WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

要約

粘液は、嚢胞性線維症の気道を差し込ま（CF）の患者は、微生物病原体が繁栄するための理想的な環境です。原稿は、彼らが病気を引き起こし、どのように化学的条件の変化は、微生物のダイナミクスを駆動することができ模倣環境でCF肺microbiomeを研究するための新規な方法を説明します。

要約

多くの慢性気道疾患は、気道の粘液詰まりをもたらす。嚢胞性線維症を有する個体の肺は、それらの粘液栓付き細気管支が微生物のコロニー形成のための好都合な生息環境を作り出す典型的な場合である。様々な病原体が、この環境で相互作用し、CF疾患に関連する多くの症状を引き起こす。微生物群集のように、その生息地の化学的条件は、地域社会の構造と動態に大きな影響を与えます。例えば、異なる微生物は、異なるレベルの酸素または他の溶質濃度で増殖する。これは、酸素濃度がコミュニティの生理学および構造を駆動すると考えられるCF肺においても当てはまる。ここに記載されている方法は、肺環境を模倣し、病気を引き起こすような方法で病原体を増殖させるように設計されています。次に、これらの微生物の化学的環境の操作を用いて、肺感染のストリーはその微生物生態学を支配する。この方法は、WinCFシステムと呼ばれ、人工喀痰培地および細い毛細血管に基づいており、粘液栓の細気管支に存在するのと同様の酸素勾配を提供する。喀痰の培地pHや抗生物質の圧力などの化学的条件を操作することにより、着色インジケータを用いて試料中の微生物学的差異を視覚化することができ、気体またはバイオフィルムの産生を観察し、または各試料の核酸含量を抽出し、

概要

本稿に記載された方法は、WinCFシステム¹と呼ばれています。 WinCFの全体的な目標は、粘液で満たされた肺の細気管支の環境をシミュレートできる実験装置を提供することです。これは、嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息などを含む粘液過剰分泌の表現型を有する肺疾患の微生物病原体を研究するための扱いやすいシステムを可能にします。手順は、肺の分泌物が最終的に粘液²と細気管支および他の小さな通路を埋め、クリアする太くて硬くなることが原因の変異によって特徴付けられるCFの研究、のために特別に設計されました。吸入空気は、もはや多くの肺胞に到達しても細菌のコロニー^3、4の生息地を提供することができるので、肺の中のこのような閉塞は、ガス交換を阻害しません。での微生物の増殖を防止することができません過剰な肺粘液は最終的に気道の複雑な慢性感染症の発症につながる。これらのコミュニティには、ウイルス、菌類、 緑膿菌などの細菌など、さまざまな生物が含まれています。すべて相互に相互作用しています（5,6,7,8）。 CF肺ミクロバイオームの活性は、肺悪化と呼ばれる症状の激しさに関与していると考えられている1,9,10,11。 WinCFはこれらの悪化のまわりの微生物のコミュニティ行動の研究を可能にし、現在肺微生物生態学を研究するための基礎実験システムとして機能するように拡張されている。伝統的に、悪化は、肺から採取した試料の直接分析によって研究されてきた。多くの交絡因子が微生物bの直接分析を行いますWinCFシステムでは、これらの因子の多くが除去され、肺マイクロビームの挙動がより直接的に研究され、粘液詰め気管支叢における細菌活性のより精密な分析が可能になる。

WinCFシステムは、肺環境を効果的に模倣する方法で細菌を増殖および分析する方法を提供する。肺細菌を増殖させる従来の方法は、しばしば伝統的な寒天プレート上でサンプルを培養することを必要とした。これらの方法は、試料を大気中の酸素に開放したままにし、粘液^{12,13 で}閉塞した肺細気管支に見られる低酸素状態およびしばしば無酸素状態を考慮に入れない。好気性条件下で寒天培地で培養することは、CF肺の環境と似たものではなく、治療しようとしている病原体の行動に関する臨床医や研究者を誤解させる可能性があります。さらに、寒天プレート上の細菌に利用可能な栄養素人工痰媒体（ASM）を利用してWinCFで説明されている実際の喀痰で利用可能なものとは異なる。 Sriramulu らの シュードモナス培養によって示されるように^{図14に示すように} 、ASMは、痰の微生物に利用可能な資源を模倣し、痰の物理的な一貫性を再現する特定の成分セットを含む。罹患した肺は特定のマイクロビームを有するので、このような微生物の研究は、理想的には肺の特定の状態においても行われるべきである。

WinCFシステムは、実際の肺気管支内で起こるような微生物の変化を観察するための実験条件の迅速な分析と簡単な操作を可能にする。この技術は、痰、唾液、他の体の分泌物および純粋なまたは混合された細菌培養物を含む、無数の関連するサンプルタイプの接種を可能にする。実験装置の性質は、微生物学的なコミュニティの振舞いであり、多数の微生物学的およびオミックス手順の下流での容易な適用を可能にするように設計されている。そのような研究は、細菌のコミュニティ構成が環境の物理化学的条件に基づいて変化するため重要である。 WinCFを用いて、培地の化学的条件を操作して、細菌活性への影響を分析することができる。例えば、培地を接種する前に培地の酸性度を変更することができる。インキュベーション後、これらの各条件における細菌活性を直接比較することができ、これらの痰試料中の細菌が様々なpHに応答してどのように挙動するかについての結論を導くことができる。ここでは、WinCFシステムを適用する手順と、肺微生物に対する影響を研究するために培地化学を操作する方法の例を概説します。

プロトコル

1.人工褥瘡のためのストックの準備

1. 5％ムチン溶液を作成する。脱水豚の胃ムチン1.0gを20mLの脱イオン水に加えます。得られた溶液をオートクレーブする。
   注：ムチン滅菌は、その固有の構造を破壊します。ムチンをその乾燥形態で滅菌するための他の方法には、UV滅菌および照射が含まれる。しかし、これらの方法は、WinCFシステムでは広く使用されていません。
2. 50mLの脱イオン水に2.2gのKClを添加し、溶解させる。 5.0gのNaClを50mLの脱イオン水に加え、溶解させる。これら2つのソリューションをオートクレーブします。
3. 100mgのサケ精子DNAを10mLの滅菌脱イオン水に加える。この溶液を水浴中で約85℃に数時間加熱して溶解させる。
4. 5.0mgの滅菌脱イオン水に5.0mgのフェリチンを添加する。

2.人工痰の調製

1. 結合する以下の成分：ムチン原液16mL、KCl原液2.0mL、NaCl原液2.0mL、卵黄エマルジョン200mL、DNA原液5.6mL、フェリチン原液120μL、必須液5.78mLアミノ酸溶液5.78mL、非必須アミノ酸溶液5.78mL、および滅菌水2.44mLを入れた。
   1. 少量の沈降物が現れる場合は、静かに振り混ぜる。
   2. 培地5.0mLを8つの滅菌15mL遠心分離管にピペットで入れる。
      注：各チューブの化学的条件は、必要に応じて操作できます。例えば、異なるpHレベルでの微生物の挙動を比較する目的で、緩衝溶液およびpH指示薬を各チューブに添加することができる。これのデモンストレーションは、代表的な結果セクションに示されており、8つの異なるpHレベル、すなわち5.0から8.5までが0.5pH増分で示されている。
2. 培地の化学的条件がうまく操作されたら、後で使用するために凍結する。メディアは今後も安定している-20℃で数ヶ月間禅してください。解凍時に渦。

キャピラリーチューブの制御運転の準備

1. 滅菌された生物学的状況では、それぞれ250μLの培地を含む8つの滅菌マイクロ遠心チューブを充填します。
2. さらに8個の滅菌15 mL遠心チューブを取得します。各チューブは、ステップ3.1で述べたマイクロ遠心チューブに対応しています。
   1. 70％エタノール溶液でペーパータオルを滅菌し、乾燥させる。乾燥したら、タオルをそれぞれ約4平方インチの断片に裂き、15 mLの遠心管の底にそれぞれの断片をつぶします。チューブを追加する場合は、必要に応じてペーパータオルをスプレーして乾燥させてください。
   2. それぞれの遠心分離チューブの底に1つの紙塊を置き、湿った環境を作り出すために、約1.0mLの滅菌水で各紙塊をわずかに湿らせます。
3. ステップ3.1で調製したすべてのマイクロ遠心チューブ用の3本のガラス毛細管と1本のキャピラリーチューブパテシールnt。
4. 各マイクロ遠心チューブについて、3本のキャピラリーチューブに、チューブの上部近くの青いマーカーから約5mmの培地を満たしてください。
   1. チューブの一端をマイクロ遠心チューブに入れ、水平方向に傾けて毛管作用で培地をチューブに導きます（ 図1参照）。
   2. 手袋をした指を静かにチューブの開いた端に置いて充填を止め、チューブのもう一方の端をシーラントブロックに押し下げて密封します。

図1：pH勾配の例、人工痰のある充填キャピラリーチューブ媒体は、管の一端を液体に挿入し、毛管作用を促進するために傾斜させることによって加えられる。この例における媒体の着色は、悪臭を助けるために加えられたpHインジケータによるものであるインキュベーション後の酸性度の変化を測定する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

5. 3本のキャピラリーチューブの各セットを、完全に滅菌水で湿らせたペーパータオルで満たした15mLの遠心チューブに入れ、パテ側を密閉します。チューブとラベルにキャップをします。これらの3本の毛細管は、各制御条件の複製のためのものである。
6. すべての15 mL遠心チューブに指定の毛細管を満たしたら、チューブを保持ラックに置きます。チューブを水平にインキュベートするようにラックを置きます（気泡を捕まえるため）（ 図2参照）。 37℃で48時間遠心チューブ（湿った紙塊を含む）の内側に毛細管をインキュベートする。

図2：pH勾配の例、インキュベーションに適した毛管。 3本のキャピラリーチューブが満たされ、密封されたら、それらを、湿ったペーパータオルを底にした遠心チューブに入れる。このチューブをキャップし、ラックに入れる。インキュベーションが完了するとガスの生成が観察されるように、ここに示すように、インキュベーション中にラックを横向きにしなければなりません。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

インキュベーション後の対照毛管の画像化

1. インキュベータから遠心チューブのラックを取り出し、チューブを水平に保ちます。キャピラリーチューブを遠心チューブから注意深くスライドさせ、各セットを他のセットとは別にしておきます。
2. キャピラリーチューブをライトボックスの上に並べ、チューブの内容物が見えるように並べます明るく照らされた。異なる化学条件を分けるために3本のチューブごとにギャップを空けてください。
3. チューブの位置を合わせ、ライトボックスをオンにして、真上から写真を撮ります。 （ 図3参照）

図3：pH勾配の例、対照実験、プレインキュベーション、喀痰添加なし。毛細管に添加した後の人工喀痰培地。pHは左から右へ増加する。培地に添加された指示薬の組み合わせにより、より酸性の管がより黄色に見える一方、酸性の管はより紫色になる。管は水平に配置され、上から撮影された下から照明される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

4. の処分生物学的有害廃棄物中の制御物質。

5. WinCFキャピラリーチューブに痰のサンプルを接種する

1. 滅菌された生物学的状況では、それぞれ225μLの培地を含む8つの滅菌マイクロ遠心チューブを充填する。
2. 3mLシリンジ（針なしのプラスチックシリンジ）を用いて喀痰を繰り返し抜き出して排出することにより、痰サンプルをホモジナイズする。喀痰が滑らかな一貫性を有するまで、これを行う。
3. ステップ5.1で調製した各マイクロ遠心チューブ（ASM培地で1/10希釈）にホモジナイズした痰25μLを加えます。次に、チューブを30秒間ボルテックスして十分に混合します。
4. 手順3.2〜3.5と同じ手順に従って、キャピラリーチューブに培地を加えます。

インキュベーション後のサンプル毛細管の画像化

1. 48時間のインキュベーション時間の後、ステップ4.1〜4.3と同じ手順に従って毛細管を取り除き、イメージングする。
2. チューブに気泡が存在する場合は、必ず明確に撮影した写真は、チューブ内の気泡とメディア間の描写を示しています。バイオフィルムが存在する場合、写真ははっきりと同様にその存在を描くことができることを確認します。

ダウンストリームアプリケーションのためのメディアの7.取り外し

1. 下流分析を容易にするために、画像形成後毛細管からメディアを削除します。潜在的なアプリケーションは、培養およびDNA / RNA配列決定およびメタボロームプロファイリングが含まれます。
   注意：病原体で満たされたガラス毛細管を有意バイオハザードは、このように、これらのステップは、特定の機器に非常に慎重に行う必要がありますされています。毛細管が壊れた場合は、適切なバイオハザード鋭利物容器に廃棄してください。
2. メディアを削除するには25ゲージ、長さ0.5インチの平滑末端針を使用してください。シールを破るために、チューブの栓を最後に平滑末端の針を挿入します。
3. 開封後は、逆さまに毛細管をオンにし、メディアが上部から出て滴ります。私メディアF、容易に垂れない200μlの先端とピペットを使用して、キャピラリーチューブの端部に挿入されたときピペットプランジャーを押し下げることにより、チューブからメディアを追い出します。適切な容器（1.5mLの遠心分離管）に排出され、チューブ媒体を集めます。
   注：トランスクリプトームまたは他のRNA分析のために、メディアがRNA安定化バッファに直接排出することができます。

8. WinCF FLUDシステム

注：WinCF流体読み込みユーティリティデバイス（FLUD）システムWinCFシステムのスループットを最適化するように設計された相補的なデバイスの任意スイートです。 WinCF FLUDシステムは、主に3Dプリント可能な材料で構成されています。 3D印刷された製造業は、研究者だけでなく、最小限の製造要件のための最小限のダウンタイムを確保するために、材料の迅速かつ容易に交換することができます。デザイン、STLファイル、3D印刷指示とWinCF FLUDマニュアルは、オンラインsupplemeでご利用いただけますNT。

1. 毛細管のロード用のメディアの準備
   1. 滅菌バイオフードでは、各メディアの900μLで8つの滅菌2mLの微小遠心管を埋めます。
   2. 3 mLシリンジ（針なしのプラスチックシリンジ）で繰り返し痰を吸引及び吐出することにより任意の喀痰サンプルを均質化します。痰がスムーズに一貫性のあるまでこれを行います。
   3. ステップ8.1.1で調製した各マイクロ遠心チューブ（培地中で1/10に希釈）に均質化痰の100μLを加えます。次いで、十分に混合するために30秒間チューブをボルテックス。
   4. チューブが垂直になるように配向回転子管ホルダーに充填し、オープンマイクロ遠心管をスロット。
2. 毛細管の配置
   1. ステップ8.1で、すべてのマイクロチューブのための3つの毛細管を取得します。
   2. ゴムクレードルにスロット3本のチューブそれらは装置の他端にマイクロ遠心チューブと整列するようになっています。チューブのマーキングされた端がマイクロ遠心チューブから離れていることを確認します。クレードルの底にある3つの穴を、クレードルスタンドの3つのスタッドの上に正しく取り付けます。
   3. 配置されたキャピラリーチューブを装置のガイドチャネルに載せた状態で、シフトを防ぐためにゴムタンプを中央部にしっかりと固定します。 （ 図4参照）

図4：ゴムタブで固定されたキャピラリチューブが完全に装填されたFLUDシステム この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

3. キャピラリーチューブへの媒体のローディング
   1. キャピラリーチューブがある装置の端を慎重に片手で掴んでください他方の手で微量遠心管が装填されている回転ラックを保持する。
   2. 微量遠心チューブを微妙に回転させて、微量遠心チューブがほぼ水平になるようにし、ラックをゆっくりと毛管に向かって押し込みます。 （ 図5参照）
   3. キャピラリーチューブの端が微量遠心管内の培地と接触すると、毛管作用がすぐに毛管を充填し始めるようにしてください。塗りつぶし率と塗りつぶしレベルを調整するには、装置全体を静かに回転させます。これを行う際に、微量遠心チューブからメディアをこぼさないように注意してください。 （ 図6参照）
   4. 毛細管が所望のレベルに満たされたら、装置の表面を表面に置き、慎重かつ迅速に微量遠心分離管のラックを毛細管の端部から引き離して充填を止める。マイクロ遠心チューブは、今度は垂直位置まで戻って閉じられ、閉じられることができる。
   5. 封止剤ブロックを各3組のセットに押し、毛細管の突出した端部をシールし、すべてのセットが封止されるまで一度に1セットずつシールする。汚染のリスクを減らすために、シーラントブロックの別の部分を3重にセットします（ 図7参照）。

図5：水平方向に配置された中程度のチューブを備えたFLUDシステム。キャピラリーチューブとの接触が可能です。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6：毛管作用による媒体を伴う毛細管チューブを有するFLUDシステム。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図7：シーラントブロックを使用して、一度に3つずつ3つずつ設定されたFLUDシステムの充填されたキャピラリーチューブのシールこのシーラントブロックは、シーリング中に隣接する3つのセットとの接触を防ぐために切断された縁に沿ってプラスチックを有していた。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

4. インキュベーション
   1. チューブの中央部分のゴムタンプを取り外し、ゴム製の受け台を持ち上げて本体装置から外します。これですべてのキャピラリーチューブを取ります。ここで、クレードルとチューブをイメージングラックに固定します。このrackがにチューブを設定するには、3つのクレードルに収まるスタブだけでなく、小さなガイドチャネルを持っています。
   2. 透明なプラスチックのインキュベーションボックスに全体としてイメージングラックを設定します。滅菌水に滅菌ペーパータオルの少量を浸し、インキュベーションの間、湿度を提供するために、箱の2つの短辺に沿っ置きます。 （ 図8を参照）。
   3. 水平管を保つことを確認して、37℃のインキュベーター内に完全と設定ボックスを閉じます。 48時間インキュベートします。

図8：ラバークレードルに毛細管は、湿度を提供するために、湿った紙タオルと並んでクリアインキュベーション箱に入れてきたイメージングラックにFLUDシステムから転送します。 目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図です。

5. イメージングおよび抽出
   1. インキュベーションボックスからチューブを保持する撮像ラックを取り外し、下から照明ライトボックス上に設定します。撮像ラックに既にチューブと、三重セットが適切に間隔を置いて配置され、直ちに画像の準備。
   2. 全てのライトボックスからのビューとライトの分野で表示されているように、チューブ上にカメラの焦点を合わせるチューブ色素における色の十分なコントラストおよび視覚化を提供します。真上からの写真。
   3. 管の内容物を抽出するために、一度に三連のゴムクレードル一組から毛細管を取り除きます。優しくクレードルのアップとアウトチューブを持ち上げたり、それらを引き出します。
   4. 三連の各セットに対して、7.3〜ステップ7.1に詳述抽出手順に従います。

結果

サンプルの中に誘導し、様々な化学的条件にわたる微生物の増殖は、他の人に、より微妙にいくつかのケースでは劇的に変化します。活動の多くの変更は、すぐに潜伏期間が終了したとして容易に明らかにされて、自然の中で視覚的でした。インキュベーション後に明らかになった複数の要因によって示されるようなpH操作の例において、pHスペクトルにわたってサン...

ディスカッション

CFと肺の微生物学的メイクは、生物の多種多様なが含まれていますが、肺内の条件は、可能性の高い微生物の種類が生き残ると^{、13〜15を}繁栄できるかに大きな影響を与えています。具体的なメカニズムは、それを通して、これらの条件が変化し、それが肺microbiomeに持って正確な効果は現時点では、一般的に不明です。この実験的な方法では、我々...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Color-Coded Capillary Tubes	Fisher Scientific	22-260943
Cha-seal Tube Sealing Compound	Kimble-Chase	43510
Mucin from porcine stomach	Sigma	M1778
Ferritin, cationized from horse spleen	Sigma	F7879
Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)	AppliChem Panreac	A2159
MEM Nonessential Amino Acids	Corning cellgro	25-025-CI
MEM Amino Acids	Cellgro	25-030-CI
Egg Yolk Emulsion, 50%	Dalynn Biologicals	VE30-100
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P2157500
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271500
15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps	VWR	89039-666
50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps	VWR	89039-656
1.5 mL microcentrifuge tubes	Corning	MCT-150-R
2.0 mL microcentrifuge tubes	Corning	MCT-200-C