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要約

ここでは、ホスト組織分布を調査するためのプロトコル、送信モード、および鱗翅目の種、綿のボールワーム内デンソウイルスのホストのフィットネスの効果を提示します。このプロトコルは、他の経口送信されるウイルスとそれらの昆虫ホスト間の相互作用を研究するために使用することができます。

要約

多くの小説のウイルスは、次世代シーケンシング技術を使用して動物宿主中で発見されました。以前、我々は鱗翅目の種で、mutualisticウイルス、 オオタバコガのデンソウイルス（HaDV2）を報告し、コットンボールワーム、 オオタバコガ （ヒューブナー）。ここでは、現在、そのホスト上のHaDV2の影響を研究するために使用されるプロトコルについて説明します。まず、我々は、単一の繁殖ペアからHaDV2フリーコットンボールワームコロニーを確立します。 1 HaDV2感染、その他の非感染：次に、我々は、経口的に同じ遺伝的背景を持つ2個のコロニーを生成するために濾過された液体をHaDV2含有していくつかの新生児の幼虫の子孫を接種します。ホスト組織分布およびHaDV2の伝送効率を決定するためのプロトコルであるようHaDV2感染と-uninfected個体間生命表パラメータ（ 例えば、幼虫、さなぎ、および成体期と産卵数）を比較するためのプロトコルもまた、提供されます。これらのプロトコルをめざしまた、その昆虫の宿主、特に鱗翅目のホスト上の他の経口感染ウイルスの影響を調査するために適しているULD。

概要

過去数十年では、そのような次世代シーケンシング（NGS）としてシーケンシング技術の開発は、多くの新規なDNAおよびRNAウイルス、特に非病原性ウイルスだけでなく、以前から知られているウイルス1、2、3の新規な分離株の発見を容易にしました4、5、6、7、8、9、10、11、12。モデル生物キイロショウジョウバエでは、20の以上の新たな部分ウイルスゲノムは、メタゲノム技術13を用いて検出されています。新規なウイルスを含む多くのウイルス配列は、また、ミツバチ、Mのような他の昆虫で同定されていますosquitoes、アジアの柑橘類psyllids、トンボ、および複数の鱗翅目種14、15、16、17、18、19、20、21。

今後は、より多くの新しいウイルスがこれらの高度な技術を使って昆虫で発見されることが期待できます。したがって、ウイルス-宿主相互作用の我々の理解はそれに応じて6、9変更されることがあります。例えば、ウイルス-宿主相互作用は、多くの新規ウイルスがmutualisticパートナーではなく、厳密な病原体22のように定義されているため、以前は、思ったよりも複雑であると考えられます。例えば、Dysaphis plantagineaの中mutualisticデンソウイルスDplDNVは翼のモーフを誘導しウイルスの23だけでなく、ホストの分散を促進する、モビリティを向上させます。また、mutualisticウイルスは、哺乳動物の健康、干ばつや植物の耐寒性、および細菌感染症24の影響に関して説明してきました。セネカバレーウイルス-001は、神経内分泌癌が25を特徴とする腫瘍細胞に対する選択的細胞毒性を媒介することが示されています。 A型肝炎ウイルス感染は、C型肝炎ウイルスの複製を抑制し、C型肝炎26からの回復につながる可能性があります。ヘルペスウイルスの潜伏は、細菌感染27から共生の保護を与えます。ヒト内在性レトロウイルスHERV-Wのエンベロープ糖タンパク質は、脾臓壊死ウイルス28に対する細胞耐性を誘導します。真菌エンドファイトからクルブラリア熱トレランスウイルス（CThTV）は、この菌と熱帯パニック草の間mutualisticの相互作用に関与していますREF "> 29。そこで、新たに見つかったウイルスとそのホスト間の相互作用についての知識は、その生物学と経営上の新鮮な視点を生成する必要があります。しかし、小説ウイルス、急性感染症の典型的な明らかな兆候を表示しない、特に秘密のウイルスは、めったにありません調査し、我々はそのホスト上で新たに発見されたウイルスの影響を調査するためにパイプラインとプロトコルを必要とされて。

以前、我々は、コットンボールワーム、 オオタバコガにおける有病率は新しいmonosenseデンソウイルスHelicoverpaオオタバコガデンソウイルス（HaDV2）を報告し、HaDV2とコットンボールワーム30、31間のmutualistic関係の証拠を提示しています。本稿では、詳細にHaDV2とそのコットンボールワームホストの間の相互作用を研究するために実験室のプロトコルを記述します。ここで紹介するプロトコルはまた、Rを調べる研究者に非常に関連している可能性があります特に鱗翅目害虫で、他の経口送信されるウイルスのOLE。

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プロトコル

HaDV2フリーコットンボールワームコロニーの1建設

  1. リア綿オオタバコガ幼虫14時間明/ 10時間暗および60％相対湿度、25±1℃で制御された成長室または人工気候室における人工飼料上の32（H.のオオタバコガ ）。
  2. 十分な換気を確保し、産卵基質として機能するように綿ガーゼで覆われたペアごとプラスチックケージ（10cmの高さ、直径5cm）を用いて新たにeclosed蛾の単一ペア交配を助けます。ウイルスフリーコロニーを得る可能性を高めるために、単一の対交配の少なくとも30対を利用します。 10％の砂糖と2％のビタミン溶液32とフィード大人の蛾は、コットンボールに浸し、毎日補充します。
  3. 雌成虫はポスト交配約2日間綿ガーゼの上に卵を産むとして、毎日ガーゼを変更。同じ成長室（または人工気候チャムに卵を含む収集し、維持ガーゼBER）の卵が孵化するまでの大人の蛾のように。
  4. すぐにウェルあたり1つの個別で、新しい24ウェルプレートに、新たに孵化した幼虫を移します。
  5. 五日最初の産卵日後、親蛾を収集し、液体窒素に保管してください。
    注：5日最初の産卵開始日の後に蛾を収集するには、親が、コレクションの時点で生存していることを保証し、したがって、DNAの抽出精度に死んだ蛾を使用してのいずれかの可能性のある影響を避けることができます。
  6. 製造業者の説明書に従ってDNA抽出キットを用いてこれらのサンプルからゲノムDNAを単離します。
    1. （5-CATCTACGAGGGTTACGC-3およびアクチンR：5-CATCTGTTGGAAGGTGGA-3アクチンF）プライマーアクチンF /アクチンRとアクチン遺伝子の574-bpの断片を増幅します。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、標準的なプロトコールに従ってアガロースゲル電気泳動を使用して製品を視覚化します。アクチン遺伝子の増幅が成功は、DNAが良い品質であることを保証します。
    2. トンを評価しますDVVPF（GGATTGGCCTGGGAAATGAC）とDVVPR（CGTTGTTTTTATATCCGAGG）31：特異的プライマーを用いてPCRを使用して、親蛾におけるHaDV2の彼が存在します。
  7. きれいなペアは、少なくとも5つの世代のために、単一HaDV2非感染繁殖ペアから後の子孫を識別し、HaDV2フリーコロニー（NONINF株）としてこれを維持した後、 HaDV2感染コロニーはINF-株として定義されます。
  8. NONINF-株でHaDV2の感染状況を確認するために（およびホスト開発上の既知の細菌やウイルスの影響を排除するために）、HaDV2ための感染状況を評価し、 ボルバキア 、およびH.オオタバコガ nucleopolyhedrovirus（HaNPV）8ランダムに選択された幼虫の個体において、 （：HaNPVためHaDV2、NPVF / NPVRためDVVPF / DVVPR、及びボルバキア 31 81F / 691R、33特異的プライマーを用いて）PCRを用いNONINF-株。
    注：いくつかのウイルスが遅れる可能性があることが知られていますNT PCRに基づく技術を用いても検出不可能なレベルに感染した宿主、です。 NGS技術には、ウイルス配列がゲノムDNAサンプル中に存在しないことを確認するために使用することができます。

HaDV2含有液流体の調製

注：私たちは、HaDV2ウイルス粒子の未遂精製はその感染と活動31を阻害することを示しています。従って、以下のプロトコルをHaDV2感染個体をフィルタリングすることにより感染HaDV2溶液を達成するように行われます。

  1. 個別大人の蛾を収集し、直ちに液体窒素に保管してください。
  2. 完全滅菌乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で収集した個々の蛾を挽きます。クリーン1.5 mLチューブに約10μg破片のを転送します。新しいチューブに残った破片を転送し、すぐに-80℃で保管してください。
  3. デブリ10μgのからDNAを抽出し、follo翼製造業者によって提供さプロトコル。蛾DNAが単離されたら、ステップ1.6で説明したように、プロトコルを用いてHaDV2をチェックします。
  4. ステップ2.3において得られた結果によれば、二つのグループに残り屑を分割：HaDV2陽性および陰性HaDV2、それらの感染状況に応じ。リン酸緩衝生理食塩水1mLの追加（PBSを、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMののNa 2 HPO 4、1.5mMのKH 2 PO 4、pH7.5）を各個人に完全に残っている幼虫破片を溶解します。
  5. 4℃で15分間、6,500×gで遠心分離（ステップ2.4からの）ホモジネート。 0.22μmのメンブランフィルターで上澄み液をフィルタ。濾過液体（チューブ当たり200μL）を収集し、直ちに-80℃で保存します。
    注：0.22μmのメンブレンフィルターは、望ましくない微粒子、バクテリア、および菌類のほとんどを除外します。まず、4°Cに遠心分離機を予冷。すべてのプロトコルを実行しinvolvi褐色旋回及び凝固からホモジネートを防止するために、氷上で濾過された液体の操作をngの。

HaDV2感染コットンボールワームコロニーの3建設

  1. HaDV2の水平方向の伝送能力
    1. HaDV2標準曲線を生成します。
      1. デノボプライマー（：; PR GGACAATGCTGGTGAGGC：AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG PF）と、HaDV2ウイルスの定量化のために使用され、：プローブ（GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG VP-プローブ）;プライマー（TGACAAGATCCAGCGTAGACATC VPR CTGGTGAGGCGATGGACATG VPF）を含む断片を増幅します。 PCRマシン31上で40サイクルの72℃、94℃で30秒、53℃で30秒、及び60秒以下のプログラムを使用します。鋳型DNAとして25μLPCR反応にゲノムDNA HaDV2ゲノムを含有する（ステップ2.3）の1μLを加えます。製造業者のプロトコルに従ってクローニングベクターに増幅した断片をクローニング。
      2. のコピー数を計算します次式を有するプラスミド：N Aはアボガドロ数（6.02×10 23分子/モル）であり、コピー/μL=（N A×C）/（N×Mは、10 9×）。 Cは、顕微を用いて測定することができるプラスミド（NG /μL）の質量濃度です。 Nは PCR産物（5195塩基対）を含有する組換えプラスミドの長さです。そしてMは、二本鎖DNA（660グラム/モル）の平均的な塩基対の分子量です。
      3. 、1.5×10 9の濃度で、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1.5×10 8、1.5×10 7、1.5×10 6、1.5×10 5、1.5×10 4コピー数6の10倍連続希釈を調製/ μL。
      4. サイクルTHREを生成する特異的プライマー（VPF / VPR）およびプローブ（VP-プローブ）を用いてリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を行いますステップ3.1.1.3に記載されたプラスミドのSHOLD（CT）値。三つの独立した技術的反復を実行し、さらに計算のためにそれらを平均します。
      5. 上記の結果を用いて、関連する平均CT値にLOG2変換HaDV2濃度を関連付ける標準曲線を生成します。
    2. 濾過された液体流体中HaDV2を定量化します。
      1. ピペットDNA抽出のためHaDV2を含有する濾過された液体流体（ステップ2.6）の100μLの試験サンプル。
      2. 液体流体のためのCT値を取得し、ステップ3.1.1における標準曲線を使用してコピー数を計算するためにリアルタイム-QPCRを使用します。
    3. 異なる濃度のHaDV2感染濾過液体の経口感染効率を決定します。
      1. 10 8、10 7、10 6、10 5、10 4、および0コピー数/μL以下の濃度にHaDV2を含有する液状流体を希釈します。
      2. 人工ディスプレッド固化前9センチメートル直径ペトリ皿に均等ら。均等固形人工飼料の表面上の各濃度についてHaDV2含有濾過液（200μL）を広めます。ドラフト内でこれを行います。
      3. ペトリ皿にHaDV2含有人工飼料に100新たに孵化した幼虫を転送します。穏やかに白い紙のシートにガーゼから幼虫を転送する（新たに孵化した幼虫を含む）綿ガーゼをノック。幼虫スピン絹や紙オフ「バルーン」ようにそっと紙を破りました。シルクに触れ、ペトリ皿に幼虫を移動するために滅菌ピンセットを使用してください。
      4. 48時間後、24ウェルプレートに人工飼料（ウェル当たり一人の個人）に幼虫を移します。
      5. リア大人のステージに上記の濃度でHaDV2を接種した幼虫。
      6. 、成体ガを収集DNAを抽出し、ステップ1.5で説明したように、PCRを使用してHaDV2を検出します。
        注：ここでは、共同の100％HaDV2感染率を得ますttonのオオタバコガは10 8コピー数/μLを使用して、したがって、HaDV2感染コロニー（INF-株）を設立。
  2. HaDV2の垂直方向の伝送能力
    1. 選択成人♀-/♂-、♀+ /♂-、♀-/♂+の単一のペアを生成するためのNONINFとINF-株から蛾と♀+ /♂+（+：HaDV2感染が陽性; - ：負のためにHaDV2感染）。
    2. ウイルスフリー24ウェルプレートに上記のペアから子孫を転送します。リア三齢幼虫に。
    3. ステップ1.5で説明したように、HaDV2の存在を決定するためのテンプレートとして使用するために収集3齢幼虫からDNAを抽出します。

HaDV2の4組織分布

  1. 、ウイルスや細菌からの汚染を防ぐため75％エタノールで3回鉗子およびハサミを滅菌した後、アルコールランプの炎でそれらを加熱します。
    注：鉗子sterilizatio汚染が発生したときにnが必要です。
  2. 化学天秤を使用して、組織を保存するために使用される空の管の重量を量ります。
  3. 約5分間氷上でINF-株から幼虫と大人の蛾を置きます。
  4. PBS緩衝液を含有する清潔なペトリ皿に幼虫、成人女性、成人男性の実体顕微鏡の下に次の組織を解剖。
    1. 幼虫、ピペット体液と前腸、中腸、後腸、脂肪体を切開し、マルピーギ細管（ 図1A）のために。直ちに液体窒素中でチューブに各組織を移します。
      1. ヘッド周辺セグメント間膜および最後の腹部のセグメント（ 図1A）に挿入する二昆虫ピン（直径が200μm、長さ20mm）を用いcystosepimentに凍結幼虫を固定します。
      2. 幼虫の血リンパが流出するように幼虫の後部腹部にprolegをカット。 micropを使用して10秒以内幼虫体液をピペット血リンパの褐変や凝固を防ぐためにipette。
        注：フェニルチオ尿素（50μg/ ml）をメラニンを防ぐために、体液で1:20容量/容量比で混合することができます。
      3. ハサミを使用して、最後のセグメント間膜からヘッドまでのキューティクルに切開部を作ります。 2つの鉗子を使用して実体顕微鏡下で、残りのすべての組織を切開。各組織のための画像は、 図1Aに示されています。
      4. 1つの複製として一緒に3人から組織サンプルを混ぜます。
      5. 解剖時に体液と残りの組織の汚染を防止するために、PBS緩衝液で3回解剖組織を洗浄します。次いで、洗浄に使用されるPBSのHaDV2感染の状態をテストします。最終洗浄バッファーはHaDV2フリーであれば、組織は血リンパによる汚染からクリーンでなければなりません。
    2. 大人の女性のために、頭（脳）、筋肉、脂肪体、腸、マルピーギ細管、および卵巣を（解剖PBS緩衝液中の実体顕微鏡下図1B）。成人男性のために、頭部（脳）、筋肉、脂肪体、腸、マルピーギ細管、およびPBS緩衝液中の実体顕微鏡下精巣（ 図1C）を解剖。直ちに液体窒素中でチューブに各組織を移します。
      1. ピンセットやハサミを使用して、大人の蛾の羽を削除し、スケールをクリアするために残りの体を3回洗います。
      2. はさみを使って頭部、胸部、腹部を区切ります。
      3. 胸部の内骨格を削除し、筋肉を集めます。
      4. 鉗子を用いて、腹部のキューティクルを除去し、 図1Bおよび1C以下の他の組織を切開。
      5. 1つの複製として一緒に3人から組織サンプルを混ぜます。 PBS緩衝液中で解剖した組織を3回洗浄します。
  5. それらは凍結されている場合、チューブと上記の組織を秤量し、Mことを確認異なる組織のロバは、ほぼ等しいです。
    質量（組織）=質量（管/組織サンプル） - 質量（チューブのみ）
  6. これらの組織からDNAを抽出し、ステップ3.1.2で説明したように、定量PCRを行います。
  7. ステップ3.1.1で作成した標準曲線を用いて各組織1mg当たりのコピー数を計算します。 DNA抽出のために使用される組織の量の違いに起因したサンプルバイアスを補正するために、単位質量当たりのウイルス力価を使用します。
  8. 試験された組織/（全組織1mg当たりのコピー数の和）の1mg当たり各組織= HaDV2コピー数のためHaDV2のパーセンテージを以下のように特定の組織にHaDV2の割合を計算します。

5.バイオアッセイテストホストの開発に関するHaDV2の影響

  1. 場所は少なくとも100蛹または綿ガーゼで覆われ、5-L、ワイヤーメッシュケージにNONINF-株由来の新たに出現成体ガ。 2日後、交配成人女性は、綿ガーゼの上に卵を産むために開始します。収集し、維持卵を含む綿ガーゼ。卵は約3日で孵化します。
  2. HaDV2と新生児の幼虫の接種。
    1. INF株を確立するためにHaDV2（10 8コピー数/μL）を含む人工飼料にNONINF株の新生児の幼虫を転送します。
    2. 同様に、対照群（NONINF-株）を設立するHaDV2無濾過された液体（ステップ2.4）で覆われた人工飼料に新生児の幼虫を移します。各処理（ 図2A）で少なくとも240の幼虫を含みます。
      注：幼虫NONINF-とINF-株を構築するために使用されるのと同じ遺伝的背景を確保し、同時に同じ親コホートとハッチに由来しています。 NONINF-及びINF-株が開発の同期速度のために（14時間明/ 10時間暗所、60％相対湿度、25±1°Cで）同じ気候室内に保持されていることを確認します。速度は、温度や湿度に応じて変えることができます。 delicハンドルそっと幼虫を食べました。
  3. 48時間後、24ウェルプレート（ウェル当たり一人の個人）（ 図2B）に個別に幼虫を移します。
    1. 順次番号各幼虫を各ウェルに、毎日齢段階と生存状態を記録します。
    2. 約5日後、人工飼料が悪化したときに、同時に新鮮な人工飼料（ 図2C）を含む新しい24ウェルプレートにこれらの個人を移します。
    3. 0.0001グラムの精度で化学天秤を用いて11孵化後に7日目から幼虫の重量を量ります。秤量後、個々に24ウェルプレートに幼虫を返します。
  4. （孵化後10日前後）第脱皮後5齢に脱皮の際、ガラス管（10cmの高さ、直径2cm）（ 図2D）に幼虫を移します。 5齢幼虫はまた、頭部カプセル（約2.6ミリメートル）の幅によって同定することができます。
    注：個人を転送同時にガラス管に毎日。
    1. コード塗料またはマーカーを用いてガラス管上の元の参照番号を各幼虫。日々の幼虫の状態を記録。約5日、蛹の段階は、約11日間持続した後、ガラス管に、幼虫が蛹化します。
    2. ガラス管に各個人の蛹および羽化日を記録。 3日齢の蛹の質量を記録します。
  5. 羽化後、10％スクロース、2％ビタミン溶液（ 図2E）を有する単一のケージに1匹の雌および雄1を置きます。毎日ショ糖ソリューションを補充します。各蛾のための死亡日を記録します。
  6. 卵が敷設されている場合は、毎日綿ガーゼを変更します。すぐに卵の数をカウントします。彼らは孵化しながら、新たに孵化し子孫をカウントします。
  7. バイオアッセイの間に、ランダムにHaDV2の感染状況を確認するために、各治療のために8人を選択します。商業トリプシン試薬を使用して、これらのサンプルの総RNAを抽出製造業者のプロトコルに従って。製造業者のプロトコルに従って第一鎖cDNAを合成し、ウイルスが正常に転写されるかどうかをテストするためのテンプレートとして使用することができます。

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結果

HaDV2フリー（ 図3A）した親からの子孫はNONINF-株として飼育しました。我々は、正常DNAテンプレートは良質（ 図3B）であったことを示唆し、同一のDNAテンプレートを使用してアクチン遺伝子を増幅しました。また、ランダムに選択された8人の子孫もHaDV2（ 図3C）、HaNPV（ 図3D）、及びボルバキア （ ?...

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ディスカッション

過去数十年では、昆虫ウイルスの相互作用に関するほとんどの研究は、ミツバチの健康34、35、36、ヒト疾患37のベクトルに焦点を当てている、植物は38ウイルス、および生物学的制御剤39として大きな可能性を持っているいくつかの昆虫病原性ウイルス。ほとんど注目は...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この作品は、中国の国家重点基礎研究プログラム（第2013CB127602）と中国の国立科学財団（番号31321004）のクリエイティブ研究グループのための科学基金によってサポートされていました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well plateCorning07-200-740Multiple suppliers available.
DNA extraction kitTIANGENDP304-03Multiple suppliers available.
thermal cyclerVeriti; Applied Biosystems4375786
PBSCorning21-040-CV
0.22 µm membrane filterMilliporeSLGS025NB
pEASY-T Cloning VectorTransGen, Beijing, ChinaCT301-02
TweezersIDEAL-TEK2.SA
Premix Ex Taq (Probe qPCR)TakaraRR390A
ProbesInvitrogenCustom order
PrimersInvitrogenCustom order
microspectrophotometry NanoDrop 2000c Thermo scientific not available
7500 Real-Time PCR systemApplied Biosystemsnot available
stereomicroscope SZX-16Olympusnot available
sucroseMultiple suppliers available.
vitamin complexMultiple suppliers available.

参考文献

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