細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

要約

この記事では、識別し、細胞内染色によって、マウス腎臓、大動脈およびリンパ節内に存在する機能性Tリンパ球サブセットを定量化し、フローサイトメトリーするための詳細な方法論を提供します。アンジオテンシンII高血圧のモデルは、説明ステップバイステップ、手順、およびフローサイトメトリーの基本的原則及び細胞内染色に選ばれました。

要約

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases^1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension⁶. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention^1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

概要

最近の証拠は、適応免疫系、特にTリンパ球は、いくつかの心血管疾患^1,2,3,4,5の発症に重要な役割を果たしていることを示しています。例えば、アンギオテンシンII誘発性高血圧モデルでは、マウスの血管および腎臓におけるT細胞の蓄積を⁶に記載されています。血管の蓄積は、外膜と血管周囲脂肪に主にあります。腎臓では、T細胞は、髄質及び腎皮質の両方に蓄積します。関与するサブセットに応じて、これらのT細胞は、血管および腎臓の機能に影響を及ぼし、病理の発達をもたらすことができる別のサイトカインを生じる（マクマスターら ⁶で概説）。

その機能と署名インサイトに基づいてTヘルパー1（Th1）、Th2を、TH9、Th17細胞、TH22、T調節（Treg細胞）細胞、およびT濾胞ヘルパー（TFH）細胞：CD4 ⁺ Tヘルパーリンパ球は、複数のサブセットに分割することができますkines ^7。同様に、CD8 ⁺細胞傷害性T細胞はTc1は、Tc2を、TC17またはTC9 ⁸のように分類することができます。ダブルネガティブT細胞（CD4またはCD8 T細胞マーカーを発現しない、すなわち細胞）もあります。これらの細胞のサブセットは、代替ガンマデルタT細胞受容体（の代わりに古典的なαおよびβ受容体）を有し、したがって、ガンマデルタT細胞と呼ばれます。表面マーカー、サイトカインおよび転写因子のフローサイトメトリーによるマルチパラメータ分析は、これらの細胞を同定するための最適なアプローチを構成しています。この方法は、広く免疫学の分野で使用されるが、それはあまり固形臓器および心血管疾患の設定に記載されています。

歴史的には、組織中のリンパ球の同定は、免疫組織化学またはRT-PCRの手法に限定されていました。免疫組織化学および免疫蛍光は、int型の抗原の組織分布を決定するための強力な方法であるが、erest、彼らは表現型関連するサブセットを特定するには不十分です。 RT-PCR分析は、抗原、サイトカインまたは転写因子のmRNA発現を検出するのに有用であるがまた、それは、個々の細胞のレベルで、同時に複数のタンパク質の検出を可能にしません。

サイトカインおよび転写因子を検出するために、細胞内染色と組み合わせて、特にフローサイトメトリーの出現は、固形臓器における免疫細胞サブセットの単一細胞レベルでの同定および定量を可能にする強力な技術を持つ研究者を提供します。私たちは、アンジオテンシンII高血圧のモデルにおけるマウスの腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節内に存在する主要なT細胞サブセットをフローサイトメトリーによって識別するための細胞内染色アッセイを最適化しました。各ステップの最適化：組織消化、ex vivoでの活性化、透過処理、および表面および細胞内染色結果、高度で再他の心血管および腎疾患モデルに適用することができる製造可能検定。

プロトコル

ヴァンダービルト大学の施設内動物管理使用委員会は、本明細書に記載される手順を承認しました。マウスは、飼育し、実験動物の管理と使用に関する指針に従って世話されている（国立アカデミープレス。改訂2010）。

マウスからの大動脈水切りリンパ節、腎臓および大動脈の1の単離

1. CO ₂吸入によりマウスを安楽死させます。 70％エタノールで胸をスプレーし、慎重に心臓を露出するためにハサミで皮膚や胸壁を開きます。
2. 血管系を灌流するには、右心房に小さな切開を行い、着実に21または23 G針を使用して、左心室の頂点に冷PBS（約1ミリリットル/秒）の少なくとも10ミリリットルを注入。すべての臓器は湯通しするまで灌流します。心臓が最初に白く。肝臓の白化は、灌流が十分に行われていることを示しています。
3. 小さな鉗子と細かいハサミを使用して、静かにカットし、腸を引き出し、胃、脾臓、膵臓および肝臓はより良い大動脈を可視化しました。
   注：この手順は、胃腸管の損傷、汚染を誘発することができるように非常に正確に行う必要があります。
4. 切り出し、ハサミで各肺を削除します。無針注射器を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて胸腔をすすぎます。滅菌ガーゼを使用して、余分な血液や体液を削除します。
5. 細かい解剖ピンセットを用いて腹部大動脈流入領域リンパ節を削除してください。カプセルを破裂させないことを確認してください。解剖鉗子で各リンパ節の表面上の残りの脂肪を取り除きます。細かいハサミを持つ2つの腎臓を切り取ります。
6. 罰金、湾曲したハサミで大動脈全体（胸部と腹部大動脈）を解剖。心のレベルで開始し、慎重に離れて食道および大動脈に取り付けられ、周囲の血管周囲脂肪を維持することを確認すること腸骨分岐のレベルまでの椎骨から解剖。
   注：REMOする大動脈のさらなる解剖周囲の構造は、顕微鏡下で行うことができまし。具体的には、動脈枝（頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜、および腎動脈）とリンパ節を削除します。これは多くの炎症細胞が高血圧の設定に存在するサイトであるため、各大動脈の周りの血管周囲脂肪の一貫性のある層を保つようにしてください。冷PBSを含む別々のチューブ内の各組織を置きます。

各組織からの単一細胞懸濁液の2世代

1. 腎臓
   注：腎臓は、機械的解離に加えて、酵素消化を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液中に解離させることができます。
   1. （5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した）RPMI1640培地へのコラゲナーゼD（2mg / ml）を添加し、DNアーゼI（100μg/ mlの）によって腎消化溶液を調製します。腎臓サンプルあたり10ミリリットルを準備します。
   2. 腎臓ダイジェストの10ミリリットルを含む解離チューブに2腎臓を転送するために鉗子を使用して、イオン溶液。
   3. 製造業者の指示に従って、半自動化された解離装置を用いた機械的解離を行います。
   4. 機械的解離後、デバイスからチューブを切り離し、酵素消化を行います。連続回転下37ºCで20分間サンプルをインキュベートします。すぐに、5％FBSを補充した冷たいRPMI 1640培地を加えることによって、酵素消化を停止します。
   5. 40μmのストレーナーを通して濾過した後、50ミリリットルコニカルチューブにピペッティングすることにより溶液を転送します。 1mlシリンジのプランジャーで押して離れて残りの組織をいじめます。細胞（500×gで、8分、4ºC）をペレット化。
   6. 36％の密度勾配遠心分離媒体を3mlの中にペレットを再懸濁します。 15ミリリットルコニカルチューブにサスペンションを転送します。静かに中断することなく、3ミリリットル36％の細胞懸濁液の下に72％密度勾配遠心分離培地の3ミリリットルを追加します。遠心分離（ブレーキなし千×gで、20分、4℃）。
   7. 免疫細胞は、界面に位置します。細胞破片を含む最上位の黄色がかった層を除去した後、冷PBSを使用して15ミリリットルにボリュームを起動します。内訳によく勾配を振ります。細胞（300×gで、8分、4℃）をスピンし、5％FBSを含むRPMI 3mlにペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。
2. 大動脈
   1. （5％FBSを補充した）RPMI1640培地へのコラゲナーゼA（1mg / mlの）、コラゲナーゼB（1 mg / mlで）、およびDNアーゼI（100μg/ ml）を添加することによって、大動脈消化溶液を調製します。
   2. 微細な鉗子を使用して、大動脈消化溶液1 mlを含む2mLの管に大動脈を移します。 1ミリリットル消化液中の微細なハサミで非常に小さな断片に全体の大動脈をみじん切りに。氷の上に保管してください。連続回転下、37℃で30分間、サンプルをインキュベートします。
   3. 組織培養皿にソリューションを移し、enzymaを停止5％FBSで5回コールドRPMIのボリュームを追加することによってチック消化。
   4. 40μmのストレーナーを通して濾過した後、50ミリリットルコニカルチューブにピペッティングすることにより溶液を転送します。 1mlシリンジのプランジャーで押すことにより、単一細胞懸濁液に離れて残りの組織をいじめます。ストレーナーをフラッシュし、細胞（300×gで、8分、4ºC）をペレット化。
   5. 5％FBSを含むRPMIの10ミリリットルを追加することにより、ペレットを洗浄。細胞（300×gで、8分、4℃）をスピンし、5％FBSを含むRPMI 3mlにペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。
3. 大動脈流入領域リンパ節
   1. 組織培養皿（60ミリメートル×15 mm）の中で40μmのストレーナーを配置します。ストレーナ上のリンパ節を配置し、1mlシリンジのプランジャーで押すことにより、単一細胞懸濁液中にそれらを離れていじめます。 5％FBSを含むRPMIの2ミリリットルでストレーナーを洗浄します。シャーレ内の細胞を収集します。
   2. 移転15ミリリットルファルコンチューブに細胞と細胞（300×gで、8分、4ºC）をペレット化。 5％FBSを含むRPMI500μlのペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。

フローサイトメトリーによるサイトカイン検出のため3. 生体外刺激

1. 5％FBS、非必須アミノ酸、0.1ミリモル、50μMのβメルカプトエタノールおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI：細胞培養培地を準備します。
2. 遠心分離機腎臓、大動脈およびリンパ節（300×gで8分間、4ºC）から得られた各細胞懸濁液。 1mlあたり1×10 ⁶細胞の濃度で細胞培養培地で各ペレットを再懸濁します。
3. 細胞培養の1個毎mlのため（ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、カルシウムイオノフォアのイオノマイシンを含む、およびゴルジ阻害剤ブレフェルジンA）細胞活性化カクテルを2μlを加えることによって細胞を刺激します。
   注：最終濃度各コンポーネントのsがある：PMAおよびイオノマイシンとPMAの81 nMの、イオノマイシンの1.33μMおよびブレフェルジンA.治療を5μg/ mlのは、サイトカインを産生する細胞を活性化します。サイトカインは、検出される細胞内で捕捉されなければならない分泌タンパク質です。ブレフェルジンAは、小胞体とゴルジ装置で正常に分泌タンパク質の蓄積を引き起こします。したがって、ここで説明する技術は、フローサイトメトリーによるサイトカイン産生リンパ球の検出能を向上させます。
4. 12ウェル2万個の細胞（大動脈または腎臓）または24ウェル（リンパ節）、低付着プレートにプレート1。 3時間、37℃の加湿CO ₂インキュベーターでプレートを置きます。
   注：播種した細胞の数は、対照マウスからのリンパ節に低くてもよいです。また、刺激の時間は、実験的に研究された各細胞集団とサイトカインのために決定されなければなりません。大動脈、腎臓またはリンパ節から単離されたT細胞のケースでは、3〜4時間の刺激をお勧めします。長く刺激ワット病気のサイトカイン分泌を増大させ、CD3、CD4およびCD8のようないくつかのT細胞表面マーカーのさらなるダウンレギュレーションを誘導するわけではありません。 （でも、3-4時間の刺激はこれらのマーカーのいくつかのダウンレギュレーションを誘導することに注意してください。）

4.表面染色

1. ポリスチレンFACSチューブ遠心（300×gで、8分、4℃）に細胞を移します。 （FACS緩衝液で2回（ ^の Ca ²⁺およびMg ⁺フリーPBS 4％FBS及び2mMのEDTAを含む）に細胞を洗浄し、所望の抗体パネルの数と必要な制御管の数に基づいて、異なるFACSチューブに均等に細胞懸濁液を分割下記参照）。
2. 各パネルの補償を行うために、各組織型および抗体パネルのために染色していない対照チューブと、単一の染色されたチューブを準備します。また、全てが、抗体の一つを添加することにより、各抗体パネルの蛍光マイナス1（FMO）対照チューブを準備します。
3. FACSで2ミリリットルに各チューブの音量を調整しますバッファ。遠心分離機は、細胞懸濁液（300×gで、8分、4℃）、氷上で10分間万個の細胞あたりの抗CD16 / CD32抗体0.5μgので細胞をインキュベートすることにより上清とブロックのFc受容体を除去します。
   注：CD16は、低親和性のIgG Fc受容体III（FcRでIII）であり、CD32は、FcRでIIです。 CD16 / CD32は、顆粒球、マスト細胞、単球/マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、B細胞、樹状細胞およびいくつかの活性化された成熟したT細胞上で発現されます。
4. 生存性染色を実行します。1×PBS 1,000μlの1×PBS、遠心分離（300×gで、8分、4℃）し、再懸濁して細胞を洗浄。細胞非透過性アミン反応性色素（生存能力染色）の1μLを加えます。光から保護して4℃で15分間インキュベートします。
5. インキュベーションの間、FACS緩衝液の適切な量で（表面染色のための）抗体のカクテルを用意。 FACS緩衝液1-2 mlの細胞を2回洗浄し、遠心分離（300×gで、8分、4℃）し、100μlの各ペレットを再懸濁抗体混合物。光から保護して4℃で30分間インキュベートします。
   注：抗体サイトメトリー各フローのために、用量滴定曲線を実行することによって、必要とされる抗体の最適量を決定するために有用です。
6. 細胞（300×gで、8分、4℃）をFACS緩衝液2mlで細胞を2回洗浄し、ペレット。

5.固定、透過処理および細胞内染色

1. 製造元の指示に従うことによって、適切な緩衝液を含む固定および透過処理キットで細胞内染色を実行します。適切なバッファに再懸濁することにより細胞を固定し、透過処理。光から保護して4℃で40分間サンプルをインキュベートします。
2. 1倍の透過性の1ミリリットルを追加し、固定し、透過性細胞に直接洗浄緩衝液。遠心分離（500×gで、8分、4℃）、上清を除去します。 1×洗浄緩衝液2mlでペレットを再懸濁します。
3. antibの混合物を準備します1×洗浄バッファー（チューブあたり通常100μl）を、適切な体積でodies（細胞内染色の場合のみ）。
   注：上記のように、最適な抗体濃度は、パネル中の各抗体について決定する必要があります。例えば、IL-17AまたはIL-17Fに対する抗体について、私たちは、1：30の希釈率を使用しますが、IFNγとのT-betに対する抗体について、我々は1の希釈係数を使用します。100。
4. 細胞を遠心（500×gで、8分、4℃）および抗体混合物100μlの各ペレットを再懸濁。光から保護して4℃で40分間インキュベートします。
5. 細胞（500×gで、8分、4℃）を1×洗浄緩衝液2mlで細胞を2回洗浄し、ペレット。 1×300μlの洗浄緩衝液でペレットを再懸濁し、適切なフィルタを用いて、フローサイトメーターで分析します。
6. 組織サンプルあたりの細胞の総数の定量化のために、計数ビーズを使用します。買収に先立ち、各チューブに計数ビーズの推奨量/数を追加します。

6.報酬、ゲーティング、正規化、およびヒント

1. 補償とゲーティング
   1. スペクトルの重なりを調整するための補償のために染色されていないと、単一の染色された対照試験管を実行します。
      注：補償ビーズではなく、セルベースの報酬コントロールの使用は、試料中の対象または細胞集団の抗原が補償用いて、細胞は困難であろうこのような低レベルで存在する場合に必要です。タンデム染料を使用した場合、タンデム色素がロットロットにし、毎日で変わるので、またノートの、各実験のための補償を準備することをお勧めします。
   2. 新しい多色実験を開始するときに、蛍光マイナスパネル内のすべてのフルオロフォアのための1つのコントロール（のFMO）を実行します。
      注：FMOのコントロールは、1以外のパネルですべての抗体を含むサンプルです。これらのコントロールは正しくadjusに省略抗体のための負のシグナル対正の正確な識別を可能にしますゲートをtは。これらのコントロールは、発現レベルは、標的集団の分離が悪い場合、または（例えば、標的は、サイトカインまたは転写因子である）、低い場合に特に重要です。必ずしも必要ではないが、いくつかの場合において、アイソタイプ対照は、FMOの代わりに好まれ得るそれらは抗原の特異性なし抗体アイソタイプとフルオロフォアコンジュゲートのための適切な補償を提供するように制御します。
   3. 第一のゲートを設定します。白血球集団を検出するために、前方散乱面積（FSC-A）および側方散乱エリア（SSC-A）の電圧を調整します。
   4. 死細胞を除外します。
      注：生存率汚れが表面と細胞の内部の両方に存在する遊離のアミンと反応します。細胞を生きるとは対照的に、（損なわれた膜を有する）死んだ細胞は、タンパク質標識の量を増加させる、色素が細胞質に入ることを可能にします。このように、死んだ細胞が容易に識別を可能にする生きた細胞よりも明るくなります。ライブ上のゲート細胞。
      注：大動脈および腎臓からの細胞懸濁液の生存率は、追加の消化工程にリンパ節からの細胞懸濁液の生存率よりも低くてもよいです。
   5. プロット前方散乱面積（FSC-A）[Y軸]と前方散乱高さ（FSC-H）[x軸]。シングレットは、このドットプロット上の対角線として表示されます。ダブレットを除外するには、この対角線上のゲート。そして、SSC-【y軸]およびCD45 [x軸]をプロットします。
   6. CD45 ⁺白血球集団を容易に識別することができます。この集団上のゲート。その後の集団は、この集団から識別することができます。
2. 細胞数の正常化
   1. カウントビーズは、低FSCおよび高いSSCになる特性を有しています。 50,000ビーズを単一細胞懸濁液を300μlに添加する場合、例えば、以下のように、チューブあたり任意の所与の細胞型の絶対数を計算するための式です。
      細胞数p計数した細胞の小胞体管=（フローサイトメーターによって計数ビーズの50,000 /数）x個。
      この計算を使用して、チューブ当たり任意の細胞型の絶対数を決定することができます。各器官から生成されたどのように多くのチューブに基づいて、器官あたりの細胞数を算出することができます。
      注：プロトコル中4℃で全ての細胞および試薬を保管してください。それは、細胞に損傷を与えることができるので、激しくボルテックスを避けてください。細胞をペレットに最小限の力を使用してください。それは、細胞死を沈殿させることができるため、FACSチューブに気泡を避けます。ペレットは、いつでも乾くせてはいけません。

結果

プロトコルは、許可をアンジオテンシンII誘発性高血圧モデルにおいて、マウス腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節から単離したT細胞における表面および細胞内マーカーの同定を記載しました。代表的な結果を以下に示します。

図1は、高血圧を誘導するために、アンジオテンシンIIを注入したWTマウ...

ディスカッション

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue⁹. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	ROCHE	11088882001
Collagenase A	ROCHE	10103586001
Collagenase B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1x Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
DPBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A)	Biolegend	423303
anti-CD16/32	eBioscience	14-0161-81	dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
Transcription factor buffer set	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)	BioLegend	100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8)	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (clone 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)	BioLegend	644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2)	BD Biosciences	557724