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要約

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。

要約

ハイスループットスクリーニング（HTS）は、現在、生化学的反応または細胞プロセスを調節することができる化学物質を同定するための主力です。バイオテクノロジーの進歩と小分子の高い翻訳電位を、薬物発見における革新的なアプローチの数はHTSの使用で復活関心を説明している、進化してきました。癌領域は、移植関連合併症または自己免疫疾患を標的とする新たな免疫調節化合物の同定のために作られていない大きな突破口と、現在、薬物スクリーニングのための最も活発な研究領域です。ここでは、簡単に新しい免疫調節化合物の同定のために適合さビトロネズミ蛍光ベースのリンパ球アッセイで小説を提示します。このアッセイは、Nur77プロモーターはT-又はB-細胞受容体刺激によりGFPの発現を駆動するトランスジェニックマウス由来のTまたはB細胞を使用します。 GFP強度が反映されるように標的細胞の活性化/転写活性は、我々のアッセイは、細胞/生物学的応答に与えられた化合物（複数可）の効果を研究するための新たなツールを定義します。例えば、一次スクリーニングは、免疫調節活性を表示160の潜在的なヒットの同定につながった「標的仮説」の非存在下で4,398の化合物を用いて行きました。したがって、このアッセイの使用は、インビトロ / インビボ検証研究を進める前に、大きな化学ライブラリーを探索する創薬プログラムに適しています。

概要

ハイスループットスクリーニング（HTS）が広く新しい治療分子の同定のため、または新しい医学的適応症におけるFDA承認薬物の再配置のために採用実績のある戦略です。 1はこれまでのところ、達成HTSの成功は、以前に発見された薬の茄多によって測定することができます。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブは、乳癌、シタグリプチンの治療のために使用されます。ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤、抗高血糖薬として使用され、慢性骨髄性白血病の治療のために使用される経口BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブは、もともとによって発見され承認された薬物の長いリストのいくつかの例を表していますHTS。製薬業界の生産は最近、新しい化学物質の発見で不足に苦しんできたが2、成功した薬剤の発見の可能性が前臨床カンジダの数の増加によって改善することができます調節生物学/生化学的特性を表示するTES。したがって、表現型スクリーニングのために適合新しいHTSアッセイの開発は、新薬のヒットの発見のために重要な薬理学的なツールを提供する可能性を提供することができます。 3、4、5、6はまた、HTSは、現在によるカスタム設計された柔軟なロボットのインストール、新規読み出し技術と豊富な小型化などの近年の重要な技術の変換に速いペースで行うことができます。表現型スクリーニング（別名前方薬理学）の使用への関心の高まりに貢献する因子のうち2、 図7は、分子標的（ターゲットベースのスクリーニング/生化学反応）に関する機能的効果ではなく、単純化還元主義の前提に焦点を当てることより可能性があるという認識であります笙へワット臨床効果。このように、表現型スクリーニングは、新しい潜在的な治療化合物と、現在治療不可能な疾患の分子経路を明らかにする可能性を秘めています。 2

適切に与えられた分子標的または細胞の機能のための阻害剤または活性化因子を同定するために、高感度で信頼性のアッセイは、 善意のヒットと偽陽性を区別するために必要とされます。だから、何が良いアッセイを作りますか？所与のアッセイの品質は最初の（Z因子を介して反射された）信号対雑音比によって判断されなければなりません。 8第二に、ターゲットを絞った効果や画面の目標は明確に確立されるべきです。具体的には、リガンド - 受容体結合を評価するために設計されたアッセイとは対照的に、例えば、機能的細胞ベースのアプローチは、受容体のスクリーニングのための重要な利点を提供することができます。この理由は、後者のアプローチは、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドを区別することはできませんということです。SS =「外部参照」とは対照的に>図9は、細胞ベースのアプローチは、受容体機能を直接生物学的表現型を評価することができるように、より効果的である可能性が高い（増殖、細胞周期停止、アポトーシス、および/または分化）。しかし、彼らが特定の細胞内標的を侵害するような生化学的アッセイは、表現型アッセイよりも有意な利点を提供することができることに留意しなければなりません。その後、アクションの薬剤分子機構に関連する調査を簡略化しながら十分に最適化生化学的アッセイは、一般的に表現型スクリーニング未満のデータの散布を持つことになります。しかし、ターゲットベースまたは生化学アッセイの主な欠点は、生物学的システム（もともと生化学アッセイにおいて研究特異性の喪失）で試験した場合、非特異的な標的に影響を与える可能性があり、偽陽性ヒットの速度を増幅する可能性があります。 10負と正のヒットの間で十分に確立されたカットオフポイントは、偽陽性の数を最小限に抑えることができますが、私nは一次スクリーニングは、無傷の細胞、全組織または動物全体としてネイティブの細胞環境を模倣する生理学的に関連するシステムの使用は、アッセイデザイン振り子のコアのまま。したがって、表現型スクリーニングは、化合物の活性または作用様式の予備知識がなくても、無識別された薬剤標的を伴う疾患のために望ましい/生物学的表現型効果を持つ鉛の発見を可能にします。 11

市販のマウスモデルおよび化学化合物のクラスタ化されたサブファミリ：本明細書中での研究は、2つの重要なコンポーネントに基づいて最適化され、再現性の表現型スクリーニングの開発とテストに関するものです。動物モデルに関しては、アッセイは、 緑色蛍光タンパク質 （GFP）の発現は第によって駆動されるマウス系統（Nur77 GFP）カセットを含む細菌人工染色体を保有由来するリンパ球の使用に依存します電子Nur77プロモーター。 12この刺激の特徴は、Nur77は、T細胞受容体（TCR）またはB細胞受容体（BCR）刺激後にアップレギュレート前初期遺伝子であるという事実に基づいています。スクリーニング方法自体については、図12に示すように 、アプローチは、大規模な化学ライブラリー（> 10 5の化合物）を評価するために必要な時間を最小限に抑えながら、些細な類似体のスクリーニングを回避するのを助けるために使用しました。そうするために、バーチャルスクリーニングツールを使用して、医薬化学者によって選択された化合物のデータベースを参考として知られている活性種の構造を使用して位相的に類似する化合物を同定するために利用されました。このアプローチは、私たちは136,000を超える化学物質の総合的なライブラリを表す4398化合物をスクリーニングすることができました。

プロトコル

全ての動物プロトコルはモントリオール大学の動物実験委員会によって承認されました。何のバイタルサインが頸椎脱臼に続いて観察されなくなるまで、マウスをCO 2の緩やかな吸入によって安楽死させました。手順は、動物を人道的方法で安楽死させ、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従ってたことを確認するために、認定者によって行われました。

脾細胞中およびフローサイトメトリーバッファーの調製

  1. 70％エタノール洗浄生物学的フードの下にあるすべての手順を実行します。
  2. 予め温めロズウェルパーク記念研究所の70ミリリットル（RPMI）滅菌チューブ中（市販およびフィルタリング500ミリリットル容量の滅菌ボトルで供給）と場所1640 1xの媒体を削除します。削除培地は、プロトコルの後半で使用されます。
  3. 50mlで残りの430 mLのRPMI 1640 1Xを補う不活性化ウシ胎児血清（FBS）、5mLのペニシリン/ストレプトマイシン、5mLのHEPES 5mlの非必須アミノ酸、5 mLのピルビン酸ナトリウム、濾過0.05mLの（1M）の2-メルカプトエタノール。
    注：熱衝撃的な細胞を避けるために、37ºCに設定された水浴を使用して、事前暖かい脾媒体。これは、細胞のアポトーシスの誘導を回避することが重要です。
  4. フローサイトメトリーバッファーを調製するために、98ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に、FBSの2mLのを追加し、（好ましくは、3日以内に）使用するまで冷蔵保管してください。

Nur77 GFPマウスの脾臓から脾細胞の細胞懸濁液の2世代

  1. septically 6-8週齢の雌Nur77 GFPマウスから脾臓を分離します。
    1. これを達成するために、無菌フードの下で働きます。 70％エタノールで犠牲にマウスの毛皮、ハサミやピンセットを浸します。
    2. 左上腹部の象限に皮膚や筋肉をカットし、その右側にマウスを置きます。目に見えて、それを切り取った後、脾臓を検索するために切開領域を調べます。脾臓をキープ直前まで、氷上で脾細胞培地中で次のステップを実行します。
  2. 予め温めた脾細胞培地5mlを含有する10cm 2の細胞培養シャーレに脾臓（単数または複数）を置きます。
  3. 解決策が濁ってまで、無菌注射器プランジャを使用して脾臓をマッシュ。脾臓コラーゲンマトリックスは、プロシージャの終わりまでのままであるべきです。
  4. 脾細胞培地で豊富マッシングに続いて、細胞懸濁液を収集し、フィルタアウトするために、任意の破片や血栓を50 mLチューブ上に配置された70μmのセルストレーナーを通してそれを渡します。
  5. 5分間、500×gで遠心分離します。上清を廃棄した後、社内で製造又は商業赤血球溶解緩衝液2~3 mLの細胞ペレットを再懸濁します。以下のピペッティング（2-3回）、20〜30秒間、サスペンションの残りをしましょう。
  6. その後、500×gで5分間、細胞懸濁液を遠心分離5 mlのPBSまたは任意の適切な緩衝液を追加します。
  7. それが溶解した赤Bが含まれているとして（赤色にすべきである上清を除去lood細胞）および脾細胞培地2mlに再懸濁細胞ペレット。
  8. 血球計数器を用いて、生と死（壊死）細胞を区別するために、トリパンブルーで染色された細胞の数を数えます。

脾細胞の細胞懸濁液から3 T細胞の単離

  1. 遠心分離機500×gで5分間細胞懸濁液。 10×10 6細胞/ mLの細胞濃度を得るために、無血清RPMI培地中の細胞（ステップ1.3から50ml）に再懸濁します。
  2. 5 mLのポリスチレンチューブに細胞を移し、精製工程の最後に余談純度評価/比較のための脾細胞の100μLのアリコートを設定します。
  3. T細胞単離抗体カクテル（50μL/ mL）を、続いて50μL/ mLの細胞懸濁液に正常ラット血清を追加します。
  4. 細胞懸濁液を混合し、10分間休ませて。このステップは、すべての不要な細胞に結合する抗体カクテルを可能にします。
  5. ストレプトアビジン急速球（磁石を追加します。2.5分間ICビーズ）は、その後、無血清培地を使用して2.5 mLの容積をもたらします。
  6. 3分間のセル分離磁石にチューブを置きます。
  7. 磁石を保持し、一手にソリューションを注ぐことによって、新しいポリスチレンチューブにT細胞懸濁液を転送します。
    注：分離されたサスペンションは、精製されたT細胞が含まれています。すべての不要な細胞を、磁気ストレプトアビジンビーズに結合したチューブの側に保持されています。
  8. トリパンブルーおよび血球計数器を用いて、単離されたT細胞を数えます。
    注：このステップでは、単離されたT細胞の純度は前に、フローサイトメトリーによるT細胞の単離後にCD3 +事象の割合を分析することにより（オプション）を検証することができます。 13
    1. 簡潔には、遠心500×gで脾細胞懸濁液1ml。上清を捨て、1×10 6細胞/ mlの濃度で、フローサイトメトリー緩衝液中で細胞を懸濁。
    2. 蛍光タグ付き抗覚書を追加します。100：1の濃度で電子CD3抗体。 4℃で30分間インキュベートします。 1回洗浄、遠心分離およびフローサイトメトリーによる分析のためのフローサイトメトリー用緩衝液（400μL）に再懸濁します。

脾細胞の細胞懸濁液から4 B細胞の単離

  1. T細胞（3.1から3.8ステップ）が、B細胞単離キットを使用するための記載されたのと同じプロトコルに従います。純度評価のために、代わりにCD3抗体のCD19抗体を使用しています。 13
    1. 純度評価（オプション）には、CD3抗体の代わりにCD19抗体を使用しています。 500×gで脾細胞懸濁液の遠心1ミリリットル。上清を捨て、1×10 6細胞/ mlの濃度で、フローサイトメトリー緩衝液中で細胞を懸濁。
    2. 蛍光を追加1の濃度で抗マウスCD19抗体をタグ付けさ：100、4℃で30分間インキュベートします。 1回洗浄、遠心分離およびフローサイトメトリー用緩衝液に再懸濁（400μL）FOフローサイトメトリーによってR解析。

5. T細胞活性化およびGFP発現の誘導

  1. /ウェル2.5×10 5細胞の濃度で、丸底96ウェルプレートに、懸濁液中で、T細胞を播種。
  2. 2 ngの/ mLおよびCD3 / CD28磁気ビーズ（25μL/ 10 6細胞）で組換えインターロイキン（IL）を-7追加。非活性化T細胞を表す後で測定の陰性対照として機能するビーズで処理していないT細胞の一部を保管してください。
  3. 12時間後、静かに任意のビーズ - 細胞複合体/凝集体を破壊するために上下各ウェルに細胞懸濁液をピペットで96ウェルプレートからのT細胞を収穫。 5 mLのポリスチレンチューブにすべてのウェルからサスペンションを収集します。
  4. TまたはB細胞の精製のために以前に使用したのと同じセル分離磁石内部のサスペンションを含むチューブを置き、5分間休息することができます。
  5. T細胞懸濁液の整数を転送します磁石を保持し、一手にソリューションを注ぐことにより、OA新しいポリスチレンチューブ。
  6. 5分間、500×gで細胞を遠心。再懸濁新鮮な脾細胞培地中の細胞は、2×10 6細胞/ mlの濃度を取得します。
  7. 非活性化T細胞と比較して12〜24時間の刺激後に（品質管理のためのオプション）フローサイトメトリーによってGFP発現強度を評価します。 12
    注：GFP蛍光はNur77 GFP T細胞に固有であり、TCRの正常起動時に現れます。 12
  8. 顕微鏡による生存率および活性化（オプション）の評価のために、0.2μg/ mlの濃度で、分析の前に、ヘキスト30分で活性化された細胞を染色。カバースライドまたは平底黒両面384ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液の適切な量を追加し、生細胞を評価するために蛍光顕微鏡下で調べます。死んだ細胞は、核を保持しません染色。 14

6. B細胞の活性化およびGFP発現の誘導

  1. T-25培養フラスコを使用して、1×10 6細胞/ mLで単離されたB細胞を再懸濁します。
  2. 200 ngの/ mLの濃度で10μL/ mLおよび組換えCD40Lで抗マウスIgG / IgMの（H + L）を追加します。後で測定（非活性化されたB細胞を表す）の陰性対照として機能するために、未処理のB細胞の一部を保管してください。
  3. 非活性化されたB細胞と比較して、12または24時間の刺激後にフローサイトメトリーによってGFP発現強度を評価します。
    注：GFP蛍光はNur77 GFP B細胞に固有のものであるとBCRの成功活性化時に明らかにされます。 12
  4. 顕微鏡による生存率および活性化（オプション）の評価のために、0.2μgの/ mLの濃度で、分析の前に、ヘキスト30分で活性化された細胞を染色。細胞懸濁液の適当な量を加えますカバースライドまたは平底黒両面384ウェルプレートのウェルへと生細胞を評価するために蛍光顕微鏡下で調べます。死んだ細胞は核染色を保持しません。 14

小分子の7.ハイスループットスクリーニング

  1. 活性化TまたはB細胞（磁気ビーズまたは抗体/ CD40L）または非活性化されたグループの2×10 6細胞/ mLで細胞懸濁液を準備します。
  2. プレート75,000細胞/ウェルで384ウェルプレート（40μLの容量）。平底黒両面384ウェルプレートまたはヘキスト染色を用いた蛍光顕微鏡法による生存率および活性化の評価のための顕微鏡カバースライドを（前HTSへのオプションの品質管理工程）（ステップ5.8および詳細については6.4を参照）を使用します。 14
  3. 手動または自動化システムを使用して、各ウェルに選択（0.5％DMSOに溶解）の薬剤を加えます。
  4. （活性化）正と負（非ACTIに車両（DMSO）を追加vated）対照ウェル。 0.5％の最大DMSO濃度を調整します。
  5. 37ºC、5％CO 2で24時間（または選択したインキュベーション時間）のために、プレートをインキュベートします。
  6. スクリーニングの日に、ヘキスト33342染色液希釈し（1：3333を、 例えば 、50μLの総容量を生成するために、384ウェルプレート中の細胞に10μLを追加します。）。 0.2 / mlの濃度を達成するためにヘキスト溶液を添加することによって、GFP分析の前に30分間染色。
  7. 静かに、各ウェル中の均一な分布を得るために、上下の細胞をピペット。
    注：この手順は、細胞が反対の流れの方向に、井戸の一方の側に蓄積する傾向があるとして、自動化されたシステムを使用して薬（ステップ7.3）を分配する場合に重要です。
  8. 室温で3分間、45×gでプレートをスピン。
  9. 室温で15分間休ませるプレートを残します。
  10. 自動化された共焦点の高いコンテンツSCREを使用して、アウトを読んプレート（複数可）を実行ening（HCS）システム。 15 マシンにプレートをロードします。 40X以上の倍率で目標を設定します。ヘキスト（UVランプ）とGFPのためのカメラ＃1（レーザー488）用のカメラ＃4を使用してください。ウェル当たり6-10のフィールドを読むためにマシンをセットアップします。 （ヘキストを読むために）488nmでフィールドごとに2つの連続読み取りを行うための機械（GFPを読むため）、UV光を調整します。 40X以上の倍率で目標を設定します。
    メモ：システムが調整を必要としないコンピュータ化された顕微鏡です。焦点距離、入射光の強度と曝露時間は、機械によって自動的にすべてのセットアップです。

結果

HTSアッセイの設計

本明細書中で蛍光アッセイを設計するときに、2つの重要な要素は、考慮されました。まず、T-またはB細胞の活性化は、病気（ 例えば 、移植片対宿主病）を表すことになるで生理学的状態を再現する必要がありました。第二に、細胞活性化の評価は、高感度で定量的な方法を用いて行うべきです。?...

ディスカッション

いくつかの読み出し方法は、高感度で信頼性の高いHTSアッセイの開発のために利用されています。これらは、比色、発光または蛍光方法が挙げられます。比色法は、アップを設定するのは簡単ですが、それらは、細胞が試験されている妨害または破壊し得る化学物質の複数回添加を必要とします。薬理効果は、特定のエンドポイントで評価されるように23加えて、彼らは生?...

開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作品は、モントリオール大学が提供するメルクFrosstスタートアップ資金によってサポートされていました。我々は彼らの議論、コメントやフィードバックのための免疫学および癌における研究所でのハイスループットプラットフォームから博士ジャンDuchaineとドミニクSaloisに感謝したいと思います。 Moutih Rafeiは、フォン・ド・ラ・RECHERCHEエンサンテケベックジュニア1賞を保持しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Nur77GFP miceThe Jackson LaboratoryMouse strain No. 016617An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterileVWR International10062-902T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterileCorning Inc.352350Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterileCorning Inc.352058Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterileVWR International89039-656 Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterileBecton, Dickinson and Company305482To mash the spleen
T-25 culture flaskGreiner Bio-One690 175To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterileGreiner Bio-One627 160To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL  Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamineWISENT Inc.350-002-CL Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acidsWISENT Inc.321-010-EL Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 MWISENT Inc.330-050-EL Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS) WISENT Inc.080-910 Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS)WISENT Inc.311-010-CLComponent of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kitStemcell Technologies19851To isolate T cells
B-Cells isolation kitStemcell Technologies19854To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beadsThermo Fisher Scientific11452DTo activate T cells 
Cell isolation magnetStemcell Technologies18000To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7Peprotech217-17 To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40LR&D Systems8230-CL/CFTo stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibodyBD Pharmingen561799To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibodyBD Pharmingen553786To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening SystemPerkinElmer Inc.HH14000000To analyze GFP/Hoechst signal

参考文献

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