ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

要約

脂肪体は昆虫の中央代謝臓器です。様々 な刺激に対する分離脂肪体組織の反応を研究することができます本物のオルガン文化システムを提案します。

要約

昆虫の体脂肪は、虫の代謝と栄養貯蔵、肝臓と脊椎動物の脂肪質のティッシュの機能をミラーリングで中心的な役割を果たしています。昆虫の体の脂肪組織は通常昆虫の体全体に分散されます。ただし、しばしば腹部に集中して、腹部の体壁に接続されています。

蚊脂肪体は、卵の生産のために重大である卵黄タンパク質の唯一のソースです。したがって、蚊脂肪体組織の体外培養は蚊生理学研究のための重要なシステムを表す新陳代謝および、最終的に、卵の生産。脂肪体文化プロセス ソリューションおよび試薬、アミノ酸原液、ヒトスジシマカ生理食塩水塩原液 (AP)、カルシウム原液、脂肪体の培養培地などの準備から始まります。脂肪体解剖、実験的治療の順に処理が進みます。治療後、RNA シーケンス (Seq RNA)、qPCR、西部のしみ、プロテオミクス、メタボロミクスなど、さまざまな異なる分析を実行できます。

例実験、黄熱の蚊、ネッタイシマカ、アルボ ウイルス デング熱、チクングニア、ジカなどの主なベクトルから切除と脂肪体の文化を通じてプロトコルを示す.リポタンパクリパーゼ卵黄タンパク質と対照する知られている生理学的条件下で培養した脂肪体からの RNA は、遺伝子発現の調査のこのプロシージャの潜在的な有用性を示す RNA シーケンス分析の対象となった。

概要

蚊は、マラリア、デング熱、チクングニア、ジカ^1,2,3などの壊滅的な人間の病気のベクトルであります。これらの疾患を抑制するためと病気送信蚊の個体数を制御する強烈な国際努力にもかかわらず蚊媒介疾患の流行の発生がまだ一般的、とりわけ途上国における。多くのこれらの病気に対する効果的なワクチンが利用できなくまたは限られた有効性^4、5の。感染を防ぐ最も効果的な方法は、殺虫剤トリートメントを使用して主に、蚊の個体数を制御することです。ただし、殺虫剤抵抗性蚊個体群の多くで開発し、世界^6,7,8のまわりの共通の問題になります。蚊の生理学の研究は、新規ツールおよび病気を制御するための戦略の開発に不可欠です。

蚊の脂肪体は、栄養貯蔵、代謝恒常性、複製、および異物の異化^9,10、11,12で中心的な役割を果たしています。それはトリグリセリド、グリコーゲン貯蔵タンパク質の中のアミノ酸の主なストレージ臓器です。それはまたほとんどの体液蛋白質および代謝産物の合成の場所として機能します。蚊の脂肪体は女性で彼らは血食事^13,14を取る後に発生卵黄蛋白質の生産の唯一のソースです。

脂肪体の主たる細胞型、大型、倍数体の trophocyte または脂肪^3,9,10,12です。脂肪体組織は葉や葉鞘に編成し、脂肪体の大きな葉が腹部の体壁に接続されている、腹部に位置する最大の部分と、蚊のすべての体の部分で見つけることができます。

ここで示した蚊脂肪体文化システムを 70 年代に開発し、脂肪体生理学¹⁰、特に現在の解析技術との組み合わせを研究するための強力なツールのまま。この手法の基礎は、腹部の体壁と関連付けられた脂肪体組織の分離に基づいています。腹部のキューティクルの疎水性と、没頭して腹部の脂肪体の添付の葉と培養液の表面に浮くされます。培養組織の酸素化の確保、気門および tracheolar 構造が保持されます。今後、我々 がこれらの準備を「脂肪体」として参照してください。分離脂肪体 (未発表結果) 適切な培地で培養したときに 12 時間以上実行可能に残る。脂肪体の文化はさまざまな脂肪体内分泌生理学^{9,10,12,15,16、に関する質問を対処している貴重なツール 17}。

培養脂肪体は様々 な実験的に受けることができ、治療のタイミングは、決定は、捜査官を制御します。脂肪体の収集し、qPCR^16,17,18,19, ウエスタンブロット^{18 を含む下流の解析処理潜伏期間の終わりに、、20}、プロテオミクス²¹、またはメタボロミクス²²。実験は、一緒に培養することができます何百ものグループに個々 の脂肪体から、さまざまなスケールで実行できます。

ここに含まれる代表的な結果は、アミノ酸および濾胞^{16,17、血液の食事活性化をシミュレートするためにステロイド ホルモン 20-ヒドロキシ脱皮ホルモンの存在下で培養した脂肪体から派生しました。 23,24}。私たちは分析し、次世代シーケンス解析を介して活性化脂肪体対ないアクティブの差動遺伝子発現を比較しました。

プロトコル

1 ですソリューションと試薬の準備

1. アミノ酸原液
   1. 準備 4 X アミノ酸原液 ^{23 , 24} の重さによって、。表 1 の濃度によると三角フラスコに 20 種類のアミノ酸を追加します
      。 注: いくつかのケースで amino acid(s) ソリューションから除外でき等しい浸透圧物質濃度を維持するためにマンニトールのモル同量に置き換えられます
   。
   2. DdH ₂ O ソリューションの適切なボリュームを生成するための適切な量を追加します
   。 アミノ酸が完全に溶解していることは、確実に
   3. 熱液体が完全にクリアされるまで継続的に攪拌しながら優しく; わずかな黄色の色合いにかかります
      。 注: 解散するより疎水性アミノ酸のいくつかを許可するように塩酸を追加することによって pH を 6 に削減が必要になる場合があります
   。
   4. ソリューションの約数と滅菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズ
   。
   5. -20 ° C まで 6 ヶ月間で密封された容器でストア
   。
2. AP
   注: ²⁵ を参照してください。
   1. 20 X の原液を塩、水 50 mL で 表 2 に示す塩を組み合わせます。完全に溶解するまで攪拌します
      。 注: 少し熱塩を完全に解消するソリューションが必要になる場合があります
   。
   2. 無菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズと-20 で 50 mL のチューブで、ソリューションを格納 ° C
3. カルシウム原液
   1. カルシウム原液 X 50、100 mL の水 (表 3) に塩化カルシウムの 0.90 g を追加; 完全に溶解するまで攪拌します
   。
   2. 注射器を用いた無菌フィルター 50 mL チューブに分注 0.2 μ m の細孔径を持つソリューションをフィルターや-20 デパート ° C
4. Tris バッファー (pH 7.4)
   1. 、トリス バッファー、塩と 表 4 のソリューションを組み合わせて、ddH ₂ O を追加 100 mL.
   2. 注射器を用いた無菌フィルター フィルター 0.2 μ m の気孔のサイズそして因数のソリューション 50 mL チューブに; 常温で保存します
   。
5. 脂肪体培
   1. 脂肪体の培養培地を準備する上記のすべてのソリューションを準備します
   。
   2. 表 5 脂肪体培地 200 mL にボリュームに従ってそれらを結合します
   。
   3. 7.2 水酸化ナトリウムや塩酸を使用して pH を調整します
   。
   4. 無菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズ ソリューションです
   。
   5. 15 ml にソリューションを分割し、-20 ° C で 6 ヶ月保存します
   。

2。郭清の準備

1. 照明顕微鏡 (10-20 倍の倍率) を準備し、2 つの極細ピンセットと顕微解剖はさみのペアを置く
。
2. は、実験に必要なすべてのソリューションを準備します。部屋の温度に脂肪体培養液を解凍
   。 注: 沈殿は優しくない 30 以上にソリューションを加熱することによって解散することができます ° C
3. ヒメアリ、雌成虫蚊 (出現後 3-7 日) を収集し、それらの麻酔二酸化炭素または氷を使用して
   注: 一度麻酔、蚊べき CO ₂ の下で最短の時間で可能であれば、代わりに 20 分を超えない、蚊が氷の上に麻酔され約 30 分の
4. 3 ml の APS の井戸あたり 6 ウェル プレートを準備します
。

3。脂肪体解剖

1. 解剖顕微鏡の焦点を当てるし、快適な高さに椅子を合わせる
。
2. 顕微鏡表面に凹顕微鏡スライドを配置し、中心に AP の 2 滴を追加します
。
3. 、鉗子を使用して足を蚊をピックアップし、顕微鏡スライドの APS の表面にそれを転送します
。
4. 慎重に左の手でピンセットで胸郭によって蚊をグリップし、腹側、上向きに蚊を回転します
。
5. 胸郭によって安定した体を保持している間、右手の鉗子で最後の 2 つの腹部のセグメントをつかみ、注意深く引き出します
   。 注: 最後の 2 つの腹部のセグメント腹部からと添付の卵巣、キイロショウジョウバエマルピギー細管、後腸、中腸; 分離されます。時々、作物は、腹部からスライドされます。彼らが削除されていない場合作成された小さな穴に鉗子の閉鎖のヒントを挿入し、残りの組織を削除します
。
6. は、右の鉗子を脇、春はさみを拾います。胸部下のセグメントまでの腹部の穴に 1 つのブレードをスライドさせます。優しくかつ腹部に縦にカットします
   。 注: カットがなされたら、腹部だすべき外側に展開、これはすぐに発生可能性があります
。
7. 横カットは、胸郭の下や最初のカットが終了した位置より少し下になります 2 番目のカットをすることを続行します
   。 注: 腹部必要があります開くし、キューティクルと AP 内側浸漬脂肪体、胸部から切り離して考えます。、この腹部の体壁は 生体外で 文化のための脂肪体準備します
。
8. は組の鉗子の先端を使用して、APS ソリューションから脂肪体を持ち上げ、ソリューションから室温で AP を含む 6 ウェル プレートに転送。脂肪体文化に進む前に約 0.5 時間の残りの部分にティッシュを許可します
。

4。脂肪体文化

1. それらを平衡に少なくとも 0.5 h の室温での AP の脂肪体をインキュベートします
。
2. は、鉗子の先端を使用して脂肪体を転送し、優しくそれらを APS ソリューション持ち上げます。脂肪体培地に先端を下げる
   。 注: 脂肪体に媒体の表面上を開き、自由に浮かぶ。脂肪体の文化は、通常、各ウェル中の 150-200 μ L での 96 ウェル プレートで行います。1 つも、3 つまでの個々 の脂肪体を合うことができるし、彼らが 12 時間以上 (未発表の個人的な結果) の実行が可能です
。
3. 潜伏期間後脂肪体を培地からダウン ストリーム処理のための適切な試薬を含む 1.5 mL 遠心チューブに転送します
   。 注: 典型的な分析を含む qPCR ^{16 , 17 , 18 , 19}, ウエスタンブロット ^{18 ,}メタボロミクス ^{22 21}、プロテオミクスやトランスクリプトミクス ^{26 20}
。

結果

例として脂肪体培養実験を行いすべて 20 自然発生するアミノ酸と 6 h の昆虫ステロイド ホルモン 20-ヒドロキシ エクジソン (10 μ M) の釣り合った混合物が含まれているソリューションにそれらをインキュベートし分離脂肪体を刺激.コントロールとして時間の同量のための AP の脂肪体が孵化します。

インキュベーション後、総 RNA は、製造元の指示に従って三試薬²⁷を使用して分離された.抽出した RNA サンプルの量と質は、分光光度計、蛍光定量と agarose のゲルの電気泳動を使用して評価されました。RNA シーケンス ライブラリの総 RNA の 4 μ g を使用して生成された、2 つの異なる手法を使用して定量を行った。その後、ライブラリは、ペアの終了シーケンスの商用プロバイダーに送られました。

この実験の結果は、表 6のとおりです。アミノ酸と 20-ヒドロキシエクジソン最強の転写応答を示す遺伝子は、主に卵黄のタンパク質の遺伝子、前の結果¹¹に一致していた。

図 1は、差動 1,256 の遺伝子発現レベルを示すヒートマップ 2 つの異なる治療後の培養脂肪体からの遺伝子の表現を示しています。

図 1.脂肪体培養で発現する遺伝子のヒートマップ。ヒート マップは各遺伝子 R ソフトウェア環境の一部であるヒートマップ パッケージ²⁸を使用して異なるライブラリ内の特定のコピーの数に基づいて計算されます。暗い影は、高い発現を表します。式の統計的に有意な変動を持つ 1,256 遺伝子 (Q 値 < 0.05) が表示されます。遺伝子は (彼らの系統関係) に従っていない左側の樹形図で示されている彼らの平均発現量に基づいて並べられています。高アミノ酸 (AA) と 20-ヒドロキシエクジソン (20 e) 刺激後のアップまたはダウン調整式と遺伝子数に注意してください。AP =ヒトスジシマカ生理食塩水。遺伝子との相対発現量のリストについて補足のファイル 1を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

アミノ酸	分子の重量 g/mol	mM 濃度	1 リットル当たりの mg	300 mL ボリュームの mg
アラニン	89.1	26.68	2377.19	713.16
アルギニン	174.2	26.68	4647.66	1394.3
アスパラギン	150.1	26.68	4004.67	1201.4
アスパラギン酸	133	26.68	3548.44	1064.53
システイン	121.16	10.68	1293.99	388.2
グルタミン酸	147.1	26.68	3924.63	1177.39
グルタミン	146	26.68	3895.28	1168.58
グリシン	75	53.32	3999	1199.7
ヒスチジン	155.16	80	12412.8	3723.84
イソロイシン	131	10.68	1399.08	419.72
リシン	183	26.68	4882.44	1464.73
ロイシン	131	26.68	3495.08	1048.52
フェニルアラニン	165	10.68	1762.2	528.66
プロリン	115	26.68	3068.2	920.46
セリン	105	53.32	5598.6	1679.58
スレオニン	119	10.68	1270.92	381.28
トリプトファン	204	10.68	2178.72	653.62
チロシン	181	5.32	962.92	288.88
バリン	117	10.68	1249.56	374.87
メチオニン	149	10.68	1591.32	477.4

表 1。アミノ酸原液 x 4。

コンポーネント	50 ml ddH2O に追加グラムの重量します。
塩化ナトリウム	8.0 g
KCl	0.074 g
MgCl2-6 H2O	0.120 g
NaHCO3	0.0250 g

表 2.20 X 塩原液。

コンポーネント	100 ml ddH2O に追加グラムを重量します。
CaCl2-2 H2O	0.90 g

g > テーブル 3。カルシウム原液 x 50 。

コンポーネント	原液濃度	100 ml のバッファーのボリューム株式
トリス pH8.0	1 M	5 mL
EDTA	0.25 M	2 mL
塩化ナトリウム	NA	0.3 g
ddH2O	NA	100 ml (~ 93 mL)

表 4.トリスバッファー 。

コンポーネント	ボリューム在庫 200 ml
アミノ酸原液	150 mL
塩原液	10 mL
カルシウム原液	4 mL
TES バッファー	10 mL
ddH2O	26 mL

表 5 。脂肪体培。

注釈	遺伝子の記述	フォールドの変更	P 値
AAEL006138	ビテロジェニン B	3443	2.52E-112
AAEL006126	ビテロジェニン C	2795	8.64E-91
AAEL006563	水子カルボキシペプチダーゼ	1002	2.17E-119
AAEL010434	ビテロジェニン A	220	1.14E-27
AAEL006542	水子カルボキシペプチダーゼ	185	2.14E-65
AAEL012678	AAEL003006-PA [ヤブカ属 aegypti](65%)	96	4.00E-70
AAEL000080	タンパク質	82	6.69E-188
AAEL015312	水子カテプシン B	77	1.27E-15
AAEL009588	核内受容体 3	75	4.58E-56
AAEL010529	タンパク質	66	1.32E-29

表 6.実験結果。

補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

ディスカッション

昆虫の器官培養は昆虫内分泌学、開発、および特定の臓器や細菌共生^{29,30,31、間の相互作用を調査するためにも代謝を研究に多用されました。 32,33,34}。脂肪体器官培養体外アミノ酸輸送法規の蚊と他の双翅目^16,17,35卵黄タンパク質の生産の研究に使用されました。^,36. 琪プロセス中に蚊脂肪体は卵黄蛋白質^{12 の大量に合成する体液からの血液の食事由来のアミノ酸をインポートする特異性の高いアミノ酸トランスポーターの配列を使用します。、19,35,36}。脂肪体の文化は、このコンテキスト¹⁸脂肪体の栄養条件の描写に尽力しました。

メスの蚊は、原料の品質は、これらの実験の成功にとって重要です。蚊幼虫の下で混雑した条件で育ち、通常高栄養飼料で飼育は、最高の結果を生みます。実験デザインの観点から研究室で蚊脂肪体培養条件を確立する際に考慮するいくつかの重要な変数があります。我々 は、脂肪体の遺伝子発現は個々 の生活史と蚊^11,22の栄養状態によって大きく変わる前の研究で示した。蚊培養条件は均一サイズの可変性を抑えるべきであるし、実験の蚊の栄養を有します。また、担当者が、解剖は、一貫性のある結果を迅速かつ正確な解剖、十分にトレーニングする必要があります。分離脂肪体の細胞生存率は、異なる染色法^37,38を使用して確認できます。

脂肪体培養実験の実験的なデザイン考慮すべき解剖数一定期間で可能。大量の脂肪体が必要な場合、複数の解離セッションまたは複数 dissectors は必要かもしれません。蚊や他の虫の脂肪体文化の in vitroの将来のアプリケーションの広い範囲があります。それは昆虫防除のため潜在的な薬剤の候補者をテストするときに便利になります。脂肪体 trophocytes で特定のレポーター蛋白質を表現する昆虫の遺伝子組み換え技術の使用は、新しい手法を用いて、脂肪体の生理学の研究のための強力な生物検定を開くでしょう。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scissors	Fiskars	83872
Fly pad	Genesee Scientific	789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial	Hausherrs Machine Works, Inc.	3740-01-210-2368
Fine tip forceps	World Precision Instruments, Inc.	500085
Light microscope	Leica Microsystems
96 well plate	Sigma	CL S3383
Sucrose	Sigma	S9378
Alanine	Sigma	A7627
Arginine	Sigma	A5006
Asparagine	Sigma	A0884
Aspartic Acid	Sigma	A9256
Cysteine	Sigma	W326305
Glutamic Acid	Sigma	G1251
Glutamine	Sigma	G3126
Glycine	Sigma	G2879
Histidine	Sigma	H6034
Isoleucine	Sigma	I2752
Lysine	Sigma	L5501
Leucine	Sigma	L8000
Phenylalanine	Sigma	P2126
Proline	Sigma	P0380
Serine	Sigma	S4500
Threonine	Sigma	T8625
Tryptophan	Sigma	T0254
Tyrosine	Sigma	T3754
Valine	Sigma	V0500
Methionine	Sigma	M9625
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P9333
MgCl2-6H2O	Sigma	M2670
NaHCO3	Sigma	S5761
CaCl2-2H2O	Sigma	C8106
Tris pH8.0	Sigma	T1503
EDTA	Sigma	E6758
ddH2O	Sigma	W4502