ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

要約

ここで、我々は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来の神経細胞の可視化を可能にモザイク標識技術のためのプロトコルを提示します。これは、出生付き合っ個々のニューロンを、異なる個体の同じ神経細胞に遺伝子機能を研究する能力を持つ神経系統解析を容易にします。

要約

Mは、r の epressible Cのエルのメートルの arker（MARCM）でnalysisをosaic広く複雑な形態を描写する、そうでなければマークされていないと非摂動内のニューロンのサブセットにおける遺伝子の機能を操作するために、ショウジョウバエの神経生物学の研究に適用されている正のモザイク標識システムです生物。 MARCMシステムで生成された遺伝的モザイクは、有糸分裂中にマーク（MARCMクローン）とマークされていない娘細胞の両方を生成する前駆細胞を分割内の相同染色体間の部位特異的組換えを介して媒介されます。ツインスポットMARCM（tsMARCM）と呼ばれるMARCM法の拡張は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来ツイン細胞の両方にラベルを付けます。この技術は、両方の半系統から有用な情報の検索を可能にするために開発されました。総合tsMARCMクローンの異なるペアを分析することによって、tsMARCMシステムは、高解像度の神経系統マッピンを可能Gは共通の前駆細胞から産生される標識されたニューロンの正確な出生順序を明らかにする。また、tsMARCMシステムは、異なる動物の同一ニューロンの表現型分析を可能にすることにより、遺伝子機能研究を拡張します。ここでは、 ショウジョウバエの神経発達の研究を促進するためにtsMARCMシステムを適用する方法を説明します。

概要

ニューロンの膨大な数と多様な種類からなる脳は、プロセスを知覚し、外界からのチャレンジに応答する能力を有する動物を付与します。成体ショウジョウバエ中央脳のニューロンは開発^1,2中、神経芽細胞（NBS）と呼ばれる神経幹細胞の限られた数から導出されます。 ショウジョウバエでは、脳の神経新生に関与するのNBのほとんどは、（ニューロン³に分化する2つの娘細胞を生成するために部門の別のラウンドを通過した後、自己再生のNBと神経節母細胞（GMCS）、およびGMCSを生成するために、非対称分裂を起こし、図1A ）。そのため神経形態の複雑さや特定のニューロンを識別するに伴う課題の、正のモザイクラベリング技術、抑制性細胞マーカー（MARCM）とのモザイク解析は、visualizatを有効にするために発明されました単一ニューロンまたは周囲の、非標識ニューロン⁴の人口のうち、ニューロンの小さなサブセットのイオン。

MARCMはフリッパーゼ（FLP）の発現通常レポーター遺伝子⁴の発現を阻害するリプレッサー遺伝子のヘテロ接合性対立遺伝子を保有する分割前駆細胞内で相同染色体間の部位特異的組換えを媒介する/ FLP認識標的（FRT）システムを利用します。有糸分裂後、組換え染色体が1つのセルはリプレッサー遺伝子のホモ接合対立遺伝子を含まず、他のセルは全く抑制遺伝子-そのセル内のレポーターの発現（とその子孫）はもはやいないように、ツインセルに分離されています^4を遮断^しました 。三つのクローンのパターンFLPが確率的のNBまたはGMCSに誘導されるとき、通常MARCM実験で発見さ：単細胞resolutioで神経形態を示している単一セルおよび2セル-GMCクローン、nと、共通のNB（ 図1B）由来のニューロンの全体の形態学的なパターンを明らかに多細胞-NBクローン、。 MARCM技術が広く脳全体の配線ネットワークを再構成するための神経細胞タイプ識別を含め、 ショウジョウバエ神経生物学の研究に適用されている、神経系統は、ニューロン、細胞運命の仕様に関与する遺伝子の機能の表現型の特徴の発達史を開示するための分析、および神経細胞の形態形成分化研究^{5、6、7、8、9、10。}従来MARCMのみ誘発される有糸分裂組換え事象の後に2つの娘細胞（および系統）のいずれかをラベルするので、マークされていない側からの潜在的に有用な情報が失われます。この制限は、基本的なMの適用を排除します高解像度にARCMシステムは、高速テンポで細胞の運命を切り替える多くの神経系統の解析や精度に異なる動物^11、12の同一の神経細胞に遺伝子機能の解析します。

ツインスポットMARCM（tsMARCM）が（そのため、元のMARCMシステム¹¹の限界を克服し、ツインセルの両側から有用な情報の回復を可能にする二つの異なる色で共通の前駆細胞に由来する神経細胞を標識する高度なシステムであり、 図2A - 2C）。 tsMARCMシステムでは、2つのRNA干渉（RNAi）は、抑制が前駆細胞中の相同染色体のトランスサイトに位置しているベース、及びそれらの抑制の発現は、独立して、それぞれのレポーター（ 図2B）の発現を阻害します。 FLP / FRT系を介して媒介部位特異的な有糸分裂組換えに続いて、TWなっOのRNAiベースの抑制は、異なるレポーター（ 図2B）の発現を可能にするために、ツインセルに分離しました。二つのクローンのパターンは、多細胞-NBクローンに関連付けられた単一細胞クローン及び2セル-GMCに関連付けられた単一細胞は、典型的にtsMARCM実験（ 図2C）に見られます。情報は、出生付き合っラベルされたニューロンなどの神経系統解析高解像度を可能にする、他の側面のための基準として利用することができるツインセルの一方の側に由来し、そして表現型は、正確な調査のために別の動物で同じニューロンの解析します神経遺伝子機能^11、12。ここで、我々は（該当する場合だけでなく、他の組織の開発）、ショウジョウバエにおける神経発達の学業を広げるために、他の研究室で使用することができますtsMARCM実験を、実施方法を説明したステップバイステップのプロトコルを提示します。

プロトコル

1.必要なトランスジーン^11、13を使用してtsMARCM対応ハエを構築

1. 個々のハエ¹¹によって運ばれた導入遺伝子からtsMARCM対応ハエの元のバージョンを生成します（ 表1参照）。同じフライ株式¹³で複数の導入遺伝子を置くことによって、以前に記載されている標準的なフライ遺伝的交叉スキームを実施しています。
   1. 1親系統では、FRT ^{40A、UAS-mCD8} :: GFP（第一のレポーター、mCD8 :: GFPの導入遺伝子を組み立て、導入遺伝子の発現が膜係留レポーターを生成する上流活性化配列プロモーターの制御下にありますラットクラスタoの発現に対するRNAiを、緑色蛍光タンパク質と融合させ分化8タンパク質）のマウスクラスター、およびUAS-rCD2RNAi（第二のレポーターの発現を抑制する抑制の2 ^番目の染色体の左腕にF分化2、RCD2）。場所 Xまたは3 ^番目の染色体上の組織特異的-GAL4ドライバ 、可能であれば。
   2. 他の親系統では、UAS-RCD2を FRT ^40Aの導入遺伝子を組み立てる:: RFP（第二のレポーター、RCD2 :: RFP;赤色蛍光タンパク質と融合RCD2のタンパク質からなる他の膜係留レポーター）、およびUAS-GFPRNAi （mCD8 :: GFPの発現を抑制する抑制剤; GFPの発現に対するRNAi）2 ^番目の染色体の左腕に。可能な場合は、Xまたは3 ^番目の染色体上の熱ショック（HS）-FLPまたは組織specific- FLPを置きます 。
2. 個々のハエ¹⁴によって運ばれた導入遺伝子からtsMARCM対応ハエの新バージョンを生成します（ 表1参照）。 Pが記載されている標準的なフライ遺伝交叉方式を行いますreviously、同じフライ株式¹³で複数の導入遺伝子を置くことによって。
   1. 1親系統では、同じ腕で一緒にFRT部位とUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i（mCD8 :: GFPとRCD2の発現:: RFPを抑制するサプレッサーの組み合わせ導入遺伝子）の導入遺伝子を組み立てます2 ^番目または3 ^番目の染色体（FRTとUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2iの導入遺伝子の適切なペアは、表1に示されています）。可能な場合、選択されたFRT部位の染色体以外の染色体上の組織特異的-GAL4ドライバーを置きます。
   2. 他の親系統では、同じ腕にFRT部位の導入遺伝子およびUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi（RCD2の他の組み合わせ、導入遺伝子:: RFPとmCD8の発現を抑制するサプレッサー:: GFP）を構築FRTの導入遺伝子の2 ^番目または3 ^番目の染色体（適切なペアのとUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi）を 表1に示します。選択されたFRT部位の染色体以外の染色体上に置き、HS-FLPまたは組織特異的-FLP、可能であれば。

2.クロスtsMARCM対応はその子孫にtsMARCMクローンを生成するためのハエ

1. クロスtsMARCM対応ハエ一緒には新鮮で、フライ食品のバイアル中で（ 例えば、処女雌が一緒にステップ1.1.2または1.2.2から飛ぶステップ1.1.1または1.2.1から10-15男性のハエを入れて、20〜30）バイアルの壁にメイド酵母ペースト。
2. 受精卵を収集する前に、相手のチャンスを高めるために、2日間25℃で交差tsMARCM対応ハエを維持します。
3. 頻繁に（ハエを下にタップするか、転送を容易にするために、ハエを麻酔するために二酸化炭素を使用混雑を避けるためにたてyeastedバイアルに交差tsMARCM対応ハエを転送;経由で10 mLのフライ食品にこれ以上80-100より受精卵を保ちますあまりにも多くの孵化した幼虫を回避するリットル）。
4. 培養tsMARCM動物（ すなわち、受精卵、tsMARCM動物の遺伝子型の例を、 図3で使用される、HS-FLP ^[22]、w / wであり; UAS-mCD8 :: GFP、UAS-rCD2RNAi、FRT ^40A 、GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP、UAS-GFPRNAi、FRT ^40A; +;それらが所望の段階（ 例えば、胚、幼虫に発展するまで25℃でシリアル転送バイアルに敷設されています+）、または蛹）。
5. 生成するためにFLPの発現を誘導する熱ショックの最適な時間を決定するために、転送10を37℃の水浴に同じ発達段階にtsMARCM動物を含むバイアル、20、30、40、及び50分置き関心のtsMARCMクローン。この設定の理由は、以前に¹⁵に記載されている。組織specific- FLPは、神経系統解析のために（HS-FLPが好ましいtsMARCM実験で使用されている場合は、このステップをスキップ）。
   注：関心のよりtsMARCMクローンが望まれている場合には、将来tsMARCM実験における熱ショックの最適な時間を使って繰り返し手順2.5。一般に、より多くのFLP発現は、HS-FLP ^[1]と同じ熱ショック時間のと比較して、HS-FLP ^[22]において誘導されます。
6. 文化は、彼らが25℃で熱ショックを受けtsMARCM動物を適切な発達段階に達し、その後、ステップ3に進んできたまで。

tsMARCMクローンを含む3.準備し、ステイン、マウントフライブレインズ

1. 鉗子保護料理を準備します。活性炭（0.25グラム）とシリコーンエラストマーキットのA部（30グラム）とパートB（3グラム）を混ぜます。適切な皿に混合物を注ぎます。
2. 解剖顕微鏡を通して見た鉗子保護皿に鉗子を使用して、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でtsMARCM動物のうち、幼虫、さなぎ、または成体の脳を解剖。注：フライ脳の解剖のためのプロトコルは、DESCされています以前に¹⁶ ribed。
3. 1×PBSで20分間室温で4％ホルムアルデヒドを含有するガラススポットプレート中のハエの脳を修正しました。手順の残りの部分については、このガラススポットプレートにハエの脳を処理します。
4. PBTを削除し、：;洗っPBTを削除し、すぐに新しいPBTを追加します（すすぎ1％PBT（1％トリトンX-100を含む1×PBS）でハエの脳を3回洗浄し、1％のPBTで30分間ずつ、それらを3回洗浄新しいPBTを追加し、オービタルシェーカーを使用して新しいPBTでハエの脳を）インキュベートします。
5. 4℃で一晩または室温で4時間、一次抗体の混合物とハエの脳をインキュベートします。 1％のPBTを含有する中、マウス抗Bruchpilot（BRP）抗体（1：50）、ウサギ抗DsRedの抗体（800 1）：一次抗体の混合物の例は、ラット抗CD8抗体（100 1）は5％正常ヤギ血清（NGS）。
6. ハエの脳1％のPBTで三回すすぎ、次いで1％のPBT、30分ごとに、それらを3回洗浄します。
7. は4℃で一晩または室温で4時間二次抗体の混合物でハエの脳をインキュベートします。 、黄色蛍光色素（1：800）と結合したヤギ抗ウサギIgG抗体、ヤギ抗マウス：二次抗体の混合物の例は、緑色蛍光色素（800 1）とコンジュゲートしたヤギ抗ラットIgG抗体でありますNGS 5％を含む1％PBTで：（800 1）IgG抗体は、遠赤蛍光色素と結合しました。
8. ハエの脳1％のPBTで三回すすぎ、次いで1％のPBT、30分ごとに、それらを3回洗浄します。抗消光試薬とマイクロスライド上にマウントします。ハエの脳を覆って保護するために、マイクロスライド上にマイクロカバーガラスを置きます。明確なマニキュアを用いたマイクロカバーガラスとマイクロスライドの端をシールします。これらが搭載され、4℃で脳標本を飛ぶ密封して保管してください。

4.プロセスを取り、tsMARCMクローンの蛍光画像を分析

1. tsMARCMクローンfrの蛍光画像をキャプチャ選択の共焦点顕微鏡システムを用いて、ステップ3.8で作成したサンプルをOM。
2. 3E、3G - - 3J、3L - 3O、 と3Q -平坦化の例については、3T tsMARCM共焦点蛍光画像のプロジェクトスタック2次元には、（ 図3Bを参照してください選択した共焦点顕微鏡システムに付属の画像処理ソフトウェアを使用して画像を平坦化共焦点蛍光画像）。
3. ImageJの¹⁷で適切な画像処理ソフトウェア（ 例えば、「セルカウンター」機能を使用してtsMARCMクローンの多細胞-NB側の細胞数をカウントし、 図3E、3J、3O、およびセルの例については、3Tを参照してください。ニューロンの遺体）。

結果

tsMARCMシステムは、共通のNBから誘導された神経細胞の重要な情報を検索することによって、神経系統解析および遺伝子機能の研究を容易にするために使用されてきました。このシステムは、神経細胞の種類（すべてではない）、ほとんどの識別各神経型の細胞数を決定し、にtsMARCMを使用してこれらのニューロンの出生順序

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

1.1.1、1.2.1、2.3、2.5、および3.2は良いtsMARCM結果を得るために重要であるステップ。神経前駆細胞にGAL4を発現していない組織特異的-GAL4ドライバはステップ1.1.1および1.2.1のために好ましいです。ステップ2.3で、フライ食品のバイアル中で増殖させた動物を過剰混雑は避けてください。誘導待ち時間、熱ショック時にFLPの発現レベル、お?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones