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要約

ここでは、受信者からの明瞭な細胞のサブセットの抑制能力と受信者ドナーまたは外因性の抗原への免疫の状態、移植、耐性を誘導し、 in vitroとin vivo評価プロトコルを提案します。

要約

移植の主な関心事は、細胞の誘導を介して特定のトレランスを達成するためにです。トレランスのメカニズムの理解には、信頼性の高いモデルが必要です。ここでは、共刺激が引き起こす信号の封鎖すること遺伝子導入による免疫制御分子の発現によって誘導されるラットの心臓移植への耐性のモデルについて述べる。これらの各モデルは、制御性 T 細胞 (Treg)、B 細胞 (Bregs) や骨髄性細胞 (RegMCs) など細胞の生体内で生成できます。本稿で述べる特定し、寛容誘導と保守.に彼らの責任を決定するための in vitroとin vivoの規制細胞活性の定義に使用されている 2 つの相補的なプロトコルまず、体外抑制アッセイは用量依存的にエフェクター免疫応答の抑制能力を持つ細胞の迅速な同定を可能し、サイトカイン測定や細胞毒性などさらに分析に使用することができます。第二に、新しく照射接木された受信者に寛容な扱われた受信者からセルの養子転送監督移植免疫反応を制御するおよび/または新しい細胞 (の変換でこれらの細胞性免疫寛容を強調表示呼ばれる感染性トレランス)。これらのメソッドは、表現型の既知のマーカーとセルに制限されておらず、任意のセル人口を拡張することができます。さらに、ドナー監督 allospecificity 細胞 (フィールドで重要な目標) の第三者によるドナーの細胞を使用して評価することができますまたは体外か体内に移植します。最後に、これらの細胞の特定の免疫寛容の容量を調べるには、体液性抗ドナー抗体と受信者の新しいまたは元の知られている抗原に対する体液性応答を開発する能力を評価するためのプロトコルを提供します。説明耐性のモデルはさらに新しいバイオ マーカーと免疫制御分子を識別するために細胞を特徴付けるために使用ことができます、他の移植モデルまたは齧歯動物または人間の自己免疫疾患に適応。

概要

ラット心臓移植寛容誘導とメンテナンスのメカニズムを解読するためのトレランス誘導治療を評価するために信頼性の高い臓器移植モデルで、機能的有能で支配的な細胞を誘発する可能性があります。以下のプロトコルは、ルイス 1 a 受信者ラット (LEW.1A、RT1、) に、完全に不一致異所性心臓移植ルイス 1 w ドナー ラット (LEW.1W、RT1u) をについて説明します。この台木に急性拒絶反応は急速に (約 7 日間) で発生して簡単に測定、腹部の触診を破って移植によって評価されることができます。ここでラットの心臓移植への耐性を誘導するために 3 つのプロトコルを提案する.これらのモデルで耐性誘導や各種規制のセルによって維持されます。最初に、CD40Ig をエンコード アデノ ウイルスと CD40 CD40L の相互作用のブロック (AdCD40Ig) による CD8 の世代二次グラフト受信者1に転送+ Treg ときに対して耐性を誘導することができます。さらに、による cd8 陽性+細胞 (抗 CD8α 抗体) に生成 AdCD40Ig 扱われる受信者 Bregs と RegMCs の2。CD8 の深い分析+ Treg プロパティは、インターロイキン-34 (IL-34)、Fibroleukin 2 (FGL-2)3,4,5,6 として定義されているいくつかの免疫調節分子の重要な役割を強調表示.(AAV ベクター) と IL-34 の過剰発現は、RegMCs の世代を通じて自己寛容を誘導に対し FGL 2 の過剰発現は細胞の複雑なネットワークを基になる Bregs を誘発しました。

慢性拒絶反応はゆっくり開発し、長期、慢性拒絶反応に対する許容範囲を区別するために詳細な分析が必要です。移植は通常細胞浸潤の評価 immunohistology7による血管壁と補完 C4d 沈着の肥厚、線維化。組織学方法、動物の犠牲を必要とするまたは生検を移植、ここで忍容性同種のさまざまな機能を評価する簡単な方法を説明: 出現および細胞と血液から抗ドナー抗体応答の機能フローサイトメトリーによるサンプル (ここでは、我々 は蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用)。

公差、同種移植を治療の逮捕後のメンテナンスは8細胞の誘導と一般に関連付けられました。最後の十年の研究は、CD4 に焦点を当てた+Treg 満場一致で特徴と+キー マーカー Foxp3 によってそれら、CD25高CD127-9,10,11。同様に、いくつかのマーカーは、CD8 に帰因した+ Treg CD122 よう+、CD28-、CD45RC低、PD1+とヘリオス+1、12,13,14,15,16,17. 年、GITR、CTLA4、およびサイトカインの発現 (IL-10、TGFβ、イリノイ州 34、IL 35、FGL-2) Treg プロファイル3,4,6,13にさらに関連付けられました。 18,19,20,21。Bregs、RegMCs、NKTregs などの新たな規制のセル人口は、関連性の高い特定のマーカーを欠けています。確かに、Bregs は大抵未熟な CD24 として報告されますあいまいな CD27 の発現と時々 IL-10、TGFβ、またはグランザイム B22,23,24の生産、+の細胞します。骨髄性細胞系列の複雑さには、CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a、または CD163 の25,26などの規制や炎症性のプロファイルを定義するいくつかのマーカーの組み合わせが必要です。最後に、いくつかのマーカーは、CD11b など NKTregs を識別するために報告されている+CD27+表現型を記述するために27,28,29 TGFβ+、しかしより多くの研究が必要 ,30,31,32。したがって、抑制活性の証拠はさらに新しいバイオ マーカーの同定については表現型を正当化するために必要な新しい免疫メディエーターと新しい細胞療法に範囲を拡張します。

細胞の抑制活性を評価する 2 つの補完的な手法を提案する.まず、体外法ドナー抗原提示細胞 (APCs) 異なる比率で 6 日間で刺激したラベル付きエフェクター T 細胞の抑制細胞を培養で構成され、分析、エフェクター T 細胞の増殖をドナー監督免疫抑制を反映しています。投与したラットからの細胞は素朴なラットおよび非投与移植ラット抑制活性のため (またはその他の規制のセル人口) から抑制: エフェクターの比率の範囲内のセルに直接比較できます。また、このメソッドは、すべての移植を必要としない、6 日以内に結果が得られます。第二に、体内のメソッドは、目的の細胞を投与群のラットから新しく照射移植の受信者に転送するで構成されます。B 細胞、骨髄細胞、T 細胞から世間知らずの非投与ラット、養子の転送時にグラフト生存を延長する、急性拒絶反応を抑制することができる通常、扱われる受信者から増強作用抑制活性を持つ細胞があるこれらの属性1,2,3,4,33。受信者の照射によるリンパ球減少症に対して転送細胞血液の恒常性によって影響を受けませんし、抗ドナー免疫反応をより簡単にマスターできるように推奨します。両方の方法は、同種造血幹細胞の in vitro利用第三者 Apc または生体内で養子伝達抑制のためサードパーティ心移植の受信者に細胞は抗ドナー特異性の解析を許可します。体内法表現悪い細胞のかなりの数を必要とするのに対し、細胞の亜集団は抑制活性の in vitro33より簡単に評価できます。

体液性応答は、寛容の状態、ドナー抗原に対する抗体の監督のコントロールを評価するためにも測定できます。確かに、寛容は、ドナーに対する体液性応答の不在が、受信者が新しい抗原に対する体液性応答を開発するための能力の保全と記憶応答の保全によって特徴付けられます。まず、alloantibody 検出の原理は、移植の受信者から次のドナー細胞血清型のインキュベーション受信者抗体によるドナー細胞の認識に基づいています。外因性の抗原に対する 2 番目、体液性応答は、長期許容受信者鍵穴カサガイ ヘモシアニン (KLH) が乳化フロイント完全アジュバントの評価次刺激をすることができます。抗原に対する特異 IgM および IgG 抗体の存在を検出できます 4 と 13 日、それぞれ、免疫、酵素リンク免疫測定法 (ELISA)34以下。第三に、移植と赤血球染色受信者血清日収集 +8 と移植 +17 日-7 と +3 で異種の赤い血球 (赤血球) の注射による免疫学的記憶の保存を評価できます。これらすべてのメソッドは、免疫グロブリンのサブタイプの同定、特定の二次抗体と FACS の汚損によって未満 1.5 h で結果の迅速な収集や elisa 法によるいくつかの時間を使用しています。

最後に、これらのプロトコルは移植モデルのために設計されて、ある程度、自己免疫疾患モデルに適用することができます。法の原則は、すべての種に置き換えることができます。

プロトコル

注: ここでのすべてのプロトコルは倫理委員会で承認されている、滅菌方法で実行する必要があります。

1. ラット心移植モデルにおける許容値の生成

  1. LEW.1A 同種移植のプロシージャに LEW.1W
    1. ドナー男性 LEW.1W イソフルラン O2吸入、1% N2O 5 分位仰臥位で動物後添加を使用してラットし、開胸術を実行する betadine で腹部を消毒の麻酔 (すなわち切開、胸の胸膜腔)。
      1. 劣ると優れた大静脈をクランプ、図形、およびそれらをカットします。肺動脈と大動脈をカットし、冷たい 0.9% に移植片を保存塩化ナトリウム。
    2. 麻酔、250 g LEW.1A 受信者の雄ラット (8-12 週) イソフルラン O2吸入、1% N2O 5 分仰臥位に動物を配置し、xyphopubic 開腹を行う betadine で腹部を消毒後添加を使用して(すなわち、剣状突起から恥骨結合に大きな切開)。
      1. 腸を持ち出したり、腹部の血管をクランプ、グラフトの大動脈、腹部大動脈と肺の間の termino 側吻合 (すなわち、 1 つのチャネルの端と他の壁との間の接続) を実行動脈、腹部の下大静脈、削除クランプ。
    3. 筋肉面と皮膚を縫合し、betadine で消毒します。
    4. Nalbuphine (鎮痛剤) を注入 6 mg/kg 皮下 (サウスカロライナ)、オキシテトラサイクリン (抗生物質) 筋肉 (イオ ミン) し、動物を目覚めさせるまでの熱ランプの下で動物を配置。ブプレノルフィン (オピオイド) (50 μ g/kg) イオ ミンとメロキシカム (非ステロイド性抗炎症薬) 注入 0.3 mg/kg 皮下移植と 1 日後の日。
  2. 共刺激の相互作用の封鎖によって寛容の誘導
    1. 1.1.1 の手順に従います。1.1.2。
    2. 動物施設の分類 A2 エリアに AdCD40Ig の 2 × 1010感染粒子 (アデノ ウイルスのキメラ分子 CD40 CD40L の相互作用をブロックする CD40Ig をエンコード) で希釈 150 μ L の最終巻に到達する乳酸リンゲル液移植の頂点の心室の壁の 3 ポイント (3 x 50 μ L) で注入します。
    3. 1.1.3、1.1.4 の手順に従います。
      注: AdCD40Ig の治療は、抗 CD8α, 抗 ICOS、または抗 CD28 抗体注射2,35,36に関連付けることができます。
  3. 組換え蛋白質の過剰発現による耐性の誘導
    1. ラット 100 μ L の最終巻に到達する乳酸リンゲル液 IL34 組換え AAV イソフルラン O2吸入と 150 g LEW.1A ラットの麻酔し、静脈内注入の 1 x 1012ウイルスゲノムを希釈 (静注) 陰茎の静脈で。
    2. AAV IL34 注入 1 ヶ月は、1.1 のプロトコルに従って LEW.1A 受信者に LEW.1W 移植を実行します。

2 混合リンパ球反応 (MLRs) による細胞抑制活性のin Vitro評価。

注: 処理耐性ラット細胞の抑制活性は、同系移植の受信者または素朴なラットから同等の人口と比較されるべき。

  1. 同種の Apc の分離: 形質細胞様樹状細胞 (Pdc)
    1. イソフルラン O2吸入、1% N2O 5 分仰臥位に動物を配置し、脾臓摘出術を実行する betadine で腹部を消毒後添加を使用して男性 LEW.1W 素朴なドナー ラットを麻酔します。Transecting 血管によって脾臓を削除、冷たい 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) X 脾臓を保存動物を縫合します。
    2. 皿に脾臓を転送、1 × PBS を削除および 0.2% コラゲナーゼ D の 5 mL の灌流酵素の消化力を高めるためには、小さな断片に脾臓をカットし、37 ° C で 15 分間加温
    3. 0.1 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 500 μ L を加えてふるいに脾臓の部分を転送し脾臓細胞を分離するに注射器のピストンをつぶします。チューブに転送し、15 ml の 1x PBS のセルを洗ってください。430 x g. で 10 分間遠心上清を破棄します。
    4. 赤血球と血小板を除去するために 10 mL の低張液で生ペレットを再懸濁します、室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。1x PBS で洗浄、遠心分離機の 190 x g 破棄上清に 10 分。
    5. コラーゲン線維を削除するには、100 μ m 組織フィルターでフィルタ リングします。5 x 107セル/ml 1 X PBS/2% 牛胎児血清 (FCS)/0.5 mM EDTA 濃度を調整するセルをカウントします。
      注: 脾細胞数は 4 x 10 の8と 7 x 10 の8セルの間する必要があります。
    6. 興味のセルのセルを並べ替える前に負の淘汰によって豊かに。T 細胞 (抗 TCRαβ、R7/3 クローンの反 TCRγδ、V65 クローン)、B 細胞 (抗 CD45RA, OX33 クローン) と NK 細胞に特異 2 μ g/mL 精製抗体を 4 ° C で 15 分間加温 (CD161、アンチ 3.2.3 クローン)、1 X PBS/2% FCS/0.5 mm EDTA を洗浄し、430 x g で 10 分間遠心.上清を捨てます。
    7. 磁性体ビーズ 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA を 3 回洗います。3.5 μ L ビーズ/106脾細胞を使用し、30 mL 1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA、マグネット、1 分のための場所を追加することによって洗浄し、上澄みを廃棄します。2 回繰り返します。10 巻 1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA のビードを再停止しなさい (例えば、35 μ L ビーズは 350 μ L 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA で希釈した)。
    8. 攪拌下の 4 ° C で 10 分間磁気ビーズの脾細胞を混合することによって不要なセルを削除、1 分のための磁石に、チューブを置き、上清を新しいチューブに転送します。2 回繰り返します。セルをカウントし、5 x 107セル/ml に 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 濃度を調整します。
      注: 5 x 10 の7と 9 x 107間濃縮脾細胞数の範囲。
    9. Pdc のさらなる並べ替え標識抗体を用いた細胞を染色: (アンチ TCRαβ、R7/3 クローン) 残りの T 細胞または B 細胞 (抗 CD45RA, OX33 クローン) を除外し、CD4 の並べ替え+ (抗 cd4 抗体, OX35 クローン) CD45R+細胞 (抗 CD45R、His24 のクローン)。ラベル ビーズ各 Ab FACS に補償行列を確立します。4 ° C で 15 分間インキュベートし、1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA を洗ってください。
    10. 5 x 107セル/mL、60 μ m 組織フィルターのフィルターの濃度で細胞を再懸濁します、0.1 μ G/ml の最終濃度の DAPI の追加によって死んだ細胞をラベルします。DAPI--TCR CD45RA にゲーティング 70 μ m ノズル セルソーターを持つセルを並べ替える-CD4+CD45R+ 図 1に示すように。
  2. エフェクター T 細胞の分離 (CD4 + CD25 - T 細胞)
    1. 無処理非移植の素朴な LEW.1A ラット脾臓を収穫し、冷たい 1 に保存して X PBS。
    2. 皿に入れふるいで脾臓を転送し、10 mL の 1x PBS を追加します。脾臓細胞を分離するに注射器のピストンをつぶします。50 mL のチューブにセルを転送、1x PBS で洗浄、遠心分離機の 430 x g 破棄上清に 10 分。
    3. RT で 5 分間 10 mL の低張液で生ペレットを再懸濁します、赤血球と血小板を除去するため、1 次洗浄 X PBS と 10 分 190 x g に遠心分離機上澄みを廃棄します。
    4. コラーゲン線維を削除するには、100 μ m 組織フィルターでフィルタ リングします。5 x 107セル/ml に 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 濃度を調整するセルをカウントします。
      注: 脾細胞数は 3 x 10 の8と 5 x 10 の8セルの間する必要があります。
    5. 並べ替えの前に興味のセルを豊かに。2 μ g/mL 精製抗体 (抗 CD8α, OX8 クローン) の CD8 細胞、B 細胞 (抗 CD45RA, OX33 クローン)、NK 細胞に固有の 4 ° C で 15 分間加温 (CD161、アンチ 3.2.3 クローン)、骨髄系細胞 (抗 CD11b/c OX42 クローン)、ガンマ デルタ T 細胞 (抗 TCRγδ、V65 クローン)。1 X PBS/2% FCS/0.5 mM edta を洗い流し、遠心分離機 430 x g に 10 分は、上澄みを廃棄します。
      注: ラット自然 CD8 を並べ替えるに+ Treg ナイーブから CD4 と同時に+エフェクター T 細胞の枯渇の中に反 CD8α Ab を追加しないでください。
    6. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 2.1.7 の手順で説明したようで 3 回磁気ビーズを洗浄します。
    7. 撹拌、4 ° C で 10 分間の磁気ビーズの脾細胞を混合することによって不要なセルを削除し、1 分のための磁石に、チューブを置き、上清を新しいチューブに転送。2 回繰り返します。セルをカウントし、5 x 107セル/ml に 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 濃度を調整します。
      注: 5 x 107および 8 x 10 の7セル間脾細胞数の範囲。
    8. +CD25 CD4 の並べ替えに標識抗体を追加- T 細胞: アンチ TCRαβ (R7/3 クローン) を抗 CD4 (OX35 クローン)、抗 CD25 (OX39 クローン) し、4 ° C で 15 分間加温CD8 を同時に並べ替えるには+CD45RC低させ、Ab アンチ CD45RC (OX22 のクローン) を追加。フローサイトメトリーでの処理のための補償行列を設定する各 Ab とビーズのラベルを付けます。1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を洗浄し、上澄みを廃棄します。
    9. 5 x 107セル/mL、60 μ m 組織フィルターのフィルターに細胞を再懸濁します、0.1 μ G/ml の最終濃度の DAPI の追加によって死んだ細胞をラベルします。DAPI -TCR+CD4 のゲートによって 70 μ m ノズル セルソーターでセルを並べ替える+CD25 細胞として-細胞 (DAPI -TCR+CD4 を必要な場合は、-CD45RC低CD8 として+Treg 抑制細胞)の図 2に示すように。
  3. 抑制細胞の分離
    注: 分割 2 つの因数で脾臓: B 細胞、骨髄細胞と NK 細胞および CD4 の他の 1 つのソート+および CD8+ CD45RC低T 細胞の免疫抑制を評価します。
    注: 養子細胞移植の必要な場合養子転送による耐性のポジティブ コントロールとして機能する 1 x 10 の8の脾細胞を保存します。
    1. B 細胞、骨髄細胞、NK 細胞の並べ替え
      1. 2.1.1 に 2.1.5 のプロトコルに従います。
      2. 2 μ g/ml の抗体 (抗 TCRαβ、R7/3 クローンの反 TCRγδ、V65 クローン)、1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA を洗ってラベルが付いていない T 細胞に固有の 4 ° C で 15 分間インキュベートし、430 x g. 破棄上澄みで 10 分間遠心します。
      3. 磁気ビーズ 1 の X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA 2.1.7 の手順で説明したようで 3 回洗います。
      4. 不要なセルを削除して動揺、4 ° C で 10 分間インキュベートし、1 分のための磁石に、チューブを置き、上清を新しいチューブに転送する磁気ビーズの脾細胞をミックスします。2 回繰り返します。セルをカウントし、5 x 107セル/ml に 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 濃度を調整します。
      5. 骨髄性細胞 (抗 CD11b/c, OX42 クローン) などが疑われる抑制活性を持つ細胞、B 細胞 (抗 CD45RA, OX33 クローン)、または NK 細胞を並べ替えるに脾細胞に標識抗体を追加 (反-CD161 3.2.3 クローン)。FACS に補償行列を確立する各 Ab とビーズのラベルを付けます。4 ° C で 15 分間インキュベートし、1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA を洗ってください。
      6. 5 x 107セル/mL、60 μ m 組織フィルターのフィルターの濃度で細胞を再懸濁します、0.1 μ G/ml の最終濃度の DAPI の追加によって死んだ細胞をラベルします。DAPI-CD11b/c+ CD45RA 骨髄細胞のゲーティング 70 μ m ノズル セルソーターでセルを並べ替える+ B 細胞の CD161+ NK 細胞の図 3に示すように。
    2. CD4 の並べ替え+および CD8 + CD45RC低T 細胞
      1. 2.2.4 に 2.2.1 のプロトコルに従います。
      2. 磁気列で否定的な選択は、インキュベート細胞 B 細胞 (抗 CD45RA、OX33 のクローン)、NK 細胞に特異 2 μ g/mL 精製抗体を 4 ° C で 15 分 (CD161、アンチ 3.2.3 クローン)、骨髄系細胞 (抗 CD11b/c OX42 クローン)、ガンマ ・ デルタ T 細胞 (アンチ-TCRγδ、V65 クローン)、1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA で洗ってし、430 x g. 破棄上澄みで 10 分間遠心分離します。
      3. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 2.1.7 の手順で説明したようで 3 回磁気ビーズを洗浄します。
      4. 撹拌、4 ° C で 10 分間の磁気ビーズの脾細胞を混合することによって不要なセルを削除し、1 分のための磁石に、チューブを置き、上清を新しいチューブに転送。2 回繰り返します。セルをカウントし、5 x 107セル/ml に 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 濃度を調整します。
      5. Treg を並べ替えるセルに標識抗体を追加: アンチ TCRαβ (R7/3 クローン)、抗 cd4 抗体 (OX35 クローン)、アンチ CD45RC (OX22 のクローン)。FACS に補償行列を確立する各 Ab とビーズのラベルを付けます。4 ° C で 15 分間インキュベートし、1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA を洗ってください。
      6. 5 x 107セル/mL、60 μ m 組織上のフィルターの濃度で細胞を再懸濁します、0.1 μ G/ml の最終濃度の DAPI の追加によって死んだ細胞をラベルします。DAPI のゲートによって 70 μ m ノズル セルソーターでセルを並べ替える-TCR+CD4+CD45RC低CD4+Tregs と DAPI-TCR+CD4-CD45RC低CD8 として+Treg (図 4)。
        注: アンチ CD8α Ab (OX8 クローン) 場合使用できます抗 cd4 抗体 Ab の代わりに T 細胞が CD4 から差別される+抗 TCR のラベル化による非 T 細胞。CD4 の過剰+細胞増殖色素 (CPD) ラベリングにより細胞死を見越して Treg を並べ替える必要があります。
  4. Carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) 細胞増殖を測定するためのラベリング
    1. レスポンダーのセルが並べ替えの後 1x PBS で 2 回細胞を洗浄します。
    2. 1x PBS で 1 × 107細胞/ml の濃度で細胞を再懸濁し、0.5 μ m CFSE RT で暗闇の中で 5 分間加温します。1.5 倍のボリュームの FCS の追加によって反作用を停止し、4 ° C で 430 x g で 10 分間遠心上清を捨てます。
    3. 2 回完全培地で細胞を洗浄し、セルをカウントします。
      注: は、この段階での細胞死の 30% を期待してください。
  5. CPD の CD4 のラベル付け+ CD4 の抑制の試金のための不活性+エフェクター細胞
    注: この手順は、CFSE-CD4 を差別する必要が+Treg CFSE-増殖レスポンダー CD4 から+T 細胞共培養の CPD-細胞のゲーティングで、6 日目で。
    1. CD4 後+これをソートするセル、1 × PBS で 2 回細胞を洗浄します。
    2. 1x PBS で 1 × 107細胞/ml の濃度で細胞を再懸濁します、暗闇の中で常温に 20 分間の CPD V450 の 10 μ m を孵化させなさい。
    3. 2 回完全培地で細胞を洗浄し、セルをカウントします。
      注: は、この段階での細胞死の 30% を期待してください。
  6. 培養のためのアドバイス
    1. 中規模構成でカルチャを使用: (100 U/mL) β-メルカプトエタノール (5 x 10-5 M)、ペニシリン、ストレプトマイシン (0.1 mg/mL)、ピルビン酸ナトリウム (1 mM)、グルタミン (2 mM)、HEPES 緩衝液 (1 mM)、非本質的なアミノ酸 (1 X)、FCS (添加 RPMI 1640 媒体10%)。
    2. 96 ウェル U の培養細胞は底板です。
    3. 次の順序でセルを追加: 抑制細胞、細胞、そして同種細胞。
    4. T 細胞と同種の Apc の数を一定に保つ、Treg 範囲番号をテストします。たとえば、比率 4:4:1、104抑制細胞、5 × 104レスポンダー セル、および 10 の4同種細胞と比 2:4 x 1.25 x 5:1、104抑制細胞、5 × 104レスポンダー セル、および 1.25 x 10 x 2.54同種セルです。
    5. 200 μ L 中/ウェルの 5 x 104応答細胞の比率を維持します。
    6. コントロール、CFSE (2.7.6 の手順を参照してください)。 6 日目でゲートの同種 Apc (マイナス コントロール) なし T 細胞と T 細胞細胞 (肯定的な制御) することがなく同種の APCs といくつかの井戸があります。
  7. FACS 染色と培養 6 日後分析
    注: エフェクター細胞の増殖は、いくつかの時点で評価できます。増殖は指数: 細胞分裂の増加に伴って抑制条件及び陰性対照のより多くの違いが見られます。
    1. セルを転送 96 ウェル U 96 ウェル v 底板底板と遠心分離機の 4 ° C で 1,200 × g で 1 分
    2. 必要な場合、サイトカイン濃度を測定するための-20 ° C で新しい板に上清を保存します。
    3. 200 μ L と遠心 4 ° C で 1,200 × g で 1 分あたり 1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA でセルを洗浄して
    4. さらに T 細胞上のゲートに細胞に抗体を追加: アンチ TCRab (R7/3 クローン) と抗 cd4 抗体 (OX35 のクローン)。4 ° C で 15 分間インキュベートし、200 μ L/ウェル 1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA で 2 回洗ってください。上清を捨てます。
    5. DAPI の 100 μ L で 0.1 μ g/mL の 1x PBS で希釈した読み書き FACS アナライザーとプレートを追加します。
    6. DAPI 負 (生きているセル) のゲートによって CFSE プロファイルを分析 CPD 負 (非 CD4+Treg) TCR+CD4+細胞。非刺激細胞図 5下部左ヒストグラムで示すように、最大の CFSE 明るさがあります。同種の Apc の存在下で、細胞がある最大増殖と最小限の CFSE 明るさ (下中央)同種の Apc と細胞、存在下で培地の増殖と CFSE 明るさ (右下) エフェクター細胞があります。

3 心の中で養子の細胞移植による細胞抑制活性のin Vivo評価移植の受信者。

注: 照射は、宿主細胞を排除し、ドナー細胞の生着と増殖に必要です。

  1. 受信者前提、裏付け移植前日に早く移植の受信者を照射します。I.m.吹出しキシラジン 8 mg/kg のラットを麻酔のケタミン (80 mg/kg) X 線で 4.5 Gy の線量で照射条件と。
  2. 2.3 興味のセルを分離するためのプロトコルに従います。
    注: 必要な場合養子転送による耐性のポジティブ コントロールとして機能する 1 x 10 の8の脾細胞を保存します。
  3. 12 時間照射 (夕方には接木の前に、日) 後、4% イソフルラン O2吸入ラットを麻酔し、セルを吹き込む (1.50 x 10 x 107骨髄細胞、3.0 や 107 B 細胞 x 3.0 5.0 x 10 の7 T 細胞8養子転送による耐性の肯定的な制御として脾細胞) 陰茎の静脈に点滴。
    注: 養子転送によって耐性に必要な細胞数、細胞の抑制活性に依存します。
  4. 次の日、同種移植を実行する 1.1 のプロトコルに従います。腹部を触診によって移植の進化に従ってください。

4. ドナー特異的抗体の検出

注: IgG 移植ドナーの方に指示応答は受信者の血清ドナーからの細胞を培養によって測定されます。同系の LEW.1W 血清と細胞の孵化によって LEW.1W B 細胞の直接染色によるバック グラウンドを減算します。

  1. ラットから血を収穫し、4 ° C で 1,200 × g で 15 分遠心分離血清を保存します。血清は、-20 ° C で保存またはすぐに使用することができます。56 ° C で 30 分間インキュベートし、血清中の補体を不活化します。
  2. ドナー LEW.1W ラット脾臓を収穫し、冷たい 1 に保存して X PBS。2.2.1 手順に従います。2.2.4 を。96 ウェル V 底プレートに 2 × 105細胞/ウェルを追加します。4 ° C で 1,200 × g で 1 分を遠心し、上清を捨てます。
  3. 1/270 の 1 × PBS に 1/10 直列から血清を希釈 (4 希釈/サンプル)。25 μ L 希釈血清/ウェルの 4 ° C で 1 時間のセルを孵化させなさい。分析サンプル (1 血清 x 4 希釈 x 4 IgG サブタイプ) ごとにドナー特異 IgG サブタイプ (IgG, IgG1、IgG2a IgG2b) 免疫応答の数を見込んでいます。1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を洗浄し、上澄みを廃棄します。
  4. 各マウス抗ラット IgG サブタイプ Ab 4 ° C、1 つのサブタイプ/井戸で 30 分の螢光色素標識細胞を孵化させなさい。
    注: 螢光色素標識抗ラット Ig Ab を使用できない場合、それは浄化されたラベルのないマウス抗ラット IgG サブタイプ Ab および螢光色素標識二次抗マウス株式会社によって利用可能な蛍光色素と cytometer 構成では、使用することいくつか抗ラット IgG のサブタイプは、適切な設定と 1 つの井戸でテストできます。
  5. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA をセルを 2 回洗って、上澄みを廃棄します。
  6. DAPI を 100 μ l 添加 0.1 μ g/mL の PBS で希釈したし、FACS アナライザーとプレートを読む追加します。
  7. 螢光色素 DAPI-のすべてのセルに付けられて Ab 抗ラット IgG サブタイプの平均蛍光強度 (MFI) を読んでください。対応する希釈 LEW.1W 細胞の各受信者から血清を用いて MFI から素朴な LEW.1A 血清 (背景の汚損、左下) LEW.1W 細胞を用いて MFI を減算 (未処理拒否受信者の下部中央を中間の MFI を表示処理の耐受信者のために右、最大の MFI と下部を表示) (図 6)。

5. (ナイーブ及びメモリー) 外因性の抗原に対する体液性応答の評価

注: 移植、治療、および予防接種前にラットの血清は、体液性応答のネガティブ コントロールとして使用ください。そうでなければ、非免疫素朴なラットが使用できます。血清免疫受信者、すなわち、移植 exoantigen 免疫と拒否受信者からは、体液性応答のポジティブ コントロールとして使用されます。

  1. (図 7) 新しい抗原に対する液性反応を開発する能力
    注: この方法は体液性応答の相対的な定量化標準は含まれません。5.1.6 の手順でラット IgG または IgM 抗 KLH Ab 既知濃度の希釈の範囲を追加することによって、絶対免疫グロブリン定量は不可能でしょう。
    1. フロイント完全アジュバントを 200 μ l 添加で KLH の 50 μ g を乳化し長い存続/耐性受信者の尾を注入、体液性応答の肯定的な制御として未処理拒否受信者、または素朴なラットを制御します。
    2. 4 と 13 日、予防接種後に血液サンプルを収穫し、4 ° C で 1,200 × g で 15 分遠心分離血清は、上部の段階を保存します。陰性対照の非経口免疫ラット血清を収穫します。血清は、ELISA アッセイまで-20 ° C で凍結することができます。
    3. 50 μ L/ウェル 4 ° C で一晩 1x PBS で 10 μ g/mL で希釈した KLH ELISA プレート (フラットボトム) コートします。コーティング ソリューションは、すべての井戸をカバーしていることを確認します。
    4. 洗濯によって余分なノンコート KLH を削除します。洗浄し、洗浄バッファーの 150 μ L/ウェルを追加 (0.1% を含む 1x PBS トゥイーン) とフリック。
    5. 100 μ L/ウェル 10 %fcs を含む洗浄バッファーの 37 ° C で 1 時間インキュベートして受信者の Ig の非特異的結合をブロック。一度洗ってください。
    6. 連続洗浄バッファーから 1/40 1/512 の受信者の血清を希釈したコーティング プレートにシリアル希釈の重複 50 μ L/ウェルを追加し、37 ° C で 2 時間インキュベート否定的な制御のための血清の無料のいくつかの井戸を保ちます。2 回洗います。
    7. ビオチン化抗ラット血清を含む井戸に Ab は IgM [受信者 4 日目や、ビオチン化抗ラット IgG、13 日目で収穫した血清を含む井戸の 50 μ L で収穫され、37 ° C で 1 時間インキュベートの 1 μ G/ml の 50 μ L を追加します。2 回洗います。
    8. 37 ° c. の 45 分の 1 μ g/mL で 50 μ L/ウェル HRP 標識ストレプトアビジンを追加します。3 回洗います。
    9. 3, 3 ', 5, 5 '-テトラメチルベンチジン (TMB) 基板 < RT で 30 分間の 50 μ L を追加し、2 M 硫酸コントロールが飽和状態に肯定的なときの 25 μ L で反応を停止します。
    10. 405 で吸光度を読み nm。素朴なラット コントロール血清を用いて 1 つの受信者の血清を用いて光学濃度を比較します。
  2. 体液性応答容量 (図 8) の評価
    1. 移植前に 7 日間は、素朴なラットに 800 μ L の 1 × PBS で希釈した異種の赤血球の静脈 109を挿入します。赤血球は、羊、馬、または他の種からすることができます。
    2. 移植を行い、免疫寛容治療を管理します。
    3. 移植後 3 日間は i.v.109 800 μ L の移植の受信者および非移植ラットの 1x PBS で希釈した赤血球を再び挿入します。
    4. 収穫 2 回目予防接種と上部血清位相を回復するための 4 ° C で 1,200 × g で 15 分遠心後血液サンプル 5 と 14 日。血清は、-20 ° C で保存またはすぐに使用することができます。使用前に 56 ° C で 30 分間インキュベートし、ラット血清中の補体を不活化します。
    5. 2 x 105 RBC/ウェルの 96 ウェル V 底プレートを追加します。4 ° C で 1,200 × g で 1 分を遠心し、吸引により上澄みを慎重に廃棄します。
    6. 連続希釈血清を倍から 1/1 の 1/1280 X PBS に (8 希釈/サンプル)。25 μ L 希釈血清/ウェルの 4 ° C で 1 時間のセルを孵化させなさい。1 X PBS/2% FCS/0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を洗浄し、上澄みを廃棄します。
    7. RBC 種吸着抗ラット IgG の細胞または 1 つのサブタイプ/井戸 4 ° C で 30 分間の蛍光色素標識 IgM サブタイプを孵化させなさい。予防接種後 5 日から 14 日をそれぞれ収穫血清.のラット IgM および IgG 抗赤血球の評価します。1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA をセルを 2 回洗って、上澄みを廃棄します。
      注: 螢光色素標識抗ラット Ig Ab が利用できない場合、浄化されたラベルのないマウス抗ラット IgG サブタイプ Ab および螢光色素標識二次抗マウス Ab を使用する可能です。
    8. 0.1 μ g/mL の 1x PBS で希釈した DAPI を 100 μ l 添加し、FACS 解析と細胞を分析します。
    9. MFI をグループごとに希釈の関数として表してください。

結果

(図 2)、同時に Apc (図 1)、細胞および Treg の並べ替えに続く抑制の活動の評価、または個別に (図 4)、他の推定上規制セル (図 3) ができ完了生体内で直接注入する細胞と体外CFSE 明るさ (図 5) の測定によって。ドナー (図 6)...

ディスカッション

新しく移植の受信者へ合計脾細胞の養子送金する誘導または治療による細胞の存在を検出する効率的な方法です。ホスト照射誘起過渡のリンパ球減少は、転送後の細胞生存率と許容範囲の確立を推進しています。また、亜致死照射は免疫寛容免疫再構築、感染耐性34と呼ばれる現象の中に新しい細胞に変換するプロパティを持つセルの時間を残します。通常、よく説明 CD4

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、ANR (ANR-11-LABX-0016-01)、IHU セスタス プロジェクトも、資金を管理する"Investissements d'Avenir"フランス政府プログラムの一部である Labex 囲碁プロジェクト (n ° ANR-11-LABX-0016-01) のコンテキストで実現した、"Investissements d'Avenir「フランス政府プログラム、管理によって、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005)。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
animals
LEW.1W and LEW.1A ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
BN third party donor ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
namecompanycatalogue numbercomments
reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
anti-TCRabHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KR7/3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX39 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX8 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RAHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX33 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K3.2.3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/cHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX42 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgdHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KV65 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RCHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX22 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX35 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#112-096-071
anti-rat IgG1Serotec#MCA 194
anti-rat IgG2aSerotec#MCA 278
anti-rat IgG2bSerotec#MCA 195
anti-rat IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#115-095-164
streptavidin HRPBD Biosciences, Mountain View, CA#554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis, USA#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher Scientific Inc, USAPhosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, USA#9005-64-5
TMB substrate reagent kitBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kitThermo Fisher Scientific Inc, USA#C34554
RPMI 1640 medium 1XThermo Fisher Scientific Inc, USA#31870-025
penicilline streptomycineThermo Fisher Scientific Inc, USA#15140-122
Hepes BufferThermo Fisher Scientific Inc, USA#15630-056
non essential amino acidsThermo Fisher Scientific Inc, USA#11140-035
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific Inc, USA#11360-039
2 beta mercaptoethanolSigma, Saint-Louis, USA#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 CellThermo Fisher Scientific Inc, USA#65-0842-85
GlutamineSigma, Saint-Louis, USA#G3126
DAPIThermo Fisher Scientific Inc, USA#D1306
Collagenase DRoche Diagnostics, Germany#11088882001
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NaCl 0.9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetic dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, USA#01-1111-42
BetadineRefer to the institutional guidelines
IsofluraneRefer to the institutional guidelines
NaplbuphineRefer to the institutional guidelines
TerramycineRefer to the institutional guidelines
BuprenorphineRefer to the institutional guidelines
MeloxicamRefer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
RompunRefer to the institutional guidelines
Ringer lactateRefer to the institutional guidelines
KetamineRefer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solutionDilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase DDilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
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equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
falcon 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
sieve
Corning plastic culture dishesVWR, Pessac#391-0439
100µm and 60µm tissue filtersSefar NITEX, Heiden, Switzerland#03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning#353077
96 wells V bottom plates for FACS stainingThermoScientifique, Danemark#249570
96 wells flat bottom ELISA platesNunc Maxisorb
seringue for spleen crushBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
ELISA readerSPARK 10M, Tecan, SwitzerlandSPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiatorLincolshire, EnglandFaxitron CP160
solar agitator
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
magnetThermo Fisher Scientific Inc, USA12302D

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