軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

要約

幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必​​要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。

要約

軟骨工学は、ネイティブの組織に似たin vitro機能インプラントを作成するのが困難に起因する課題です。最近、自家代替品の開発のための探求のアプローチは、軟骨細胞への幹細胞の分化に関与します。この軟骨形成を開始するには、幹細胞の圧縮度が要求されます。したがって、我々は、細胞アトラクタとして小型化磁界源を使用して、厚い足場と足場フリー内の両方、磁気凝縮細胞の実現可能性を実証しました。この磁気アプローチはまた、凝集融合を誘導する足場を含まない構築するために使用される組織化、三次元（3D）のサイズの数ミリメートルを組織しました。強化されたサイズを有することに加えて、磁気駆動の融合によって形成された組織は、コラーゲンIIの発現の有意な増加を提示し、同様の傾向がアグリカン発現のために観察されました。ネイティブの軟骨が力トンに供した通り帽子は、その立体構造に影響を与えた、ダイナミックな成熟も行いました。機械的な刺激を提供するバイオリアクターは、21日間にわたって培養物に磁気播種足場を使用しました。バイオリアクターの成熟は、主として細胞化足場に軟骨形成を向上させます。これらの条件下で得られた細胞外マトリックスは、コラーゲンIIおよびアグリカンに富んでいました。この作業は、改善された軟骨形成分化、足場フリーの両方に多糖類の骨格内のバイオリアクター中で標識された幹細胞の磁気凝集及び動的成熟の革新的な可能性を概説します。

概要

磁性ナノ粒子は、既に磁気共鳴画像（MRI）用造影剤としてクリニックで使用されており、それらの治療への応用が拡大し続けます。例えば、最近、標識された細胞は、移植^1、2、3の定義された部位に外部磁界を用いてin vivoで操作することができ、向けることができ、および/または維持することが示されています。再生医療において、それらは血管組織^{5、6、7、8、}骨、および軟骨⁹を含むインビトロ ⁴ で編成組織を操作するために使用することができます。

関節軟骨は、損害が発生したときに、非常に限られた細胞外マトリックス成分の修理を行う、無血管環境に浸漬されます。このため、researc用時間は、現在、欠損部位に移植することができ硝子軟骨置換のエンジニアリングに焦点を当てています。他のものは軟骨^12,13に分化する間葉系幹細胞（MSC）の能力を強調しながら、自己置換を生成するために、いくつかの研究グループは、セルソース^10、11のような自家軟骨細胞の使用を模索しています。彼らの骨髄採取はかなりシンプルで、自分の表現型^14を失う危険健全な軟骨細胞の犠牲を必要としないので、ここで再現した以前の研究では、我々は、MSCを選択しました。

幹細胞の軟骨形成分化を開始するために不可欠早い段階で彼らの結露です。細胞凝集体は、一般に遠心分離またはマイクロマス培養¹⁵のいずれかを用いて形成されています。しかし、これらの縮合方法neitheR厚い足場内の細胞クラスタを作成する可能性も凝集体の融合を制御する可能性を提示します。本稿では、MSC磁気標識及び磁気吸引力を利用した幹細胞を凝縮する革新的なアプローチについて説明します。この技術は、ミリメートルスケール軟骨組織^9を得るために互いに凝集体の融合を介して足場フリー3D構築物を形成することが証明されています。厚いと大きな足場の磁気播種はまた、改変された組織のサイズを大きくする移植のためより容易に有用な形状を設計、および軟骨修復における臨床応用の可能性を多様化する可能性を可能にしました。ここでは、天然多糖類、プルラン、およびデキストランからなる多孔質足場にMSCの磁気シーディングのために、私たちの詳細プロトコルは、足場は以前幹細胞^16、17を閉じ込めるために使用されます。軟骨形成分化がfinallましたyは細胞の高い密度で播種した足場のマトリックスコアに連続的な栄養素とガス拡散を確実にするために、バイオリアクターで行います。細胞に栄養、軟骨形成成長因子、およびガスを提供するだけでなく、バ​​イオリアクターは、機械的刺激を提供しました。全体として、バイオリアクター内で動的成熟と組み合わされた幹細胞を閉じ込めるために使用される磁気技術は、著しく軟骨形成分化を向上させることができます。

プロトコル

磁気デバイスの1建設

注：細胞播種のために使用されるデバイスは、アプリケーションに依存して変化する（ 図1）。磁気チップは（直径750μm）と非常に薄くなければならないので、凝集体を形成するために、細胞数は、2.5×10 ⁵ /集約に限定されます。 1.8センチメートル^2月 7日mm厚足場を播種するために、磁石は大きくなければならない（直径3mm）と、足場の孔を通って細胞移動を確実にします。

1. 凝集体形成のための微小磁石を有するデバイスの構築（ 図1A）
   1. アルミニウム板を介して0.8 mmのドリルを有するマイクロ孔（直径3センチ、厚さ6mm）を作ります。
   2. プレートの各穴に磁気先端（直径750μm）を挿入します。
   3. 飽和に磁化を確実に永久ネオジム磁石、上でこのディスクを置きます。
2. 足場の播種用のデバイスの構築（ 図1B）
   1. 2.4センチメートル^2つの正方形にハードポリスチレンをカット。
   2. 1.6センチメートル²の表面積にわたって等距離9つの小さな磁石（直径3mm、長6ミリメートル）を挿入します_。
   3. 永久ネオジム磁石の上にこのデバイスを置きます。

2.幹細胞標識

注：これらは30分（5±0.4 pgの鉄/細胞）で播種するために0.2mMの磁性ナノ粒子で標識しつつ、幹細胞は、30分（2.6±0.2 pgの鉄/細胞）凝集体を形成するために0.1mMの磁性ナノ粒子で標識しました足場。これらのナノ粒子の濃度およびインキュベーション時間は、以前に使用し、MSCおよび他の細胞^18、19のために公開し、ナノ粒子がどちらの細胞生存率もMSCの分化能に影響を与えたことが確認されているされています。幹細胞に組み込まれた鉄の塊は、単一のCEを介して測定しました。LL磁気泳動^19、20。

1. 近くまで37℃、5％CO ₂で、完全な間葉系幹細胞増殖培地（MSCGM）で培養ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、（〜90％）をコンフルエンスまで。
2. グルタミンなしロズウェルパーク記念研究所（RMPI）で修飾された無血清マッコイ5A培地および5を含む：0.1又は0.2ミリモルのマグヘマイトクエン酸でコーティングされた鉄酸化物（8 nmの直径コア被着_γFe2 O _3）を混合することにより、磁気標識溶液を調製mMクエン酸ナトリウム。
3. 、培地を捨てグルタミンなしの無血清RPMI培地で細胞をすすぎ、150-cm ²の培養フラスコ、すべてのセルをカバーするために必要な最小体積当たりの鉄酸化物ナノ粒子溶液10mLを加えます。
4. 37℃で30分間インキュベートし、5％CO _2、次いでナノ粒子溶液を捨てます。ナンを内部化するためにグルタミンなし無血清RPMI培地で5分間すすぎますまだ形質膜に付着oparticles。
5. RPMI培地を廃棄し、フラスコ当たり完全MSCGM培地25mlを加えます。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO _2。

3.磁気細胞播種

1. 新たに50μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸、0.1μMデキサメタゾン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.35 mMのL-プロリン、1％ユニバーサル培養を添加することにより、L-グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、高グルコースを用いて軟骨形成培地を調製インスリン、ヒトトランスフェリン、および亜セレン酸（ITS-プレミックス）、及び10ng / mLの形質転換増殖因子ベータ3（TGF-β3）を含むサプリメント。
2. 150-cm ²の培養フラスコ及び遠心あたり0.05％トリプシン-EDTA 8mLの5分間260×gで解離した細胞を用いた磁気細胞を切り離します。メディアを吸引除去し、再懸濁した細胞を数えます。
3. 両方の磁気デバイスの上部にガラス底細胞培養ペトリ皿（34 mm）を置きます。
4. Mにagnetically、凝集体を形成するペトリ皿に軟骨形成培地3mlを加え、穏やかに（16の凝集体まで堆積させることができる）集計当たり2.5×10 ⁵個^の標識細胞を含有する可能最小体積（これ以上8以下μL）を堆積させます。それはスフェロイドを形成することができ、それを移動させずに20-30分間ペトリ皿を残し、その後、37℃、5％CO ₂インキュベーター中に、16の凝集体を含有するペトリ皿を含む、完全なデバイスを配置します。
5. フォームコントロール凝集同じプロトコルに従い、TGF-β3なし軟骨形成培地を完全培地を交換してください。
   1. 3D集合体構築物を作製するために、8つのダブレットを形成し、融合を開始することを8日目に接触して2骨材を配置します。 11日目に、4つの四つ組を形成する2つのダブレットをマージします。最後に、最終構造を得るために15日目に4つの四つ組を融合。
   2. 同時に、2.5×10 ^5を遠心分離することによってフォーム凝集体が260で幹細胞を標識し15; TGF-β3を伴うまたは伴わない軟骨形成培地1.5 mlを15 mLチューブ中で5分間G（サンプルおよびコントロールのための、それぞれ）。
6. シード足場を磁気的には、ペトリ皿に各乾燥足場を置きます。プルラン/デキストラン²¹で作られた多糖類の多孔質足場を使用してください。各足場のために、TGF-β3なし軟骨形成培地350μL中に2×10 ^6個の標識された幹細胞を希釈し、慎重に足場上に細胞をピペット。
   1. 足場内で完全細胞侵入を可能にするために37℃で5分間インキュベートし、次いで穏やかにペトリ皿に（試料又はコントロールのため、それぞれ）TGF-β3の有無にかかわらず軟骨形成培地3mlを加えます。
   2. 足場の孔および閉じ込めを介して細胞の移動を可能にするために、4日間、37℃、5％CO ₂での磁気デバイスで細胞化足場をインキュベートします。
7. 2×10 ⁶と同時に、シード足場まで同じ方法に従って幹細胞を標識し、ポジティブコントロールとして均一に播種足場を得るために、磁石なしでインキュベートします。

軟骨細胞への分化4.

注：インキュベーションの4日後、磁石を除去し、ペトリ皿（静的条件）またはバイオリアクター（動的条件）のいずれかで軟骨成熟を続けます。陰性対照サンプルは、TGF-β3なし軟骨形成培地で静的条件下で熟成されます。

1. 静的条件では、同一のシャーレに細胞化スカフォールドまたは凝集体を保ちます。 21日間、1週間に2回軟骨形成培地を変更します。
2. 動的条件下では、バイオリアクターを準備します。
   1. 製造業者のプロトコルに従って適切な長さでシリコーンチューブを切断します。
   2. 500mLの培養チャンバー、チューブ、2ウェイ回転子、及びケージ：すべての材料をオートクレーブ。
   3. 滅菌microbioにバイオリアクター部品を配置論理的な安全ステーション。製造者の指示に従って2ウェイ回転子に、培養室にチューブを接続します。
   4. 注意深く滅菌スパチュラを用いて滅菌ケージに細胞化スカフォールドを移します。ケージ当たり2つの足場を置きます。ケージの準備が整ったら、さらに回転中に移動するからそれらを保つために蓋の針に挿入してください。軟骨形成培地で培養室を記入し、ケージを含む蓋を閉じます。
3. 軟骨形成培地でチューブを埋めるために蠕動ポンプの電源を入れ、気泡を排除します。
4. 配置及びバイオリアクターのモータに充填されたチャンバを固定し、アームのチャンバの両方の回転を制御するコンピュータの電源をオン。
5. アームチャンバの両方に毎分5つの回転（RPM）の回転速度を適用します。細胞化スカフォールドの連続供給のために10回転の流量で、蠕動ポンプを調整します。

5。 RNA抽出および遺伝子発現解析

注：RNA抽出の前に、酵素溶液を用いて足場を消化します。

1. 無血清DMEM培地850 mLにプルラナーゼの100μL（40 U / mL）およびデキストラナーゼの50μLた（60mg / ml）を添加することによって酵素溶液1mLを調製します。
2. 、無血清DMEM培地で2回足場をすすぐメディアを破棄し、足場あたりの酵素液800μLを加えます。穏やかな撹拌下37°Cで15〜30分間インキュベートします。
3. 足場が完全に溶解されたときに、1.5 mLのチューブに細胞を含む溶液を転送する、10分間、300×gで遠心分離、注意深く滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回すすぎ、培地を吸引、遠心分離に300×10分間、G、およびRNA単離溶液で再懸濁細胞。
4. 、凝集体からRNAを抽出し、RNA単離溶液にスフェロイドを配置することと完全RNA抽出を行う前に、ホモジナイザーを使用してそれらをつぶします。
5. 製造業者の説明書に従って全RNA抽出用キットを用いてRNAを単離します。
6. 250 ngのランダムプライマー、dNTP混合物1μL（各10mM）、及び40 U / mLのRNase阻害剤を用いて、製造者の指示に従って逆転写酵素を用いて総RNA 400 ngのから相補的DNAを合成します。反応の最終容量は20μLです。反応の終了時に、100μLの最終体積を得るために、蒸留水80μLを加えます。
7. 定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のために、10倍希釈のcDNAを用いて、そのようなアグリカン（AGC）及びコラーゲンII（COL II）として目的の遺伝子の相対的発現を定量するための蛍光試薬を含むPCRミックスを使用します。参照遺伝子リボソームタンパク質、大、P0（RPLP0）で遺伝子発現のレベルを標準化。 ^ΔΔCT式^- 2で計算を実行、ΔΔCT=ΔCTは、分化状態の場合 - 制御条件のΔCTを意味し、各ΔCTは、目的の遺伝子のCT表す - 参照遺伝子（RPLP0）のCT。
8. 平均（SEM）の標準誤差±平均値などの統計的測定値を決定します。 n個の≥2つの独立した実験と解析を行います。遠心分離し、ペレットおよび磁気融合（* P <0.05）との間に統計的差異を分析するためにスチューデントのt検定を使用してください。分化足場の間の制御足場（* P <0.05）と統計的差異を分析するためにクラスカル・ワリス検定（ANOVAは、ノンパラメトリック一方向）で有意性を決定します。

6.組織学的分析

1. 滅菌1×PBSで細胞化スカフォールドまたは凝集体をすすぎ、室温で1時間10％ホルマリン溶液でそれらを修正し、1×PBSでリンス。
2. PBSを削除し、最適なcuttinでサンプルを埋め込みますG温度化合物（OCT）、及び液体窒素中に浸漬イソペンタン浴でそれらを凍結。 -20°Cでサンプルを保管してください。凝集体または細胞化スカフォールド12ミクロン、8ミクロンの凍結切片を得るために、クライオスタットを用いてサンプルを切断。
3. 2分間0.5％トルイジンブルー溶液を用いて凍結切片を染色し、水道水ですすぎ、100％エタノールで脱水し、トルエンを用いて明らかにし、光学顕微鏡用の封入剤でスライドをマウントします。

結果

まず、凝集体は、個々の幹細胞（ 図2A）を標識した2.5×10 ^5を堆積することにより微小磁石を用いて形成することができます。これらの単一集合体（サイズ〜0.8ミリメートル）は、より大きな構造にシーケンシャル、磁気的に誘導し融合のおかげで融合させることができます。例えば、軟骨成熟の8日目に、凝集体がダブレットを形成するように対?...

ディスカッション

ここで紹介するテクニックは、磁性ナノ粒子の内在化に依存しているため、彼らは、細胞内局在したらまず、一つの重要な問題は、ナノ粒子の結果です。鉄ナノ粒子は、それらのサイズ、コーティング、及び露光¹⁹の時間に応じて潜在的な毒性または障害分化能力^、22をトリガすることができることは事実です。カプセル化された鉄ナノ粒子は、マ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'