母親の遺伝子産物の機能操作の使用<em&gt;インビトロ</emゼブラフィッシュにおける&gt;卵成熟

要約

母方の遺伝子産物の操作に使用ゼブラフィッシュの卵母細胞の体外成熟のために最適化されたプロトコルは、ここに示されています。

要約

動物胚発生の初期段階の間に行わ細胞事象は、発展途上卵母細胞に沈着母系の遺伝子産物によって駆動されます。これらのイベントは通常、受精、その卵の内側に以前から存在した後、すぐに行動する母体の製品に依存しているため、受精卵への試薬の注入を含む式と機能化のための標準的なアプローチは、一般的に有効ではありません。代わりに、このような操作は、前または母体の生成物の蓄積の間に、卵形成中に実行する必要があります。この記事では、成人期まで生存可能な胚を得、具体的に未熟ゼブラフィッシュの卵母細胞の体外成熟とそれに続く体外受精のためのプロトコルを記述しています。この方法は、そのような表現型のレスキューとタグ付けされた構築物の可視化のための製品の表現として、卵形成中の母体製品の機能操作を可能にする、ならびに逆遺伝学剤を介して遺伝子機能の低下をです。

概要

動物の発生時には、卵に母の預金遺伝子産物（ 例えば、RNAは、タンパク質、および他の生体分子）;これらの製品は、すぐに受精^1、2次早期の細胞プロセスのために重要です。受精卵³に試薬を注入するための標準的な手法を使用する場合、母体産物の発現および機能の操作は、典型的には無効です。ほとんどのRNAとタンパク質は卵形成の間に、卵母細胞によって生成されるので、これはですので、事前にロードされた母体の製品が成熟卵に既に存在しています。 MOSトランジスタのmRNA、受精における卵中に存在しない既存のタンパク質を標的とするので、このような既存の製品は、そのようなモルホリノアンチセンスオリゴ（MOS）などの遺伝子標的剤と機能的ノックダウンに対して不浸透性です。また、多くの初期胚のプロセスがinfluenされる受精後もすぐ起こりますRNAは、胚発生の最初のイベントに影響を与えるために十分に速く生成されなくてもよいように、受精卵に注入RNA由来のタンパク質産物によってCED。同じ理由から、初期胚での積極的な役割の間の視覚化のための時間で製造されなくてもよい受精卵へのmRNAの注入を介して発現されたタンパク質融合物をタグ付け。卵の活性化に先立って押し出され、成熟した卵母細胞への注入が可能であるが、同様の技術的な問題に関連している。こうした成熟した卵はすでに母性タンパク質が事前にロードされ、そして、彼らは卵後まで（すなわち、外因性の転写産物からタンパク質を産生する）並進アクティブになりません。活性化。これらの理由から、初期胚発生に作用する母方の遺伝子産物の操作は、一般的に成熟した卵母細胞における卵形成中に行う必要があります。

OOCの成熟を可能にするインビトロ成熟方法において 、これらのハードルを克服するための一つのアプローチとしてytes IV期からの卵の形成に、ゼブラフィッシュで確立されています。初期の方法は、 体外成熟で許可されますが、結果として成熟した卵は受精⁴のための有能ませんでした。その後、 インビトロ成熟^7,8後信頼体外受精（IVF）のために許可された魚種^5、6に見られる卵巣流体のアルカリ性pHを模倣pH9.0に中性から培養条件の操作、。実際、in vitroで -matured卵母細胞は^3、8肥沃ある成体まで生き残るためには、生きた胚を得ることができます。この改良された方法は、さらに、外因性発現を通して母性遺伝子の機能操作、ゼブラフィッシュ卵形成中のタグ付けされたタンパク質の発現を含むように適合されており、MO媒介機能は、マットにノックダウンuringステージIV卵母^3（ 図1）。

ゼブラフィッシュの卵形成は、成熟した卵母細胞^9（卵形成中の様々な段階のクイックガイドについては表1を参照）の形成をもたらす特性段数を示します。簡単に言えば、卵母細胞の開発は、ステージI、卵母細胞によって開始され、減数分裂の前期Iのdiplotene段階で逮捕されました。これらの卵母細胞は、（また、段階IIの間に開始皮質顆粒としても知られる）皮質胞の形成（ステージIAおよびIB中に開始）活性な転写による成長、及び卵黄形成（ステージIIIの間に開始）を受けます。卵母細胞の増殖が減数分裂Iは、卵母細胞の核の分解をもたらす、再開ステージIV、の間に完了され、卵核胞（GV）と呼ばれます。その後、減数分裂は中期IIで再び逮捕されました。ステージIV中の卵母細胞の成長と減数分裂停止の完了は成熟期Vなどにつながりますグラム^9。濾胞性膜の除去は、卵巣¹⁰の内腔に卵母細胞の放出の間に発生し、受精し、適切な卵活性化に必須です。卵は自然交配時に母親から押し出されると、それらが有効になります。ゼブラフィッシュでは、水への曝露に関係なく精子¹¹の存在の、完全な卵の活性化のために十分です。

インビトロ条件では現在、早期IV-そのサイズによって認識することができる（690から730ミクロン）からの卵母細胞の成熟のために起因するの蓄積に対して非対称位置に大きなGV、完全に不透明な外観の存在を可能にします完全に分解GVおよびタンパク質処理^12（ 図2C）を卵黄による半透明な外観によって特徴付けられる成熟ステージV卵-to卵黄タンパク質（ 図2B）。このアプローチでは、全体の卵巣続き開発の異なる段階でaining卵母細胞が雌から削除されます。卵母細胞を17α-20βジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン（DHP）、効果的な成熟誘導ホルモン⁸に開発することが許可されています。この期間中に、成熟した卵母細胞は、発現の注射（ 例えば、キャップされた、 インビトロ -transcribedのmRNA）または逆遺伝学剤（ 例えば、MOS）を介して操作することができます。卵胞層が自然に熟成期間の終わりに向かって流されないので、手動で削除しなければなりません。 defolliculation後、 体外受精は、（胚（E3）中に存在する）水¹³個の卵の暴露と精子溶液を通して卵の活性化を誘発することによって達成されます。結果の受精卵は胚発生を受け、（母方の遺伝子機能を操作するための治療法の能力を評価するため、および可視化とタグ付けされた母体の生成物の分析を可能に図3）。

プロトコル

関連する国内および/または地域の動物福祉団体によって定義されているすべてのゼブラフィッシュは、優れた動物の練習に厳密に従って処理された、そしてすべての動物の作業は、適切な委員会（ウィスコンシン大学マディソン保証番号A3368-01の大学）によって承認されました。動物は26.5℃で、標準的な条件下で維持しました。

女性の1.事前選択

注：卵母細胞は、成人女性では一般的に、ステージIからVに、発達段階の範囲に及ぶ（ 図2）。新しく開発した卵母細胞は、コホート^3、14のように見えるとして成功した自然交配を通じて既存の卵母細胞のメスをパージすると、卵母細胞ステージングの同期を向上させます。約8日後にパージの中で、最も卵母細胞は、インビトロ成熟の開始のために最適な初期段階IV、です。そのような同期化は、卵母細胞のTHAの収率を増加させますtは、実験操作を容易に、 体外成熟の完全なプロセスを経ることができます。一対の交配及び魚水組成物（ここで魚の設定の詳細については以前の記述^13を参照して、海の塩14gのと逆浸透水1000リットルあたりのNaHCO ₃を150g、pHが6.5〜8.5（好ましい範囲：6.8 -7.5）及び180から360μSの導電率）。ブランドらを参照してください。追加のレシピのための^13。

1. 8〜10日には、in vitro培養操作に先立って、相手側のタンクに所望の歪みのシングル男性とシングル女性の魚を転送するために魚のネットを使用しています。複数のセットをペア。一晩の交配タンクでそれらを残します。彼らは夜の間に、次の日の午後を通じて交尾できるようにします。
2. 交尾中に卵を得メスを分離し、別のタンクにそれらを配置するために、魚のネットを使用してください。食品の混合物で2回毎日これらの女性をフィードcontainiブラインシュリンプと魚の餌フレークのほぼ等しい量をngの。食べ物の量は、供給時間の約20分ではなく、より多くを、提供するのに十分でなければなりません。

成熟培地の調製

注：女性から卵母細胞を除去するための1時間以内に、 インビトロ成熟実験の日に、成熟培地を準備し（セクション3を参照）。

1. 無菌条件下で50 mLコニカルチューブにL-グルタミン、pH7.0でライボビッツL-15培地20mlを加えます。 10 N NaOHでpHを9.0にそれをもたらします。
2. 2本の別々の50 mLコニカルチューブにライボビッツL-15培地、pHは9.0、の9 mLを加え。ラベル1チューブ「+ DHP」と他の「-DHP。」
3. + DHP管中、17α、20βジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン（DHP）のdH ₂ Oの490μL、及び10％のウシ血清アルブミン（BSA）の500μLの10μLを加えます。
4. -DHPチューブに、10 MG / mlのゲンタマイシン、400の100μLを加えます81;のdH ₂ O、及び10％BSAの500μLのL。

3.卵母細胞の解剖及びインビトロ培養の開始

注：in vitroでの培養実験は、それらが自然交配を通じて卵を解放8-10日後に事前に選択されたメスを用いて行われます。同じ日に作られた成熟培地を使用してください（セクション2を参照）。解剖はおそらく自然交配を介して生じるプロセスを模倣し、（魚施設に予め設定人工照明により実験室で測定）魚概日周期¹³の終わり近くに開始された場合に、卵母細胞を適切に成熟します。これは、魚は標準の光周期の施設に収容されている場合は、プロトコルの中で最もステップは夕方に行わなければならないことを意味する（ 例えば、午前8時から10午後明期と施設で午後6時でステップ3.2から始まります）、他の作業時間期間は適切タイムシフト光周期で可能です。

1. 1 Mトリス、pHは9.0でpH 7.0に緩衝のdH ₂ O中の0.2％トリカインストック溶液を調製し、そして4℃で溶液を維持します。これは、事前に準備することができます。
2. 施設で毎日の光サイクルの終了前に、実験0~4時間を開始します。 250mLのビーカー中で、魚の水の80 mLに、0.2％トリカインストック溶液、pH7.0での20 mLを加え、混合します。
3. トリカイン溶液に事前に選択されたメスを転送し、露出オーバーでそれらを安楽死させます。鰓運動の停止後15分間トリカイン溶液中の女性を残します。
4. スプーンを使用して、トリカイン溶液から安楽死させた魚を収集し、魚の水で簡単にそれらをすすぎます。余分な水分を吸収するためにペーパータオルの上に魚を置きます。
5. 胸びれのレベルで安楽死させた魚を刎ねるためにきれいなカミソリの刃を使用してください。解剖ハサミを使用して、肛門部の前端から延びる、魚の腹側に縦切開を行います。
6. 入射光を解剖顕微鏡下でペトリ皿に魚を置き。切開鉗子のペアを使用して、4mLのリーボビッツのL-15培地+ DHPを含有する35×10 mm培養皿に卵巣部分を転送します。
   注：発展途上卵母細胞を含んで卵巣は、内部体腔内に不透明と塊状の構造として表示されます。
7. 解剖鉗子を使用して、そっと濾胞大衆から卵母細胞を解離します。ソート早期IV卵母細胞（ 図2B;ほぼ最大サイズで、GV破壊の前に、暗い、不透明細胞質および卵母細胞内の非対称配置は容易に明らかGVによって特徴付けられます）。初期段階（ 図2A）での卵母細胞と（前DHPの治療に図2Cのものと類似しているが卵巣に存在する）半透明の、成熟ステージVの卵を廃棄します。
   注：卵母細胞は、早期IV、成熟した、ステージVのoocytになり早い段階で成熟のために選択されていますインビトロ培養条件（ 図2C及びD）後にES ^3。 IV期の卵母細胞が活発に製品を生産しているので、この段階での操作は、RNAの注入を介して、または導入のMOを介して遺伝子機能の低減のための外因性産物の発現を可能にします。
8. 4mLのリーボビッツのL-15培地+ DHPを含む第二の35×10ミリメートルのプラスチック培養皿に早期IV卵母細胞を転送するためにガラスパスツールピペットを使用します。 + DHP溶液を含む皿に-DHP媒体の最小量を転送します。

4.卵母細胞のマイクロインジェクション

注： 体外成熟に受けて分離され、ステージIVの卵母細胞は、機能的な操作やタグ付けされたタンパク質の発現のための試薬を導入するマイクロインジェクションしすることができます。そのようなmRNAおよびMOS（セクション4を参照）のような試薬のマイクロインジェクションは、典型的には、卵母細胞は、インビトロ matu受けているときに行われます。defolliculation前に+ DHP媒体で配給、。所望であれば、前の卵母細胞の成熟に操作を行うために多くの時間を可能にするために、注射は、少なくとも2時間、熟成の前、-DHP媒体中で行うことができます。彼らは、その後+ DHP媒体に転送することができます。

1. 標準的な発現キットを使用してmRNAを準備します。 50-500 PG /μLの最終濃度で注入するための100〜500頁/μLのストックとして-80℃でそれらを保つRNAグレードの水（200 PG /μL推奨します）。製造元の指示に従って、水に4 ng /μLでの濃度でMOを準備します。 2 NG /μL（又は経験的に決定）の最終濃度でそれらを注入します。
   注：注射は一般的に（セクション5でノートを参照してください）defolliculation前に+ DHP媒体中で実施されます。
2. mRNAを注入する場合、注入の直前に、0.1 MのKClの最終溶液を達成するために、RNAグレードの逆浸透水及び0.2 MのKClを用いてmRNAを希釈します。
3. MOを注入する場合、注入の直前に、0.1 MのKClの最終溶液を達成するために、逆浸透水、および0.2 MのKClを使用して所望の濃度にMOを希釈します。
4. 手動で微鉗子で卵母細胞を保持し、プルガラスキャピラリーピペットを用いて作られた針を用いて、野生型ステージIVの卵母細胞に約1株NL注入します。
   1. 以前にゼブラフィッシュ初期胚¹⁵に標準注入のためのプロトコルに記載されているように、加熱されたガラス毛細管を引っ張る注入される溶液をロードし、そして鉗子で針先端を破壊することによって、ガラス針を準備します。
      注：針ではなく、急激なものよりも緩やかなテーパを持っている場合、それは便利です。これは、針の先端にある休憩の場所の面でより多くの柔軟性を可能にし、また注入された胚の損傷を防ぐことができます。胚の注射と同じ針および溶液を使用して、事前決定することによって、注入量を調整します所望の容積を作り出すマイクロインジェクター圧力設定。以前に^15を説明したように、これらの設定は、モック注入顕微鏡ステージ較正スライド（0.01 mm）の上にミネラルオイルの滴にし、注入された溶液のボーラスで所望の直径を得るために、マイクロインジェクターの設定を調整することによって決定することができます。

5.卵母細胞の成熟とDefolliculation

注：卵成熟の間に、卵母細胞は、成功した培養条件の評価を可能にする、徐々に半透明になります。

1. 未熟をインキュベートし続け（及び、適切な場合、注射）（図2Cを参照）卵母細胞を無傷のままと徐々に半透明になることによって、適切な成熟を受けていることを確認するために定期的に（30分毎に）検査、26.5℃、+ DHP媒体に卵母細胞を。
   1. パスツールピペットで任意の溶解卵母細胞を取り出し、それらを捨てますラボ廃棄物のビーカーにメディアの品質を維持するために。卵母細胞溶解の量に応じて、透明な溶液を維持するために、新鮮な+ DHP媒体の約半分の容量で培地を交換します。
   2. 卵母細胞の大部分が半透明になり、もはや明らかであるGV有する（DHPの治療において、約2時間、Dと比較して、 図2Cを参照）までin vitroで成熟が進行することを可能にします。透過光光学系と解剖顕微鏡下でそれらを表示します。
2. 各成熟した卵母細胞から最も外側の濾胞性膜を除去します。卵母細胞と膜の間に増加したスペースを持つ地域の濾胞性の膜で涙を作るために極細のピンセットを使用してください。膜の一部を剥離し、剥離部を押したままの膜から卵母細胞をロール。
   注：基礎となる絨毛膜は、一般的に、このプロセスの間に卵と密接に関連して残ります。卵の行為の後ivation、それは胚のための保護層を形成するために拡張されます。
3. 培養（+ DHP）中の数滴を有するペトリ皿に（典型的には、20未満μLで約5~10成熟卵母細胞を転送する）媒体の最小体積で濾胞除去卵母細胞を転送し、受精に進みます。

インビトロ培養卵母細胞の受精6

注：氷上の精子溶液を、以下の準備は、約2時間のためにその効力を維持します。

1. 先に^{図16、 図17}のように、ハンクス溶液の500μLで5人の男性から精巣を用いdefolliculationする卵母細胞の成熟段階の前の終わり近く精子溶液を調製します。
2. + DHP培養培地中の濾胞除去卵母細胞に精子溶液を10〜50μLを追加します。 10秒待ってください。
3. ピペットを用いて、卵母細胞を胚（E3）中の数滴を追加します。 PL 1分待ってから、洪水E3培地で食べました。
   注：5 mMの塩化ナトリウム、0.17ミリモルのKCl、0.33 mMのCaCl ₂を、0.33 mMのMgSO ₄を、および1~5％メチレンブルー^13を次のようにE3培地の組成物です。
4. 繰り返しは、受精胚のより多くを得るために、5.3、6.2、および6.3を繰り返します。
5. 受精胚を開発できます。以前に受精¹⁷及び^18をステージングするために記載されているように、成功した受精を確実にするために、切断段階を介して進行を観察するために、透過光光学系と解剖顕微鏡を使用します。

結果

上記の手順が成功したかどうかを決定するために、胚はステレオタイプ初期胚の切断パターン¹⁸の外観を確認するために、切断段階の間に観察することができ、ならびに24時間後に受精（HPF）での適切な展開を確認します基本的なボディープランの。この手順は、卵母細胞の発育中のmRNAとMOSなどの試薬の注入を介して機能的研究のための母体製品の操作を可能にします。

機能的研究のための母性製品の操作：

野生型および変異した製品のためのmRNAのコーディングは、減数分裂および初期胚の段階で母体の遺伝子機能の操作の効果をテストするために、in vitroで成熟した卵母細胞に注入することができます。例えば、野生型の胚は、Wiを注入することができますこれらのプロセスにおける潜在的な（ 例えば、機能獲得型およびantimorphic）支配的な効果を試験するために、製品の過剰発現の効果のために、または変異RNAでテストするLD型のmRNA。卵形成の段階IVに培養条件を開始のみ卵母細胞（成熟ステージVの卵母細胞に図2Bを開発することができるが、インビトロ培養中の卵母細胞は、注入されたmRNAからのGFPの発現によって示されるように、卵母細胞の開発を通じて、外因性mRNAからタンパク質を産生することができます-2Dは 、）もNairさんら ³参照します。注入されたmRNAを介して野生型産物の発現はまた、ポジショナルクローニング^3、24時遺伝子の同一性を確認する母性効果突然変異の救出のために器械です。この場合、野生型mRNAは、野生型産物が変異表現型を救出できるかどうかを試験するためにホモ接合変異体の雌からの卵母細胞に注入されます。この遺伝的救助をに例示されています<AurBのmRNAを注入強い>図3A-3Cは 、その対応する遺伝子、 細胞島 （CEI）（ 図3A-3C）の変異の表現型効果を救出することが示されています。対照群の胚は、対応する変異体の表現型^3を表示するように開発することが許可されています。変異RNAはまた、突然変異した生成物は、野生型産物によって引き起こされるものにレスキューの程度を比較することにより、部分的機能を保持しているかどうかをテストする変異卵母細胞に注入することができます。

発展途上卵母細胞に注入したmRNAからタンパク質発現はほとんど、あるいはまったく遅れで発生することが表示されます。強いGFP発現が関係なく、卵母細胞³の発達段階の、対応するmRNAの注射の2時間以内に観察された（ 図2B-2D;また、Nairさんら ³ 参照します。）。このようmCherryをなどの製品：SAS6とBirc5b（モトリー）：GFPは、受精直後及び第胚細胞周期^3、25の間に観察することができます。卵形成中のmRNAの注入はまた、 細胞島/ aurB ^3、 無益サイクル/信号Lrmp ²⁴母体製品の場合に示されるようにかかわらず、融合タグ付けされた部分の、受精直後に機能する、タンパク質の産生をもたらすと雑多/ bir5b ^25。翻訳ブロッキング/ dhx16 ³ 不可能ミッションの場合のように、無駄なサイクル/信号Lrmp ³および胚形成の後期段階で示すように、MOSも、受精直後効果を有します。成熟した卵母細胞に注入したときにスプライス - ブロッキングMOのは、ステージIV卵母細胞における可能性の高い原因に既に存在する成熟母性転写産物、母体の機能に影響を与えないかもしれません 3。

モルファントの生成：

既に同定された変異を有する遺伝子に対応するMOを使用する場合、モルファント表現型は、変異体の表現型を模倣すると予想されます。モルファントは非注入胚および標準、コントロールMOを注入したものと比較されます。翻訳ブロッキングモルフォリノの注入は正常に対応する突然変異、 無益サイクル （図3D-F）の変異体表現型を模倣する卵母細胞に信号Lrmp MOの注入によって示されるように知られている変異体の表現型^3を 、表現型模写することができます。 MOの特異性は、胚（以前にレビュー^）19、20にMOを注入する際に使用したのと同じ手法によって決定することができます。

蛍光標識融合タンパク質の発現：

蛍光タンパク質（ 例えば、GFPとmCherryを）に融合した関心対象の遺伝子産物のmRNAをコードはまた、細胞内局在化パターンを反映した初期胚（ すなわち、内の対応する製品を視覚化するために、野生型または変異卵母細胞のいずれかに注入することができる。 図3Gそして3H）。同様の融合物をコードするが、変異対立遺伝子を含むmRNAは同様に変異が潜在的な細胞内局在に影響を与えるかどうかをテストするために発現させることができます。

図1： インビトロ卵母細胞の成熟に 。 in vitroでの卵母細胞の成熟に関与する様々なステップを示す概略図。大人の女性がすでに成熟している卵のプロにそれらをパージするために、前の手順に産卵8日間事前に選択されてい新しい卵母細胞の開発をモテ。現像卵母細胞を含む卵巣は、女性から取り出し、 インビトロで卵母細胞の成熟を誘導するホルモンDHPを含む培地に移します。女性直前に又は卵母細胞の成熟中から取り出した後、卵母細胞を母性因子の機能操作のためのRNA産物および他の試薬を注入することができます。成熟した卵母細胞を手動で濾胞除去し、受精、生存可能な胚を得るために精子溶液を用いてインビトロで受精されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 体外卵母細胞の成熟と注入されたmRNAからの産物の発現で 。 （A）は、卵巣からで観察された、ステージI-IIIでの卵母細胞雌の4日後にパージ（DPP）。 （B）はメス8 DPPから卵巣において観察、ステージIVで卵母細胞。卵核胞（GV、矢頭）がはっきりと見えると偏心した位置を占めています。 （A）におけるステージIII卵母細胞はまた、容易に明らかGVを示し、それは、卵母細胞の中央に見出されます。 （B）におけるステージIV卵母細胞は成熟卵母細胞（C）に比べて最大の近くにある大きさを持っています。 インビトロ成熟条件で2時間は、（B）のように、ステージIVで開始、およびGFP-符号化、 インビトロで転写されたmRNA（C、可視光で成熟中に注入した後（C及びD）は、ステージV（成熟卵母細胞）に卵母細胞のみ; D、可視光およびGFP蛍光のオーバーレイ）。 GVはまた、IV期の卵母細胞よりも少ない不透明であるステージVの卵母細胞においてはもはや明らかではありません。注入した卵母細胞は、GFPタンパク質（D）を発現します。成熟したIV期の卵母細胞のDefolliculationは、DESでありますプロトコルセクションでcribed。スケールバー=300μmです。すべてのパネルは、Nairさんら ³から、許可を得て、再現されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3： インビトロ卵母細胞の成熟による操作と母体製品の可視化。 （A - C）ステージIV CEI / aurB卵母細胞に野生型aurB mRNAの注入を介して細胞島/オーロラBにおける変異により引き起こされる母性効果表現型のレスキュー。膜（緑色）を強調するために、抗β-カテニン抗体を用いて可視化65 MPF固定blastodiscsの動物ビューを示すマージされた画像は、微小管を示す抗αチューブリン抗体（赤）、およびDAPIがDNA（青）を指定します。 （A）正常畝間の成熟を示す野生型胚におけるβカテニンの蓄積、。 （B）非注入CEI / aurBステージIV卵母細胞からCEI / aurB胚は、βカテニンを蓄積していない部分、基本的な畝を示しています。野生型aurB mRNAが畝で堅牢βカテニンの蓄積を示すを注射CEI / aurB卵母細胞から（C）レスキューCEI / aurB胚 。 （D - F）モルホリノステージIV卵母細胞に信号Lrmpの注射から無益サイクル/信号Lrmpの変異によって引き起こされる母性効果の表現型模写。 DNA（青）を指定するために中心体（赤）およびDAPIを示すために、抗γチューブリン抗体を用いて可視化70 MPF固定blastodiscs、動物のビューを示すマージ画像。野生型胚において（D）、γチューブリン各核会合、中心体材料のためのマーカー。 （E）は、母性効果FUE変異体では、前核融合は、融合していない親のプロ核および減数分裂IIの極体に対応するDNA標識の2~3パッチ、その結果、失敗しました。母体信号Lrmpの機能が阻害される（F）は信号Lrmpのモルファントにおいて、核は同様に分割することができないと、加えて、γチューブリンと関連付けることができません。 （GとH）初期胚における母性製造された製品の可視化。ステージIVの卵母細胞に注入し、外因性mRNAからのSass6-mCherryをタンパク質は、中心小体に局在します。マージされた中心体（緑色）を強調するために、抗γチューブリン抗体を用いて可視化40 MPF固定blastodiscsの動物のビューを示す画像、DNA（青）を指定するSass6（赤）、およびDAPIを示すmCherryを蛍光。 （G）は Sass6-mCherryをタンパク質が核（矢印）に隣接する部位で中心体マーカーγチューブリンによって標識された病巣に局在発現しました。 （H ）同じ画像が、明確にするためだけSass6-mCherryを及びDAPIを示します。 （GおよびH）における胚は固定されているが、例えばmCherryを融合として発現生成物の蛍光は、また、生きた胚で観察することができる（図示せず）。スケールバー=100μmのAF及び10μmのGおよびHのすべてのパネルは、Nairさんら ³から、許可を得て、再現されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

卵形成のステージ	卵母細胞径（μm）	主なランドマーク（S）
1A - Prefollicle	7〜20	アクティブな転写の開始、核小体の蓄積
1B -卵胞	20から140まで	染色体の脱凝縮
II -皮質肺胞	140から340まで	皮質肺胞生産
III -卵黄	340から690	卵黄前駆体タンパク質と脂質の蓄積によって卵細胞質が暗くなります
初期IV -卵母細胞の成熟	690〜730（低域）	胚胞の非対称ローカライズ
初期IV -卵母細胞の成熟	690〜730（上限）	胚小胞が消失し、中期IIで逮捕
V -成熟卵母細胞	〜750	卵細胞質/卵黄は半透明になり

表1：ゼブラ卵母細胞の開発のランドマーク魚。

ディスカッション

上記のプロトコルは、このように初期のゼブラフィッシュ胚における母性遺伝子産物の研究のためにできるように、受精前の遺伝子産物の操作のためです。以前の研究は、in vitroで ⁴卵母細胞を成熟することができました。このプロトコルは、卵母細胞成熟⁸ in vitroでのその後の受精を可能にするために変更されました。これは、順番に初期胚³における母性遺伝の製品の機能の操作や可視化のための試薬を注入するのを可能にします。この方法から得られる胚は生きすることができ、肥沃な大人になるために生き残ることができます。その段階で鰾インフレによって評価されるように予備実験では、この手順から派生受精胚の約半分は、健康、肥沃な成人（未発表の観察）となっおよそ半分が、開発の5日目に生存していました。

いくつかありますプロトコルに考慮すべき重要なステップの。女性は8 DPP前に最近交配ではなく、されている場合は成熟（初期段階IV）を開始するための適切な段階での卵母細胞を濃縮することができます。最近交配していない魚を使用して、成熟を受けない卵^14を 、縮退する可能性があります。未満8日以内に交配した雌は、ステージIII以下で卵の過半数を持つことになり、ひいては、卵は試験管内で適切に成熟していないだろう。 8日前交配した雌で卵巣は早い段階IVにおける卵母細胞の最適な割合を持っています。これらは、それらの不透明性と偏心位置（ 図2B）でGVの存在によって認識することができます。卵母細胞を顕微鏡下で卒業マイクロスライド上に置き、標準的なステージングのガイドライン（ 表1）と比較して、卵母細胞段階決意はまた、サイズの測定によって補助することができます。しかし、初期段階IV卵母細胞が成熟に比べてほぼ最大の大きさを持っています（それらの相対的な透明性とGVの欠如によって認識; 図2C）卵母一般直接卵母細胞サイズの測定の必要性をなくすれ、上述したようには容易に認識されます。

体外成熟では女性の卵母細胞ドナーが順化された日光サイクルの最後の数時間以内に開始しなければなりません。卵母細胞は、光サイクルの朝の期間中に培養した場合に、貧しい受精率に反映され、正常に成熟していないだろう。 in vitroでの卵成熟方法の概日依存の理由は理解したが、おそらく卵形成の間に²¹サイクリング遺伝子の発現を含むin vivoでの卵成熟において基本的な概日偏見を反映していません。適切な卵母細胞ステージングにもかかわらず、 体外成熟に成功受けることに失敗した卵母細胞のための一般的な原因は、DHPの有効期限が切れているということです。 DHPホルモンは、一般的に一年後に期限切れになり、その効果を保証するために、アイブ成熟は、作業バッチは、使用の9ヶ月以内に交換する必要があります。

この方法の目的は、母体の製品の機能操作であるとき、卵母細胞の注入は、別の重要なステップです。この手順は、0-30 MPFで受精卵における標準注射用のものとは異なる要件があります。卵母細胞注入の重要な要素は、そのようなライボビッツL-15培地^22、23のように未熟卵の活性化につながらない条件下で注射を行う必要があります。彼らは卵巣に埋め込まれているため、成熟した卵母細胞はまた、注射に特定の課題を提起します。プロトコルは、前述の第1の卵巣からの卵母細胞を解離した後、注入しながら各鉗子で別々に卵母細胞を解離保持示唆する。この技術はうまく機能し、最小限の取り扱いに適当な段階で事前選別した卵母細胞を可能にしています。代替的な方法も使用することができる、そのようなI）トラフの垂直壁は、注入中、卵母細胞をサポートする標準的な射出アガローストラフ¹⁵に卵母細胞を配置する（この代替方法では、卵母細胞は、インビトロ成熟培地中に保持しながら、注入プレートに転送する必要がある）とII：として）卵母細胞（このアプローチでは、卵母細胞の両方に注射した後に解離されるべき注入卵母細胞との接触を回避するために、注入中に鉗子で保持することができ、卵巣質量に取り付けられたままにできるようにするDHP露光を容易にし、そのdefolliculationを可能にします）IVFのために、自身が不可欠。この段階での絨毛膜が完全^9開発されていないため、この特定の課題にもかかわらず、ステージIV卵母細胞は、容易に可能性が注射針で貫通することができます。

現在成熟プロトコルの1つの制限は、 体外成熟条件下で適切な卵母細胞の発達を促進することです卵成熟がステージIVよりも早い段階で開始されたときに作成することができません。卵母細胞は、それらが（340対690μmの範囲に対応する、卵黄形成）ステージIIIの間に生じる520ミクロンの直径に達したときに成熟を経てDHPに応答する能力になる^9。しかし、受精³有能でない卵母細胞におけるステージIII卵母結果の培養。のみ、そのインビトロ培養は、ステージIV（ 図2B）で開始される卵母細胞は成熟した、ステージV卵母細胞（ 図2C及びD）に発展することができます。これは、ステージIIIは、卵黄形成卵母細胞増殖⁹に必須であるという事実に関連し得ます。したがって、この記事で提示インビトロ卵成熟の手順は、IV期の卵母細胞（B）の出発集団とではなく、初期段階（段階Iにおける卵母細胞と一緒に使用されるべきである- III、E Figur 2A）。同じ理由のために、この手順は、ステージIVまたは後に発現される遺伝子に限定されています。製品以前に発現される遺伝子の機能的な操作ではなく、遺伝的方法（下記参照）に依存する必要ができます。 インビトロ培養成熟法の改善は、将来的にこのようにしてin vitroで成熟アプローチの力を拡大、早い段階での卵母細胞培養の開始を可能にすることができます。

提示された方法における別の制限は、受精を伴う後続のステップのために必須であることdefolliculationは、現在手順における律速段階です。卵胞膜は現像卵母細胞を取り囲む透明層であり、除去が面倒であることができます。この膜が完全に除去されない場合、卵が完全に活性化し、受精になることはありません。これは、拡大する絨毛膜の失敗と不規則に置かれ、畝のようなSTの開発によって明らかに作られますructures（pseudocleavages）、未受精胚¹¹の特性。コラゲナーゼのような酵素defolliculation方法は、 アフリカツメガエルで使用されるように、試みられています。しかし、私たちの手の中に、この手法は成功していない、と私たちはそのためのマニュアルdefolliculationに依存しています。マニュアルdefolliculationは労働集約的で時間がかかるので、in vitroで卵成熟後の受精卵の大きなバッチを得ることは困難です。手動defolliculationによって課される時間的制約のために、我々は現在、5〜10個の卵の小さなバッチで、一度にいくつかの濾胞除去、成熟した卵子を受精します。この手順での酵素defolliculationの組み込みは、おそらくかなりの収量と利用の全体的な使いやすさを向上させるでしょう。

インビトロ -matured卵母細胞の受精後に生成した胚は、実行可能な大人になることができますが、我々は、 体外受精後、胚の割合が行うことに注意してください通常、またはタイムリーに分けていません。現在、この方法によって誘導された胚で発達のより堅牢なパターンをもたらし得る、その伝搬インビトロ卵成熟のラウンドを含む行について選択されます。

手順は突然変異^24、25の数のための明確な救助またはタンパク質の局在化の可視化を可能にしました。しかし、いくつかの遺伝子について、産物発現の調節は非常に重要であり得るので、注入のmRNAによって発現産物は、変数結果²⁶につながる可能性があります。すべてのコントロール（ 例えば、唯一の不活性タンパク質をコードするような制御のMOとしての効果を生成しないように、まだ予測される実験に使用したものと同様の特性を有する試薬、またはRNAを注入した胚、そのように留意することも重要ですGFPなど）、根本的な変動が不適切な結論につながる可能性として。

NT ">受精が続くインビトロ操作を伴うアプローチを効果的に製品を低下させてもよい受精卵にRNAに、MOS、またはタンパク質を注入する標準的な方法は、既に卵に蓄積母性堆積製品の場合に特に有用です。そのようなCRISPR変異生成など、他の最近開発された方法は、また、母性発現遺伝子²⁶に対する変異条件を生成するのに有効である。しかし、この方法は、魚のいくつかの世代の成長を必要とする。 インビトロ卵成熟技術はへの迅速な機能的操作を可能にします救助及び母性効果変異の表現型模写、ならびに初期胚におけるRNAおよびタンパク質の発現を含む母性発現遺伝子の機能を研究します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO2-7H2O	Sigma	63138
NaHCO2	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4 - 5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 mL			any maker
Ice bucket			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
beakers, 250 mL (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 medium	Thermofisher	11415064
NaOH	Sigma	221465	for pH'ing
BSA	Sigma	A2058
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)	Sigma	P6285
gentamicin	Sigma	G1272
Injection Apparatus	Eppendorf	FemtoJet	or equivalent
Capillary Tubing for injection needles	FHC	30-30-1	or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm
Needle puller	Sutter Instruments	Model P-87	any maker
Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips			any maker
Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips			any maker
Conical tubes 15 mL			any maker
Conical tubes 50 mL			any maker
plastic pipette 10 mL with bulb			any maker
plastic pipette 20 mL with bulb			any maker
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm	AmScope	MR095	or equivalent
Reagents for fish water:
Instant Ocean Salt	Drs. Foster & Smith	CD-116528
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761-1KG
Reagents for E3 medium:
NaCl	Sigma	S5886-1KG
KCl	Sigma	P5405-500G
CaCl2, dihydrate	Sigma	C7902-500G
MgSO4, heptahydrate	Sigma	63138-250G
Methylene Blue	Sigma	M9140-25G
Fish Food:
Frozen brine shrimp	Brine Shrimp Direct	FBSFKG50
Tetramin Flakes	Drs. Foster & Smith	16623