レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

Jing Huang; Himabindu Gali; Julia Gichimu; Marina A. Bellani; Durga Pokharel; Manikandan Paramasivam; Michael M. Seidman

doi:10.3791/55541

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Method Article

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

DOI:

10.3791/55541

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April 20th, 2017

Jing Huang¹, Himabindu Gali¹, Julia Gichimu¹, Marina A. Bellani¹, Durga Pokharel¹, Manikandan Paramasivam¹, Michael M. Seidman¹

¹Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health

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要約

レーザーはしばしばDNA損傷に対する細胞応答の研究で使用されています。しかし、彼らは、その間隔は、周波数、および複製フォークとの衝突はめったに特徴付けされていない病変を生成します。ここでは、レーザーローカライズ間架橋と、これらのパラメータの決意を可能にアプローチを説明します。

要約

DNA損傷応答（DDR）が広範囲に生細胞におけるレーザーマイクロビーム照射による二本鎖切断（DSB）の研究で特徴づけられています。 DDRは、ストランド間のDNA架橋（のICL）を含む共有結合性DNAの修飾を歪まヘリックスするために、同様に定義されていません。私たちは、生きた細胞の核に、immunotaggedソラレンのレーザー光活性化により、ローカライズのICLによって刺激DDRを、研究してきました。付加物の分布と複製フォークの出会いについての基本的な問題に対処するために、我々は他の二つの技術とレーザー局在を組み合わせます。 DNAの繊維は、多くの場合、短いパルスの間に組み込まれたヌクレオシド類似体の免疫蛍光による複製フォークの進行状況を表示するために使用されます。 Immunoquantumドットが広く、単一分子イメージングのために使用されてきました。新しいアプローチでは、レーザ局在のICLを有する細胞からのDNAの繊維は、顕微鏡スライド上に拡散されます。タグ付きのICLはimmunoquantumドットと目に表示されます電子間の病変の距離が決定します。 ICLと複製フォークの衝突を可視化することができ、さまざまな出会いのパターンを識別し、定量化しました。

概要

DNAはまた、それはまた、酸化的代謝によって産生される内因性ラジカル種に襲われるなど、放射線、紫外線、環境有害物質、燃焼生成物、などの外因性物質から一定の攻撃の下にあります。これらのすべては、化学的または物理的DNA ¹の完全性を破壊する可能性があります。ゲノムにおける摂動は、病変の修復に関与するタンパク質とマイクロRNAのない場合は、何千、何百ものDNA損傷応答（DDR）、リクルートおよび翻訳後修飾カスケードを活性化することができ、細胞周期、アポトーシス、老化、および炎症経路の調節^2。

DDRについての私たちの情報のほとんどは、DSBは用いた研究から来ています。これは、生きた細胞³のゲノムDNAに、配列特異的な休憩を含め、休憩を導入するための技術の利用可能性に大部分です。また、propensit免疫蛍光法によって表示することができDDRタンパク質、巣を誘導する切断のyは、タンパク質の応答の動態と要件を識別するために非常に役立っています。 DDRを研究するための重要な技術の一つは、生きた細胞⁴の核に「関心領域」にDSBのストライプを指示する（ROI）のレーザービームを使用ボナーや同僚、によって導入されました。実際に、彼らはDDRのタンパク質が免疫蛍光法によって識別することができたに長....