レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

要約

レーザーはしばしばDNA損傷に対する細胞応答の研究で使用されています。しかし、彼らは、その間隔は、周波数、および複製フォークとの衝突はめったに特徴付けされていない病変を生成します。ここでは、レーザーローカライズ間架橋と、これらのパラメータの決意を可能にアプローチを説明します。

要約

DNA損傷応答（DDR）が広範囲に生細胞におけるレーザーマイクロビーム照射による二本鎖切断（DSB）の研究で特徴づけられています。 DDRは、ストランド間のDNA架橋（のICL）を含む共有結合性DNAの修飾を歪まヘリックスするために、同様に定義されていません。私たちは、生きた細胞の核に、immunotaggedソラレンのレーザー光活性化により、ローカライズのICLによって刺激DDRを、研究してきました。付加物の分布と複製フォークの出会いについての基本的な問題に対処するために、我々は他の二つの技術とレーザー局在を組み合わせます。 DNAの繊維は、多くの場合、短いパルスの間に組み込まれたヌクレオシド類似体の免疫蛍光による複製フォークの進行状況を表示するために使用されます。 Immunoquantumドットが広く、単一分子イメージングのために使用されてきました。新しいアプローチでは、レーザ局在のICLを有する細胞からのDNAの繊維は、顕微鏡スライド上に拡散されます。タグ付きのICLはimmunoquantumドットと目に表示されます電子間の病変の距離が決定します。 ICLと複製フォークの衝突を可視化することができ、さまざまな出会いのパターンを識別し、定量化しました。

概要

DNAはまた、それはまた、酸化的代謝によって産生される内因性ラジカル種に襲われるなど、放射線、紫外線、環境有害物質、燃焼生成物、などの外因性物質から一定の攻撃の下にあります。これらのすべては、化学的または物理的DNA ¹の完全性を破壊する可能性があります。ゲノムにおける摂動は、病変の修復に関与するタンパク質とマイクロRNAのない場合は、何千、何百ものDNA損傷応答（DDR）、リクルートおよび翻訳後修飾カスケードを活性化することができ、細胞周期、アポトーシス、老化、および炎症経路の調節^2。

DDRについての私たちの情報のほとんどは、DSBは用いた研究から来ています。これは、生きた細胞³のゲノムDNAに、配列特異的な休憩を含め、休憩を導入するための技術の利用可能性に大部分です。また、propensit免疫蛍光法によって表示することができDDRタンパク質、巣を誘導する切断のyは、タンパク質の応答の動態と要件を識別するために非常に役立っています。 DDRを研究するための重要な技術の一つは、生きた細胞⁴の核に「関心領域」にDSBのストライプを指示する（ROI）のレーザービームを使用ボナーや同僚、によって導入されました。実際に、彼らはDDRのタンパク質が免疫蛍光法によって識別することができたに長い焦点を作成しました。これは、レーザ曝露された細胞におけるリン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）の強力なストライプのそれらの実証によって示されました。それ以来、レーザーアプローチは、DSBはによって誘発されるDDRの多くの研究で採用されてきました。パワフルで人気の、そして劇的な免疫蛍光画像のソースが、病変のアイデンティティを心配することなく、観察可能な結果を​​生成するために、ほとんどの実験ではレーザー強度を調整することに留意すべきです密度、または間隔。確かに、これらの見積りを行うことが困難な場合があります。したがって、それらは主にレーザー⁵によってDNAに導入された病変の多数にもかかわらず、無視されます。これは、文献⁶には多くの矛盾に貢献しています。

DSBは対照的に、DNAのほとんどの化学修飾は、DDRタンパク質の離散病巣の形成を刺激しません。これは、病変の周波数の私達の現在の理解の光の中で重要です。培養中のヒト細胞がS期^7、8、9中大きく形成され、細胞周期あたりのような多くの50のDSBを招くと推定されています。少数の非増殖細胞に形成されています。これは、セル/ ¹日目^、10あたり数万である核酸塩基の損失または変更イベントの数とは対照的です。したがって、我々は、最大で約知っていますDDRは比較的まれであるイベント、および集計にはるかに共通している螺旋歪曲病変によって誘発されるものについてあまりにより誘発されます。

ゲノムDNAの共有結合修飾に対する細胞応答についての質問に対処するために、我々は固有のDDR誘導活性を有していたDNA付加体を歪まリックスで動作するように望んでいました。さらに、実験デザインや解釈を容易にするために、我々は時間にその導入に関して制御することができた構造に興味を持っていたと可視化に適しました。したがって、我々はソラレンに基づいた戦略を開発しました。サイトで：ソラレンはよく5' TAを好む光活性DNAインターカレーターを特徴としています。長波紫外線（UVA）光にさらされない限り、このようなナイトロジェンマスタード及びマイトマイシンC（MMC）のような他の架橋剤とは異なり、それらはDNA反応性ではありません。インターカレート分子は螺旋歪ま間架橋を生成するために、反対の鎖上のチミン塩基（のICLと反応します^）11。私たちの実験で使用したトリメチルソラレンではほとんどの製品が形成されていない比較的少ないモノ付加物が（10％未満）が生成されているの^ICL、12、および一方の鎖上の隣接する塩基間の鎖内架橋があります。彼らは複製および転写、ソラレンおよび他の架橋剤を強力にブロックされているので、シスプラチンとMMCのように、一般的な化学療法で使用されています。したがってソラレンヘリックス歪ま構造によりDDRの活性化に続いて、また、臨床的重要性を有する化合物に対する細胞応答への洞察を提供した研究を可能にしました。

私たちは、トリメチルソラレンは（DIG）をジゴキシゲニンにリンクされた試薬を合成し、植物ステロールは、哺乳動物細胞中に見出され、頻繁にimmunotagとして使用されていません。光活性化のための要件は、生細胞中の核に定義されたROIにおけるソラレンのICLのレーザ光（波長365nm）によって局在化を可能にします。これらは、IMMで表示することができますディグタグに対するunofluorescence。 DNA修復およびDDRタンパク質はのICL ^13、14ローカライズレーザのストライプ状に現れました。

DSBを生成するために使用される高レーザ強度によって活性化DDRは、単離されたまたはクラスタ化された損傷^15,16に起因するかもしれません。その結果、はるかに低い濃度で存在し、自然に病変を発生するために、これらの実験からの結果の関連性は、不確実です。 DNAにおけるソラレン付加頻度と間隔について同様の質問に対処するために、我々は、DNAの繊維技術¹⁷とimmunoquantumドットを利用しました。量子ドットは、蛍光色素よりもはるかに明るい光への曝露によって漂白されていません。従って、それらはしばしば単一分子イメージング^18、蛍光色素が不十分明るいされるアプリケーションのために使用されます。個々のDNA繊維は、Gに延伸することができますLASSスライド前細胞収穫にインキュベーション中に組み込まれるヌクレオシド類似体に対して免疫蛍光によって表示することができます。我々は、DIGソラレンで細胞を処理し、レーザマイクロ照射にROIを露出します。繊維は、細胞から調製し、個々のDig-ソラレン付加物はimmunoquantumドットで可視化することができます。比較的短い時間（20-60分）類似体ヌクレオシドに細胞を曝露することレーザ局在のICLの近傍における複製トラクトの表示を可能にします。

プロトコル

掘る-TMPの調製

1. 50mgの4'-クロロ-4,5-の（0.18ミリモル）' 、8-トリメチルソラレンおよび590 mgの乾燥した25mLの丸で4,7,10-トリオキサ-1,13- tridecanedi -アミン（2.7ミリモル）の混合窒素下-bottomフラスコ。 12時間、10mLのトルエン及び還流を加えます。減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。
   1. シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製。クロロホルム、メタノール、及び28％アンモニア溶液（1：1：0.5 9）でカラムを溶出します。減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、そして回復純粋4「 - [N-（13-アミノ-4,7,10- trioxatrideca）]アミノメチル-4,5」、8-トリメチルソラレンのように粘性の淡黄色液体。
   2. でジゴキシゲニンNHSエステルを、5mgの（0.008ミリモル）と8-トリメチルソラレン - [[N-（13-アミノ-4,7,10- trioxatrideca）]アミノメチル-4,5 '4の5.5ミリグラム（0.012ミリモル）の混合窒素下で乾燥した丸底フラスコ。 0.5mLの無水N、N-ジメチルホルムアミドを加える（DMF）AND 3.4トリメチルアミンμL、18時間50℃で撹拌しました。
   3. 減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。
   4. ジクロロメタンの最小量の残留物を溶解させます。固定相としてのシリカゲルと水平取薄層板の下部に2μLスポットに溶液を適用します。クロロホルムで分取TLCを実行：メタノール：28％水酸化アンモニウム（8：1：0.1）。
   5. 垂直エッジを除いてプレートをマスクし、短波長UV 254 nmのランプを有する生成物のバンドを識別する。スパチュラを用いてプレートから製品をこすりとクロロホルムを使用して、純粋な生成物を単離：メタノール：28％水酸化アンモニウム（8：1：0.1）の混合物。
   6. 減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去。 50％エタノール1mL中の残留ペレットを溶解：すべての溶媒が蒸発するまでH ₂ Oは、（約3時間）、遠心エバポレーターで50μLの1.5 mLチューブ（〜20のアリコート）における一定分量及び乾燥に分配します。
   7. 遠心蒸発器で再びH ₂ O及び乾燥：50％EtOH中の200μLの各アリコートを再溶解。 50％エタノール200μlに再度各アリコートを溶解：H ₂ O、長期保存のために-20℃で遠心蒸発器と店舗ペレットで乾燥。
2. H ₂ Oで1準備：H ₂ O中に溶解掘る-TMPの100希釈し、250 nmでODを測定し使用するために、50％エタノール50μlにペレットを溶解します。掘る-TMPの吸光係数は25,000です。 -20℃で保存した場合に解決策は、約一ヶ月のために安定しています。各使用前に250 nmでODを測定することにより、濃度を確認してください。
   1. ストック濃度を計算する：ABS×100×10（μMで^）6 / 25,000 =濃縮。典型的には、ストック溶液は、約3mmです。培地に添加エタノールの体積を最小限にするために、この範囲内であることが重要です。

2.レーザーローカライズのDig-TMPのICL

1. PESRSの窒素レーザー（337nm）を有する共焦点顕微鏡でrformレーザ局在は、365nmの線を放出し、0.7ナノワットの電力で、10Hzで3ナノ秒パルスを発射染料セルを通してポンピング。
2. 35ミリメートルのガラスの側に縦のマークを作るマーキングペンで細胞培養皿底。皿の側にブラックストライプが交差の一方のアームの最上部にあるように、ダイヤモンドペンを用いて培養表面上のガラスの中心に十字を傷つけます。また、細胞を同じ焦点面になるようにクロスは、ガラスの成長表面上にマークされています。
3. 70％のEtOHすすぎでマーキングした後、プレートを滅菌します。細胞を播種する前にドライ。
4. クロスでのプレートの細胞（例えばHeLa細胞またはU2OSなどの標準的な実験室株）は1日か2日前に培養皿をマーク。細胞は活発に分裂し、実験の日に百分の50から70の合流する必要があります。均一ラベルDNAを1μMの5-クロロ-2-デオキシウリジン（CldU）で24時間インキュベートします。
5. 加えます20μMの最終濃度まで細胞培養培地へのH ₂ O：50％EtOH中のDIG-TMP。 37℃にメディアを持参してください。掘る-TMPを平衡化させるために30分間インキュベーター内で細胞や場所にわたって培地（37℃、5％CO _2）に変更。
6. 細胞をインキュベートしている間、レーザがアクティブである視野のX / Y座標を確立します。レーザは、水平および対角線に沿ってミラー化スライドガラスをエッチングするためにソフトウェアによって指示された製造業者の較正手順に従います。 2行はレーザーがターゲットを打つことが可能なフィールドの境界を画定します。
7. 顕微鏡ステージ上に、制御されたCO ₂及び湿度37°Cで、環境チャンバ内にプレートを置き、十字の交差点で60X油目的に焦点を当てます。
8. 、ソフトウェアでシェイプツールと研究者によって確立されたROIに365 nmのレーザービームを向ける3のストライプを形成するために＆＃181;0.6μmとし、MX。 ROIの輪郭が十字の交差点のすぐ近くに位置する細胞の核内にカーソルが配置されています。核を介してレーザ途中を標的とするように、Z焦点面を調整します。 350〜370ナノメートルの範囲でレーザーを使用してください。 405nmのレーザーは、架橋^19を誘導することができません。
   注：我々は、微分干渉コントラスト（DIC）画像で核質と区別することができる核小体、外核質領域にROIを見つけます。
9. （セルが暗くなり、その後消え）細胞を抹消するのに十分なレベルに電力設定値を増加させることにより、レーザの焦点及び活性を検証します。これは、顕微鏡を介して、次いで、カバーガラスを通って細胞内へのレーザのための妨げられない光路のために重要な診断です。
   1. （これは各レーザー/マイクについて経験的に決定されなければならソラレンとICL誘発DDRを活性化させるのに十分なだけに電力設定を下げroscope組み合わせ）。 （γ-H2AXの形成によって監視）ソラレンの不在でDDRを活性化しないレーザー強度設定（ここでは1.7％）を使用します。
      注：これは重要な決意であり、レーザ光源や光パス内のコンポーネントが変更された場合に設定が調整を必要とするかもしれません。 GFPの蓄積に従う迅速レーザソラレンストライプに（秒）募集されているが、単独のレーザに露出ROIしないどちらもそのようなXPC又はFAN1として修復タンパク質を、タグ付けされました。数分は他人のために必要とされる一方、DDRのいくつかのタンパク質は、数秒以内に表示されます。関心のある各タンパク質のための時間経過の決定を行う必要があります。また、レーザに露光されなかった細胞で応答するタンパク質のないストライプが存在しないことに注意してください。
10. フィールド内のすべてのセルは、クロスの交差点の近くに滞在し、新しいフィールドにプレートを移動標的にされた後。
11. determに設計された実験では、インター病変距離の分布は、交差点の周囲20-25フィールド（4-5細胞/フィールド）レーザに細胞をさらすINE。ローカライズのICL近傍の複製パターンを分析するために、レーザ発射後、10μM5-ヨード-2-デオキシウリジン（IDU）で細胞をインキュベートします。
    注：IDUとのインキュベーションの時間はある程度任意です。我々は（下記参照）を20分と短く、60分ほど長く使用してきました。より長いパルス（数時間）は、多くの場合、このように画像に単一フォークの進行状況を機会を失って、合体複数の複製路につながります。いくつかの実験において、CESは、複製トラクトのパルス標識続いて、DIG TMPへの曝露の前に標識DNAを均一するために24時間CldUで標識されます。

3.細胞の収穫とDNAの繊維の延伸

1. 、ステージからプレートを取り外し培地を除去し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。 PBS溶液を除去。商用トリプシンの10μLのドロップを置きますガラス表面の中央に十字の交差点に/ EDTA溶液。
2. 室温（RT）で3~4分間インキュベートした後、ピペットチップに剥離した細胞とのトリプシン溶液を描きます。トリプシンを中和する必要はありません。
3. シラン処理ガラス顕微鏡スライドの一端に細胞とトリプシン/ EDTAの滴を置き。溶解細胞および0.5％SDS溶液10μLを添加することによってDNAを放出し、プールの周囲を乾燥させ、ピペットチップで穏やかに混合し、室温で3~4分間インキュベートします。
4. スライドを傾け20ºと液体は最後まで実行することができます。 DNA繊維を流れる液体の流体力学的な力によって延伸/伸長されます。スライドを空気乾燥（約10分）とすると3に修正：10分間、1つのメタノール/酢酸。再び定着液と空気乾燥からスライドを削除します。この時点で、彼らは、-20℃で、70％EtOH中で無期限に保存することができます。 70％エタノールから除去して、NEの前に空気乾燥さ許可XTステップ。
5. PBSでスライドを洗浄し、次いで、室温で1時間、2.5 M HCl中で変性。この治療法は、DNAが抗体に組み込まハロゲン化核酸塩基がアクセスできるように脱プリン化します。
6. 0.4 Mトリス-HCl、pH7.4中のスライドを中和します。 5分ごとにPBS / 0.5％のTween-20（PBST）で二回洗浄します。
7. ブロックは、PBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）および10％ヤギ血清をスライドします。スライド上に均一にブロッキング溶液を広げ、室温で1時間インキュベートしパラフィンで穏やかにスライドを覆います。
8. 各スライドをラット抗ブロモデオキシウリジン（具体CldUが検出）一次抗体をブロッキング溶液で200倍希釈1のピペット100μL。スライド上に均一に希釈を広げ、室温で1時間加湿チャンバー内でインキュベートするパラフィルムで穏やかにスライドを覆います。パラフィルムを外し、5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。
9. 各スライドのブロッキング溶液中：（100 1）ヤギ抗ラットアレクサフルオロ647希釈のピペット100μL。カバーパラフィルムで軽くスライドし、RTで45分間インキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。
10. ：200希釈（1時40分）マウス抗ブロモデオキシウリジンは（LDUとCldUを検出するこの二重特異性は、インキュベーション前にラット抗BrdUのによりCldUの遮断を必要とする）一次抗体およびウサギ抗DIG抗体（1のピペット100μL ）各スライドのブロッキング溶液です。パラフィルムで穏やかにスライドをカバーし、室温で1時間加湿チャンバー内でインキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。
11. （1：100）、ヤギ抗マウスアレクサフルオロ488およびc（1：5,000）で希釈のピペットで100μLのヤギ抗ウサギプローブ（ 例えば 、Qドット655）は、各スライドのブロッキング溶液です。パラフィルムで軽くスライドを覆い、室温で45分間インキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。
12. ペーパータオル上に過剰PBSTを排出します。各スライド上に退色防止封入剤の50μLを追加し、カバースリップでカバーしています。画像や店舗用-20℃で48時間以上いいえ。

蛍光顕微鏡による4.ファイバーイメージング

1. FITC、Cy5でおよびQドット655の検出が取り付けられ、完全に電動フィルタホイールを有する倒立顕微鏡上で63X対物レンズを介して画像取得を行います。励起フィルター425 nmであり、発光フィルターは、発光ピーク²⁰を中心とする20nmのと655 nmです。

結果

レーザ局在掘る-TMP（ 図1A）のICLは、ソラレンに連結されたDIGタグに対する免疫蛍光によって表示することができます。レーザは、任意の輪郭の領域に衝突するように指示することができるが、ストライプは、細胞内の「自然な」形状ではなく、正規の信号が容易に起因する一次または二次抗体による非特異的結合にアーチファクトから区別することがで?...

ディスカッション

レーザーローカライゼーション技術は、明視野顕微鏡で表示されている核を有する接着細胞を使用する必要があります。我々は、ポリリジンまたはコラーゲン、またはより複雑な混合物のような細胞接着製剤でガラス表面に、例えば一次リンパ球、又はAD293などの緩く付着培養細胞などの非接着細胞を、取り付けることを試みました。これらの治療は、表面に細胞を結合することができるが?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107