CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ

要約

ここでは、同義語DNA配列への制限酵素部位の挿入および機能的プラスミド回収に基づくプロトコルであるプラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。このプロトコールは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。

要約

ここでは、プラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。 CAPRRESIは、元のプラスミド回収法の多くの利点から利益を得、制限酵素消化を導入してDNAライゲーション反応を容易にする（キメラアセンブリに必要とされる）。このプロトコルでは、ユーザーは野生型遺伝子を同じプラスミド（pUC18またはpUC19）にクローニングします。キメラが組み立てられるべきアミノ酸配列領域のin silico選択の後、ユーザーはそれらをコードするすべての同義語DNA配列を得る。 Ad Hoc Perlスクリプトを使用すると、ユーザーはすべてのシノニムDNA配列を決定できます。このステップの後、別のPerlスクリプトは、すべての同義語DNA配列上の制限酵素部位を検索する。このin silico分析はまた、pUC18 / 19プラスミド上に見出されるアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）を用いて行われる。ユーザは、野生型およびampR遺伝子をPCRによって破壊するために同義語領域内のオリゴヌクレオチドを設計する。 obtの後相補的なDNA断片を精製し、精製し、制限酵素消化を行う。適切な相補的DNA断片を連結することにより、キメラ構築が達成される。 CAPRRESIのために、小さいサイズ（2,686塩基対）、高いコピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的入手可能性などの技術的利点を提供するため、pUC18 / 19ベクターが選択される。キメラ構築のための制限酵素の使用は、平滑末端生成物を産生するDNAポリメラーゼの必要性を排除する。 CAPRRESIは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。

概要

キメラ遺伝子アセンブリは、タンパク質機能を解明するため、および/またはバイオテクノロジー目的のために、分子生物学において広く使用されている。重複するPCR産物増幅¹ 、プラスミド回収² 、相同組換え³ 、CRISPR-Cas9システム⁴ 、部位特異的組換え⁵ 、およびギブソンアセンブリ^6のような、遺伝子を融合させるための異なる方法が存在する。これらはそれぞれ異なる技術的利点を提供します。例えば、重複PCR設計の柔軟性、プラスミド回収中の構築物のインビボ選択、またはCRISPR-Cas9およびGibsonシステムの高効率などである。一方、これらの方法のいくつかを実行している間にいくつかの困難が生じることがあります。例えば、最初の2つのアプローチは、平滑末端DNAフラグメントに依存しており、これらのタイプの産物のライゲーションは、sticに比べて技術的に困難であり得るky-endedライゲーション。 部位特異的組換えは、Cre- loxPシステム^5のように、オリジナルに余分なDNA配列（傷跡）の痕跡を残す可能性があります。 CRISPR-Cas9は、標的部位⁴に加えて他のゲノム領域を修飾することがある。

ここでは、プラスミド回収法（PRM）と同義DNA配列に制限酵素部位を挿入し、ライゲーション効率を向上させたタンパク質コード遺伝子を融合させるプロトコールであるプラスミド回収と制限酵素サイト挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを紹介する。アミノ酸配列の完全性を保証するために、制限酵素部位を同義語DNA配列のストレッチ上に挿入する。 CAPPRESIの利点の中には、通常の実験用試薬/ツール（ 例えば 、酵素、コンピテントセル、溶液、サーモサイクラー）を使用して行うことができ、迅速な結果を得ることができるという点が挙げられます。制限に依拠する同義語DNA配列から出現する酵素部位は、目的のタンパク質内の正確な融合点の選択を制限し得る。そのような場合、重複するオリゴヌクレオチドを用いて標的遺伝子を融合させ、制限酵素部位をベクターの耐性遺伝子上に挿入しなければならない。

CAPRRESIは、7つの簡単なステップ（ 図1 ）からなる：1）クローニングベクターpUC18またはpUC19 ^6の選択 ; 2）融合される野生型配列のin silico分析; 3）キメラアセンブリおよびプラスミド破壊のための破壊領域の選択; 4）制限酵素部位を含む同義語DNA配列のin silico生成; 5）選択されたプラスミドへの野生型遺伝子の独立したクローニング; 6）PCRによるプラスミド破壊、続いて制限酵素消化;および7）DNA連結および細菌形質転換を用いたプラスミド回収。この技術によって産生されるキメラ遺伝子は、i番目のシーケンス。

pUC18 / 19ベクターは、小型（ すなわち、 2,686塩基対）、高コピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的利用可能性などのクローニングおよびキメラアセンブリーに技術的利点をもたらす。ここでは、 大腸菌（Escherichia coli）宿主を用いて、バクテリアの培養物が安価で増殖が速いため、キメラを組み立てて取り扱う。このことを考慮して、最終標的プラスミドへの融合断片のその後のクローニングが必要となる（ 例えば、細菌におけるpRK415としての発現ベクターまたは哺乳類細胞におけるpCMVとしての発現ベクター）。

CAPRRESIは、2つの主要なシグマ因子遺伝子、 E. colirpoDおよびRhizobium etlisigAを融合させるために試験された。一次シグマ因子は、転写開始に関与するRNAポリメラーゼサブユニットであり、4つのドメイン（ すなわち、 σ1、σ2、σ3、およびσ4） ^{8からなる} 。アミノ酸配列の長さrpoDおよびsigAによってコードされるタンパク質はそれぞれ613および685である。 RpoDとSigAは48％の同一性（98％のカバレッジ）を共有します。これらの一次シグマ因子は、領域σ2とσ3との間で2つの相補的フラグメントに分割された。キメラ01（RpoDσ1-σ2+SigAσ3-σ4）およびキメラ02（SigAσ1-σ2+RpoDσ3-σ4）の2つのキメラ遺伝子をこのデザインに従って組み立てた。 DNA融合産物は、配列決定によって確認した。

プロトコル

1. CAPRRESIプロトコル

注： 図1はCAPRRESI全体のプロトコルを表しています。この技術は、インシリコの設計およびその後の所望のキメラの構築に基づいている。

1. クローニングプラスミド、pUC18またはpUC19の選択。
   1. 技術的要求に最も合ったpUCベクターを選択してください。
      注：両方のベクターは、複数のクローニングサイトの向きを除いて、同じシーケンスを持っています。これは、オリゴヌクレオチドの設計およびPCRプラスミド破壊のために重要である。
2. 野生型遺伝子およびpUC18 / 19配列のインシリコ分析。
   1. 野生型遺伝子のDNA配列を入手し、FASTAフォーマットファイル（ 例えば、 genes.fas）に保存する。
      注：pUC18 / 19ベクターの配列はpUC.fasファイルに含まれています（ 図1 、ステップ1）。
   2. どの制限ENZを決定するymesはREsearch.plスクリプトを実行して野生型遺伝子とpUC18 / 19配列を切断しません。あるいは、オンラインツール（ 図1 、ステップ2）を用いて制限酵素部位検索を行う。
      1. 端末に次のように入力します。
         perl REsearch.pl遺伝子
         perl REsearch.pl pUC.fas
         注：これらのコマンドは、次の出力ファイルを作成します：genes_lin.fas、genes_re.fas、pUC_lin.fas、およびpUC_re.fas。
      2. genes_re.fasおよびpUC.fasファイルを比較することにより、野生型遺伝子を選択したpUC18 / 19ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングするための適切な制限酵素を選択する。 pUC18 / 19ベクターのアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）に対するインサートの向きを選択してください。
   3. 野生型遺伝子（外部オリゴヌクレオチド）のコード領域を増幅するためのフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを設計する。各5 '末端に適切な制限酵素部位を含めるのオリゴヌクレオチド;これは挿入方向を定義します。
      1. フォワードオリゴヌクレオチドに機能性リボソーム結合部位を含める。
      2. 両方の野生型遺伝子をベクター内の同じ向きで挿入する。
3. キメラアセンブリおよびプラスミド破壊のための破壊領域の選択。
   1. translate.plスクリプト（ 図1 、ステップ3）を実行して、野生型およびampR遺伝子のアミノ酸配列を取得します。
      1. 端末に次のように入力します。
         perl translate.pl遺伝子
         perl translate.pl ampR.fas
         注：このスクリプトは、次の出力ファイルを作成します：genes_aa.fasおよびampR_aa.fas。
   2. 2つの野生型アミノ酸配列を適切なソフトウェア（ 例えば、 MUSCLE） ^9とグローバルに整列させる。
   3. キメラasseのための望ましい区切り領域（3〜6アミノ酸）を選択してください配列アラインメントに基づくmbly。 FASTA形式のファイル（ 例： regions.fas）に保存します。
   4. 両方の野生型遺伝子上の選択されたアミノ酸ストレッチをコードするDNA配列を見つける。
4. 制限酵素部位を含む同義語DNA配列のin silico生成
   1. 破壊領域として選択された各アミノ酸配列ストレッチをコードするすべての同義語DNA配列を得る（ 図1 、工程4）。これらの配列はregions.fasファイルに格納されていました。
      1. 端末に次のように入力します。
         perl synonym.pl regions.fas
         注：このスクリプトはregions_syn.fas出力ファイルを作成します。
   2. シノニムDNA配列上に見出される制限酵素部位を検索する。
      1. ターミナルに次のように入力します： perl REsynonym.pl regions_syn.fas
         注：このスクリプトはregions_syn-re.fas出力ファイルを作成します。
   3. 両方の野生型遺伝子の同義語配列の間で共有される1つの制限酵素を選択する;このサイトは、制限酵素消化によるキメラの構築に使用されます。選択された制限酵素が野生型遺伝子またはpUC18 / 19ベクター配列のいずれも切断しないことを確認する。
      1. genes_re.fas、pUC_re.fas、およびregions_syn-re.fasファイルにある制限酵素を比較してください。
   4. インシリコでは、両方の野生型遺伝子の対応する遺伝子座で、同義語のDNA配列をオリジナルに置き換えます。シノニムDNA配列を野生型配列ファイル（genes.fas）に付加する。
   5. 遺伝子に含まれる遺伝子のアミノ酸配列を得る。ファイル（ perl translate.pl genes.fas ）。
   6. 野生型および同義語DNA配列から翻訳されたアミノ酸配列を整列させる。両方のシーケンスが同じであることを確認します。
   7. pU上に存在するampR遺伝子を用いて、このセクションのすべてのステップを繰り返すC18 / 19ベクター。
      注：目的は、 ampR遺伝子（ampR.fasファイル）を2つの相補的な部分に分けることです。 ampR遺伝子を破壊するように選択された制限酵素は、キメラ構築に使用される制限酵素とは異なるはずである。
5. 選択されたpUC18 / 19ベクターへの2つの野生型遺伝子の独立したクローニング（図1、ステップ3）。
   1. 選択したpUC18 / 19プラスミドDNAをプラスミドDNA精製キットを用いて精製する。
      1. 例えば、pUC18プラスミドで大腸菌 DH5αを形質転換し、形質転換体を固体LB-0.3mg / mLアンピシリン（Amp）上で37℃で一晩増殖させる。形質転換コロニーを選択し、新しいLB-0.3 mg / mL Ampプレートに接種し、37℃で一晩増殖させます。
      2. 以前の培養物の一部をとり、37℃で6〜8時間液体LB-0.3 mg / mL Ampで増殖させます。キットを使用してプラスミドDNAを抽出する。
   2. アプロープを用いて、全ゲノムDNAから野生型遺伝子をPCR増幅する外部オリゴヌクレオチドを産生する。可能であれば、忠実度の高いDNAポリメラーゼを使用してください。収量を最大にするDNAポリメラーゼを選択してください。製造業者のガイドラインおよびオリゴヌクレオチドの融解温度に従ってPCRを実施する。
      1. 使用されるDNAポリメラーゼ、アンプリコンサイズ、鋳型、およびオリゴヌクレオチドに依存して、PCRサイクルを実行する。例えば、 rpoD DNAを増幅するには、5μLの10×バッファー、2μLの50mM MgSO 4、1μLの 10mM dNTPミックス、2μLの各10μMオリゴヌクレオチド（表2）、2鋳型DNA（ 大腸菌 DH5α総DNA）μL、超純水35.8μL、高忠実度DNAポリメラーゼ0.2μLを添加した。次のPCRサイクルを実行します：94℃で1分間の変性後、30サイクルの増幅（変性のために94℃で30秒間、オリゴヌクレオチドをアニールするために60℃で30秒間、および68℃で2分間）拡張します）。
      2. 1.2gのアガロースを100mLの二重蒸留水に入れてマイクロ波で加熱する。ゲルトレーと櫛を組み立てて水平ゲルキャスターに入れます。ゲルトレーに融解したアガロース溶液を満たし、凝固させます。櫛を取り外します。
      3. ゲルを電気泳動チャンバーに入れる。 1×Tris-アセテート-EDTA緩衝液でチャンバーを満たす。 50μLのPCR産物をゲルウェルにロードする。試料を電気泳動させる（ 例えば 、110Vで1時間）。
      4. 電気泳動後、100μLの1mg / mLエチジウムブロマイド溶液100μLを含む二重蒸留水100mL中でゲルを10分間ゆっくり振とうしながら染色する。緩やかに振盪しながらゲルを二重蒸留水中でさらに10分間洗浄する。水平シェーカーを使用してください。
         注意：臭化エチジウムは毒性化合物です。保護手袋と綿の実験用コートを着用してください。
      5. キットを用いてゲルの対応するバンドから野生型遺伝子DNAを精製する。染色されたゲルをUVチャンバーに入れてバンドを可視化する（推奨波長：300nm）。ゲルの露出を最小限に抑えてください。 DNA精製キットを使用し、製造元の指示に従ってください。
         注意：紫外線は危険です。保護盾、眼鏡、綿の実験用コートを着用してください。
   3. 精製された野生型遺伝子およびpUC18 / 19プラスミドDNAを制限酵素で製造者の指示に従って消化する。可能であれば、速やかな消化酵素を使用する。例えば、10μLの超純水、2μLの10X緩衝液、1μLのKpn I制限酵素、および1μLのXbaI制限酵素中の6μLのpUC18 DNA（300ng /μL）を消化する。反応液を37℃で30分間放置する。
      1. 製造業者のガイドラインに従って制限酵素を不活性化する。例えば、二重消化反応Kpn I- Xba Iを80℃で5分間不活性化する。
   4. ミックスインサート：容積比でのベクターDNA3：1である。ライゲーション反応については、製造元の指示に従ってください。可能であれば高速ライゲーション酵素を使用する（25℃で10分間反応させたままにする）。
      注：通常、キットを使用した精製後のDNA濃度は、消化およびライゲーション反応に十分適しています。例えば、 6μLのrpoD DNA（ Kpn I- Xba I、150ng /μL）、 3μLのpUC18 DNA（ Kpn I- Xba I、150ng /μL）、2μlの緩衝液10μL、1μLの超高純度水、および1μLのT4 DNAリガーゼを含む。連結反応を25℃で10分間放置する。
   5. 補足資料に記載されているように、2〜4μLのライゲーション反応で大腸菌 DH5αを形質転換する。形質転換細胞を固体LB / Amp / X-gal / IPTGプレートにプレートする。プレートを37℃で一晩放置する。
   6. 白色形質転換大腸菌コロニーを選択し、それらを新しいLB / Ampプレート上にストリークする。プレートを37℃で一晩放置する
   7. 補足資料に記載されているように、反応を配列決定するための候補を選択するためにコロニーPCRを行う。候補からプラスミドDNAを抽出する。あるいは、インサートをクローニングするために使用したのと同じ制限酵素で候補プラスミドDNAを消化する。
   8. シークエンシングサービスプロバイダ^10を有するシークエンス候補構築物。 DNAアセンブラ¹¹ （ 図1 、ステップ5）を使用して、in silicoでシークエンスを組み立てます。
6. PCRによるプラスミド破壊、続いて制限酵素消化。
   1. 野生型およびampR遺伝子のための破壊領域での、それぞれin silicoフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの設計。対応する同義語DNA配列（ステップ1.4で得られた）の野生型フラグメントをin silicoで置換する 。
      注：このシノニムDNA配列には制限酵素サイトが含まれています。順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドは、t彼は制限酵素部位である。オリゴヌクレオチドは、21〜27ヌクレオチドの範囲にあり、シトシンまたはグアニンで終わり、制限酵素部位を含むべきである。フォワードオリゴヌクレオチドは、鋳型DNA上のその標的領域と同じ配列を有する。逆方向オリゴヌクレオチドは、鋳型DNA上の標的領域の逆相補配列である。
   2. 2つの野生型遺伝子構築物をPCR反応のDNA鋳型として用いる（ 例えば、 pUC18 rpoDおよびpUC18 sigA ）。 pUC18 rpoDσ1 -σ2、pUC18 rpoDσ3 -σ4、pUC18 sigAσ1 -σ2、およびpUC18 sigAσ3 -σ4の2つの補完部分を得る（ 図1 、工程6）。
   3. DNAサンプルを1〜1.2％[w / v]のアガロースゲルにロードする。 PCR産物を電気泳動（ 例えば、 110Vで1時間）によってDNA鋳型から分離する。あるいは、PCR反応をDpnIで消化してDNA鋳型を破壊する。
      注： DpnI酵素はメチル化DNA配列（5'-GATC-3 '）のみを認識する。
      1. DNA精製キットを使用してサンプルを精製する。製造元のガイドラインに従ってください。
   4. 製造元の指示に従って適切な制限酵素ですべての相補的DNA断片を二重消化する。可能であれば、速ダイジェスト制限酵素を使用する。例えば、製造者のプロトコールを用いて、AflIIおよびSpeIでpUC18rpoDσ1-σ2DNA断片を二重消化する。消化反応を37℃で15分間放置する。
   5. 製造業者のガイドラインに従って制限酵素を不活性化する。例えば、 AflII- Spe Iを80℃で20分間不活性化する。
7. DNAライゲーションおよび細菌形質転換を用いたプラスミド回収。
   1. 適切なDNA断片を容積1：1の比で混合して、所望のキメラ遺伝子を構築する（ 図1、ステップ7）。
      注：このようにして、 ampR遺伝子の完全性が回復し、機能性タンパク質が産生される。
      1. 例えば、4μLのpUC18 rpoDσ1 - σ2DNA （ AflII - SpeI 、150ng /μLで消化）、4μLのpUC18 sigAσ3 - σ4DNA （ AflII - SpeI 、150ng /μL）を混合する。 2×緩衝液10μL、超純水2μL、T4 DNAリガーゼ1μL;キット精製後のDNA濃度は、消化およびその後のライゲーションに十分適しています。ライゲーション反応を25℃で10分間放置する。
   2. 3〜5μLのキメラアセンブリライゲーション反応（補充物質）を用いて大腸菌 DH5αを形質転換する。形質転換細胞をLB / Amp / X-gal / IPTGプレートで一晩37℃で一晩増殖させる。
   3. 白色形質転換大腸菌コロニーを選択し、それらを新しいLB / Ampプレート上にストリークする。 37時には一晩放置する℃。
   4. 補足資料に記載されているように、コロニーPCRを行い、シークエンシング反応の候補を選択する。電気泳動（2.3.2.1項を参照）を行うことにより、バンドを1-1.2％（w / v）アガロースゲルで可視化します。
   5. 積極的な候補者から文化を成長させる。プラスミドDNA精製キットを使用してそれらからプラスミドDNAを抽出する。

2.配列候補キメラ構築物

1. プラスミドDNAの品質が、配列サービス提供者のガイドラインに従って、配列決定反応に十分良好であることを確認する。精製キットを使用してDNAを抽出する。例えば、配列サービスプロバイダーのインターネットページでは、サンプルに推奨されるDNA濃度に特に注意してください。 DNA定量装置を用いてサンプルの濃度を得る。
2. シークエンシングサービスプロバイダ^10を有するシークエンス候補キメラ構築物。
3. 組み立てる in silico DNAアセンブラ^11を使用して読み取りを開始します。
4. 配列アラインメントツール9,12を使用して、組み立てられた対インシリコ設計キメラ配列を整列させる。キメラ遺伝子が正常に融合したことを確認する。

3.準備をする

注：生きている細胞を含むすべてのステップは、ブンゼンバーナーが付いているきれいな層流フードで実行する必要があります。

1. E.coliDH5α-コンピテント細胞を産生する。
   1. 大腸菌 -コンピテント細胞を作製するためには、公表されたプロトコール¹³に従うか、 補足資料を参照のこと。あるいは、市販のコンピテントセルを使用してください。
2. 形質転換大腸菌 DH5αコンピテント細胞。
   1. 大腸菌 （ E. coli）培養物の化学的形質転換については、公表されたプロトコールclass = "xref"> 13または補足資料を参照してください。あるいは、細菌の形質転換にエレクトロポレーションを使用する。市販のコンピテントセルを使用する場合は、製造元のガイドラインに従ってください。
3. 大腸菌 DH5αからのゲノムDNAおよびプラスミドDNAの精製。
   1. 補足資料に記載されているように、市販のキットを使用するか、公表されたプロトコールに従って核酸抽出を行う。
4. コロニーPCRを行う。
   1. この技術を使用して、後続の配列決定反応の候補形質転換コロニーを同定する。
      注：このメソッドは、シーケンスの完全性の最終的な検証を表すものではありません。このテクニックの詳細な説明は補足資料にあります。
5. ソリューションの準備。
   1. 見る溶液調製の詳細については、表1を参照してください。
6. CAPRRESIプロトコルに必要なスクリプトとシーケンスファイルをダウンロードしてください。
   1. 目的の種の完全なゲノム配列を含む遺伝子バンクファイルをダウンロードし、ゲノムブラウザを用いて選択した遺伝子のDNA配列を抽出し、fastaファイルフォーマットで保存する。 CAPRRESIプロトコルに必要なPerlスクリプトをダウンロードしてください。スクリプトとシーケンスファイルを同じディレクトリに格納します。

結果

図1に CAPRRESIを示します。この方法を用いて、2つの細菌の一次シグマ因子（ すなわち、大腸菌 RpoDおよびR. etli SigA）のドメインを交換することによって、2つのキメラ遺伝子を組み立てた。 rpoDおよびsigA遺伝子のDNA配列は、それぞれGenBankゲノムファイルNC_000913およびNC_007761からArtemis Genome Browser ¹⁴を使用して得?...

ディスカッション

CAPRRESIはPRM ^2の代替品として設計されました。元のPRMは強力な技術です。それは、選択された遺伝子の任意の部分に沿ったDNA配列の融合を可能にする。 PRMについては、野生型遺伝子を同じプラスミドにクローニングしなければならない。その後、プラスミド上に見出される野生型および抗生物質耐性遺伝子の内部にオリゴヌクレオチドを設計する。プラスミド破壊は、平滑?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity	Thermo Fisher	11304011	Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products
High pure plasmid isolation kit	Roche	11754785001	Used for all plasmid purification reactions
High pure PCR product purification kit	Roche	11732676001	Used for all PCR purification reactions from agarose gels
AflII restriction enzyme	New England Biolabs	R0520L	Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C
KpnI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3142L	Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C
SpeI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3133L	Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C
XbaI restriction enzyme	New England Biolabs	R0145L	Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibiotics
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N8878-5G	Antibiotics
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Bacterial cell culture
Casein peptone	Sigma Aldrich	70171-500G	Bacterial cell culture
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	Sodium chloride
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	Bacterial cell culture
XbaI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0684	Fast digest XbaI enzyme
KpnI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0524	Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Fast DNA ligation kit
AflII restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0834	Fast digest AflII enzyme
SpeI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD1253	Fast digest SpeI enzyme