し、窒素の穏やかな流れでそれをパージすることにより、クロロホルムを蒸発させる追加。真空デシケーター中で一晩脂質を乾燥させます。注：このステップは、ガラスビーカーの底部に脂質の薄膜を残す脂質から溶媒を除去します。
    2. 溶液が透明になるまでチューブをボルテックスすることによって100mMのコール酸ナトリウムを含むMSP標準緩衝液200μL中の脂質ケーキを再懸濁し、これを50mMのPOPC濃度を有する溶液を提供します。
      注：2（脂質：洗剤）8一般的には、この時点で洗剤に対する脂質のモル比は1でなければなりません。この脂質 - 界面活性剤混合物は、ほぼ2ヶ月間-80℃で保存することができます。
  3. 界面活性剤除去のための疎水性ビーズの作製
    1. 50 mLチューブにビーズの5グラム（乾燥重量）を配置します。
    2. 超純水40mLで、次に100％メタノール30mLでビーズを洗浄し。
    3. 10 mLのMSPの標準緩衝液でビーズを洗浄します。最後に、4℃でMSP標準緩衝液15mLでビーズを格納します。
  4. ナノディスクの再構成
    1. マイクロチューブにMSP1E3D1（0.124ミリモル）の190μLを分注し、リン脂質のストック溶液（50mMのPの61.5μLを追加同じチューブにOPC）。 1時間氷上で再構成混合物をインキュベートします。注：130（MSP1E3D1：POPC）これは1のモル比に等しいです。
    2. 自己組織化プロセスを開始するために再構成液1mL当たりのビーズ0.5gの濃度で疎水性ビーズを加えます。 4℃で16時間、ロータリーインキュベーターでインキュベートします。
    3. インキュベーションの後、沈殿物や凝集物を除去するために13,000×gで、4℃で10分間遠心操作します。ペレットを捨て、上清を保存します。
    4. 280 nmでの吸光度が安定するまでMSP標準緩衝液（自動液体クロマトグラフィーシステムに搭載された）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化します。カラムに上清を注入し、ピーク画分を集めます。
    5. 280nmでのピーク画分にナノディスクの濃度を測定します。ナノディスク濃度の計算のためにMSP1E3D1のモル吸光係数（ε= 29910センチメートル-1 M -1）を使用します。注記：ナノディスクあたりの脂質の数は、放射標識脂質およびリン分析4の組み合わせによって単独リン酸分析によって測定することができます。

Monotopicタンパク質の調製5-リポキシゲナーゼ35

  1. 一晩スターター培養物を準備します。 100μg/ mLのアンピシリンを含むLB培地50mlを補います。 5-リポキシゲナーゼ遺伝子（ALOX5）のプラスミドを含む大腸菌 BL21（DE3）で培地に接種。 42ミリモルのNa 2 HPO 4、24 mMのKH 2 PO 4、9のNaCl、19 mMのNH 4 Cl を 、1mMの硫酸マグネシウム、0.1ミリモルのCaCl 2、0.2％D-グルコース、0.1を含有する発現培地中で一晩スターター培養物を希釈％、5μMのFeSO 4、および100μg/ mLアンピシリン。 OD 600が 〜25℃で0.5になるまで細胞を増殖させます。 C 35 20℃で16時間、0.2mMのIPTGでタンパク質発現を誘導します。
  2. 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により収穫し、上清を捨てます。採取した細胞を含むチューブの下部にあるペレットを秤量し、溶解緩衝液中に回収した細胞を再懸濁（100mMのトリス-HCl、pH8.0の、100mMのNaCl、10％グリセロール、及び1mMのTCEP）、プロテアーゼ阻害剤および0.5を含みますmg / mlで細胞の1gあたりの溶解緩衝液を2mLの割合で35リゾチーム。
  3. 溶解80％の振幅で5×15秒間超音波処理により細胞。 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。ソリューション35中のタンパク質を沈殿させるために60％飽和- 30に硫酸アンモニウム沈殿を実行します。 16,000×gで4℃で15分間遠心分離します。注：5LOペレットを急速凍結し、最長6ヶ月間-80℃で保存することができます。
  4. 40,000×gで4℃で15分間、溶解緩衝液および遠心20mLでペレットを再懸濁します。
  5. 上の上澄み液をインキュベート 30分間、4℃でATPアガロースカラム。 0.5 M NaClを含む溶解緩衝液の1カラム容量で一回カラムを洗浄。 10μMのFeSO 4および20μg/ mLのカタラーゼを含有する溶解緩衝液中20mMのATPと5LOを溶出します。 ATP 35を除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行います。
    注：5LOが不安定で、すぐに精製した後に使用する必要があります。それ以外の場合は、硫酸アンモニウム沈殿の段階（ステップ2.1.3の後の注を参照）で停止することをお勧めします。

ナノディスク - タンパク質複合体の調製

  1. 複合体の100μLの総容量を準備します。 MSP標準緩衝液中の1mM の Ca 2+存在と0.8μMNDと0.8μM5LOミックス（20 mMトリス-塩酸、pHが7.5; 100mMのNaCl; 0.5mMのEDTA、および1.5 mMのCaCl 2を）とは、10分間インキュベート冷やして。注：サンプルは、C 35 4℃で1ヶ月まで保存することができます。
サンプルのove_title "> 4。分析

  1. ゲル電気泳動
    1. 非変性電気泳動
      1. ローディングバッファーの5μL（50mMのビストリス、6NのHCl、50mMのNaCl、10％（w / v）のグリセロール、および0.001％ポンソーS、pH7.2）で49でサンプルの15μLを混合し、4にそれを読み込みます - 16％のBis-Trisゲルで電気泳動を行います。
      2. 光陰極バッファと陰極タンクを埋める（50mMのビストリス、50mMのトリシン、pHが6.8、および0.002％クマシーG-250）及び緩衝液（50mMビストリスおよび50mMのトリシン、pHは6.8）を実行すると、アノードタンク。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します
      3. クマシーフロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。
      4. 標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。
    2. 変性電気泳動
      1. （（SDSを含むローディング緩衝液の10μLで0.05パーセントを、サンプルの40μLのミックス/ v）のブロモフェノールブルーワット; 0.2 Mトリス塩酸、pHが6.8; 20％（v / v）グリセロール。 10％（W / V）SDS。電気泳動を行うために20％トリスグリシンゲル - 及び10mM 2-メルカプトエタノール）とは4でそれをロードします。
      2. ランニング緩衝液で陰極と陽極とタンクを記入（25 mMトリス - 塩酸、pHが6.8; 200 mMグリシン、および0.1％（w / vで）SDS）。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します
      3. ローディング色素フロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。
      4. 標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。
  2. NAPT溶液の調製
    1. 酸性溶液（w / v）の2％を与えるように、室温で攪拌することにより水50mL中のリンタングステン酸ナトリウム塩1gを溶解します。
    2. 1 M NaOHでpHを7.4に調整します。 0.22μmのシリンジフィルターを使用して粒子を除去します。室温または4℃で溶液を保管してください。
  3. TEM分析用のサンプルの調製
    1. グロー放電炭素被覆銅グリッド（430ミリアンペアで20秒間の00メッシュ）は、試料の吸着前親水性グリッドをレンダリングします。グリッド上のサンプル（ナノディスクに対して0.8μM）の3.5μLを置き、30秒間インキュベートします。注：適用量は、サンプル濃度に応じて、2.5〜5μLを変えることができます。 1μM - ナノディスクに適した濃度範囲は0.5です。
    2. 濾紙を用いて余分な溶液をオフブロット。
    3. すぐに30秒間2％NAPTの低下にグリッドを染色します。過剰の溶液をオフにブロットし、空気乾燥さグリッドを残します。
    4. TEMによるグリッドを評価します。 120-200 keVの加速電圧を持つ顕微鏡は、スタッキングの度合いを推定するのに十分です。注：本プロトコルでは、較正透過型電子顕微鏡を用いた、200 keVの電界放出銃を備えました。
    5. TEM画像を記録します。長いスタックを示す画像については、さらに処理されません。画像は、いくつかを含有することができる外因性タンパク質と、ナノディスクの複合体を示しますショートスタックが、ほとんどの粒子が複雑です。録音複数の画像処理クラス平均と低解像度、複合体の3次元モデルを得るための標準的な方法に従って、これらの。
      注：ネガティブ染色データの収集のために、グリッドが少なくとも三つの異なる日に行きました。ネガティブ染色が適用される前、毎日のために、新鮮なサンプルのインキュベーション（ステップ3.1のように）が行われました。

結果

私たちが提案する方法はmonotopic膜タンパク質が結合するための膜表面を提供するために、ナノディスクの作成に依存します。ナノディスクの脂質二重層に埋め込まない膜貫通タンパク質が存在しないように、ナノディスクは、ここでは「空のナノディスク」（ 図2A）と表記されています。これらは、2 MSP1E3D1の足場タンパク質とPOPC 8の約2...

ディスカッション

空のナノディスクの再構成、タンパク質ナノディスク複合体の調製、およびこれらの複合体のTEMについて陰性染色：この方法は、3つの部分に分離することができます。各部分は技術の限界、重要なステップ、および有用な修飾に関する個別に対処されることになります。

空のナノディスクの再構成。ナノディスクの製造と使用における重要なステップと制限。

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

著者は彼らのサポートのためにスウェーデンの研究評議会、ストックホルム郡評議会、およびKI資金に感謝します。 MSPの発現および精製は、カロリンスカ研究所/ SciLifeLabタンパク質科学基盤施設（http://PSF.ki.se）で行いました。また、作者は彼らの技術的な専門知識を共有するため、それらのタイムリーな支援のために博士パシPurhonen博士マチルダスエルバーグに感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Transmission electron microscope: JEOL2100FJEOL
CCD cameraTiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow dischargerBaltec
TEM grid: 400 meshTAABGM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5Agilent Technologies5190-2526
Superdex 200 HR 10/300GE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1Addgene20066
Bacteria: BL21DE3NEBC2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agaroseSigma AldrichA2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mLGE Healthcare Life Sciences17-5247-01
Lipid: POPCAvanti polar lipids850457C25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 ResinBio-Rad1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μmPall life sciencesPN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrateSigma Aldrich31648
2-mercaptoethanolSigma AldrichM3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Bio-Rad161-0301
Protease inhibitor cocktailSigma Aldrich4693132001
TCEPSigma Aldrich646547
Detergent: Sodium cholate hydrateSigma AldrichC6445-10G
Sodium Cholate500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode BufferThermo Fisher ScientificBN200150 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode BufferThermo Fisher ScientificBN200250 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading BufferThermo Fisher ScientificBN200350 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running BufferIn-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading BufferIn-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific brothTryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

参考文献

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., Duzgunes, N. e. j. a. t., et al. . Methods in Enzymology. 464, 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

121 TEM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved