次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

要約

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

要約

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

概要

CD4 ⁺ T細胞は、適応免疫応答の重要なオーケストレーターです。ナイーブCD4 ⁺ T細胞は、いくつかの異なるエフェクターT細胞（ 例えば TH1、TH2、Th17細胞、 等 ）に現像することが可能である、局所微小環境¹に依存特性サイトカインおよび転写因子の独自のセットをそれぞれ。 T細胞が作る系譜の決定は、自己に対する防御免疫と寛容の両方のために重要です。 Th17細胞は、細胞外細菌および真菌に対抗することが知られているT細胞のサブセットであるが、その不適切な応答はまた、多発性硬化症および乾癬^2、3のように複数の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因に関与しています。ヒトTh17細胞は、適切な偏光環境⁴とそれらを提供することにより、in vitroでのナイーブCD4 ⁺ T細胞から生成することができます。バリオ私たちのサイトカインIL-1βの組み合わせ、IL-23、TGFβ、及びIL-6は、人間のTh17細胞の発達のために使用されています。ヒトTh17細胞はCCR6、一般的にこの細胞集団を同定するために使用され、それらの主要な転写因子、（RORCによってコードされる）の^RORγt5、6の式で定義されるケモカイン受容体を発現します。 Th17細胞は、複数のサイトカインを発現する能力を有するが、IL-17Aは、これらの細胞によって産生さ系統規定エフェクターサイトカインです。私たちは、ヒトTh17細胞のin vitro分化アッセイの頑健性を評価するために、3つのすべてのTh17関連マーカー（CCR6、のRORγt、IL-17A）の発現を調べました。また、我々は、これらのTh17マーカーの発現が非常に低いかまたは存在しないなければならないので、何のサイトカインまたはブロッキング抗体を陰性対照として使用するために培地に添加しなかった非分極条件下でヒトCD4 ⁺ T細胞を培養しました。

ve_content ">正常ヒトT細胞の発達及び生物学を研究する1つの方法は、開発中の遺伝子発現を操作することである。短干渉RNA（siRNA）は、タンパク質をコードするmRNAを標的とする合成小RNA分子であり、特定の遺伝子の発現を減少させるために利用することができます。マイクロRNA（miRNA）は転写後遺伝子発現を調節することが知られている内因性の非コード小型RNAである。miRNAは、Th17細胞^7、8、9に含め、マウスおよびヒトT細胞生物学の両方で重要な役割を果たしていることが示されている。これは、遺伝子発現に及ぼす影響を研究するために、ヒトT細胞の小さなRNAの活動を操作し、最終的にはヒトT細胞生物学上の信頼性の高い方法を持つことが重要です。ここでは、我々は我々が導入するために開発さ簡単に使用できる、一貫性と信頼性プロトコルを記述小さな合成RNAおよびロックされた核酸（LNA、増大した安定性を有する化学的に修飾された核酸）免疫細胞への、そして、ヒトTh17細胞へ。

一般に、化学、生物学的、または物理的なカテゴリ¹⁰に分類された哺乳動物細胞、内低分子RNAを導入するいくつかの代替方法があります。脂質ベースのトランスフェクション、およびリン酸カルシウムのトランスフェクションを含む一般的に使用される化学的方法は、より効率的に細胞に取り込まれている化学-DNA複合体を作成することに依存しています。一般的に、化学的方法は、一次T細胞のトランスフェクション用として効率的ではありません。最も一般的な生物学的方法は、直接的にその天然の複製サイクルの一部として宿主に外来RNAを挿入するウイルスベクター（ 例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス）を使用することです。ウイルス形質導入は、一般的にプロウイルスプラスミドの分子クローニングのための時間にする場合は特に1つの要因、完了するまでに時間がかかります。また、ウイルス形質導入ベクターとしては、人間の研究者に対して潜在的に有害であり得ます。エレクトロポレーションは、物理mで核酸は一過性に、彼らは彼らのターゲットに作用することができセルに入力することができ、高電圧パルスに細胞を付すことにより、膜透過性を誘導するethod。従来のエレクトロポレーション機器は、初代リンパ球をトランスフェクトするための効果的ではなかったです。しかし、最適化された次世代のエレクトロポレーションは、トランスフェクトされる材料は、小さいRNAである場合は特に、非常に高い効率でT細胞をトランスフェクトすることができることが証明されています。用語次の世代は緩く、伝統的なエレクトロポレーションマシンから2つの新しいプラットフォーム（ 例えば 、ネオン、AMAXA）を区別するために使用されます。また、この方法は、多くの場合、検証合成試薬を用いて単一の実験で最大約120小RNAと中程度のスループットスクリーニングのために容易に拡張可能です。重要なことに、成功したトランスフェクションは、T細胞活性化後にわずか16のような時間で達成することができます。この方法の欠点は、しかし、それは安定したゲノムincorporatiが生じないということです上、したがって、一過性です。したがって、ウイルスベクターにパッケージングされ、正常に小さなRNAの長期発現が必要とされる場合にはT細胞で発現させることができる安定した発現構築物を作成するために余分な労力の価値があります。

我々は、異なる目的の^11、12、13のために多様な合成一本鎖または二本鎖RNA又はLNAオリゴヌクレオチドのツールを提供する次世代のトランスフェクション（ 例えば 、ネオン）を使用しています。効率的なRNA干渉は、二本鎖短干渉RNA（siRNA）を使用して、一次マウスおよびヒトT細胞において誘導することができます。このプロトコルは、ヒトTh17細胞は、この技術を使用するための最適化された条件を記載しています。 siRNAに加えて、市販の合成miRNA模倣剤および阻害剤は、機能のmiRNAの利得及び損失を研究するために使用することができます。 miRNA模倣は、siRNAと非常に類似した二本鎖RNA分子であるが、デザイン性は、内因性の成熟miRNAの配列とD。 miRNA阻害剤は、化学的に修飾されたRNAおよび/または天然のmiRNAに結合し、その機能を拮抗するLNAベースの一本鎖オリゴヌクレオチドです。私たちは、これらのツールのすべてを含めて、初代培養Tリンパ球に効果的に使用されるが、人間のTh17細胞に限定されないことができることを見出しました。

プロトコル

このプロトコルは、人間研究倫理のためのUCSFのガイドラインに準拠しています。

T細胞培養、CD4 ⁺ T細胞の単離、及びのTh17分極の調製

1. 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3（2μg/ ml）および抗ヒトCD28（4μgの/ mL）をウェル当たり1.5mLの0日目に、コート6ウェル組織培養プレート37°C。
   1. 代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。
2. 製造者の指示に従って、密度勾配遠心分離によって臍帯血単核細胞（CBMCs）を準備。
   注意：慎重に作業し、血液媒介病原体への曝露のリスクを回避するために、ヒトの血液を取り扱う際に着用され、適切な個人用保護具（PPE）を確保。
3. 単核細胞を単離し、洗浄した後、負SELEによるヒトCD4 ⁺ T細胞単離を行います市販のヒトCD4 ⁺ T細胞のキットを使用してction。
   注：単核細胞の単離後に赤血球の混入がある場合、オプションの赤血球の溶解がCD4 ⁺ T細胞単離工程の前に行ってもよいです。分離緩衝液（PBS中2％FBS）1mLの単核細胞を再懸濁します。 1X溶解溶液5mLを加えます。室温で15分間インキュベートします。次いで、細胞をペレット化し、4℃で5分間、300×gで分離緩衝液及び遠心分離機の5ミリリットルを加えます。
   1. 新しい5mLのチューブに分離バッファー500μLあたり50×10 ⁶の密度で単核細胞を再懸濁します。
   2. FBSの100μL、次いでよく混合するオービタルシェーカー上で20分間、4℃で各チューブをインキュベートチューブ当たり抗体混合物の100μLを加えます。
   3. インキュベーション後、細胞を洗浄し、分離緩衝液の3-4 mLを加え。細胞をペレット化し、4℃で8分間、300×gで細胞を遠心分離。慎重にsupeを吸引rnatant。
   4. このスピンの間に、磁気ビーズを事前に洗います。ビーズを洗浄し、分離緩衝液の等量を追加します（細胞と1：1で使用）を新しいチューブに磁気ビーズの所望の量を転送します。 1mLのマイクロピペットを用いてよく混合した後、少なくとも1分間磁石中に管を置き。注意深く上清を吸引除去します。最初の前洗浄に移し、同じボリューム内の磁気ビーズを再懸濁。
   5. 分離緩衝液500μlで各チューブに細胞を再懸濁し、予め洗浄した磁気ビーズの500μLを加えます。
   6. よく混合するために室温（25°C〜18°C）でオービタルシェーカー上で15分間、磁気ビーズで細胞をインキュベートします。
   7. インキュベーション後、十分少なくとも10倍1mLのマイクロピペットを用いて細胞をピペット。次いで、分離バッファー3-4 mLを加え、2分間磁石中に各管を配置します。
   8. 慎重にある負の選択CD4 ⁺ T細胞を転送します新しいチューブに上清。
4. CD4 ⁺ T細胞の分離が完了すると、血球計数器で細胞をカウントし、氷上で細胞を維持します。
5. PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。抗ヒトIFNγ（20μgの/ mL）を、抗ヒトIL-4（20μgの/ mL）を、ヒトTGFβ（10ng / mLの）、ヒト：次いで、各ウェルへのTh17分極媒体の2X混合物1.5 mLを加えIL-1β（40 ngの/ mL）を、ヒトIL-23（40 ngの/ mL）を、ヒトIL-6（50ng / mlの）すべて2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地（100で希釈しましたU / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール）。
   注：トランスフェクションおよびRNA干渉は、血清含有培地中で作業を行います。このプロトコルを無血清培地を使用する目的は、より優れたIL-17Aの生産を達成することです。
6. 遠心分離機4℃で5分間、500×gでのヒトCD4 ⁺ T細胞は、細胞をペレット化します。慎重supernatを吸引蟻。その後、無血清基本培地中で細胞を再懸濁し、最終容量をウェル当たり3ミリリットルであり、偏光サイトカインが1×最終濃度で今であるように、ウェル当たり1.5mLの中に3×10 ⁶の密度で細胞をプレート。
   1. 5％CO _2、2日間37℃のインキュベーターにプレートを置きます。

2.エレクトロポレーションインビトロの極性ヒトTh17細胞

1. 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3（2μg/ ml）および抗ヒトCD28（4μgの/ mL）をウェル当たり250μLと2日目に、被覆48ウェル組織培養プレート37°C。
   1. 代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。
2. トランスフェクションのために小さなRNAを準備します。各トランスフェクションのために、1.5mLの微量遠心管へのsiRNAの5μMストック溶液のアリコートを1μL。適切な化学マッチした小さなRNAのCONTRを含めますオール。氷の上のすべてのチューブを保管してください。
3. PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。 、抗ヒトIFNγ（を10μg/ mL）を、抗ヒトIL-4（10μgの/ mL）を、ヒトTGFβ（5 NG / mL）を、ヒトIL-：次いで、各ウェルに1×のTh17分極媒体の500μLを加えます1β（20ng / mlの）、ヒトIL-23（20ng / mlの）、ヒトIL-6（25 ngの/ mL）を全て2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地（100 Uで希釈します/ mLのペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール）。
4. 培養プレートおよびトランスフェクション試薬を調製した後、穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、1 mLのマイクロピペットで細胞を再懸濁します。 4℃で5分間、500×gでコニカルチューブと遠心分離機に細胞をプールします。
   注：本明細書で提示する4日間のプロトコルよりも長い培養期間のために、細胞は、この同じプロトコルを使用して、3日毎に約トランスフェクトされなければなりません。ステップ2異なる低分子RNAで処理した細胞をプールすべきではないので、0.4しかし修飾されなければなりません。テストされた条件のすべてが、収集し、計数し、個別にトランスフェクトされなければなりません。
5. 注意深く上清を吸引し、その後洗浄するPBSの少なくとも1 mL中に細胞を再懸濁。その後、マイクロ遠心チューブに細胞を移す（生存率を評価するためにトリパンブルー排除を使用して、血球計など ）のライブTh17細胞を数えます。
6. 細胞をペレット化し、室温で5分間、500×gで遠心します。
7. 注意深く上清を吸引し、その後、mL当たり2.5〜4×10 ⁷細胞の密度でトランスフェクションシステム10μLキットから提供再懸濁緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。室温で細胞を保管してください。
   注：ガイドラインとして、30分以内にトランスフェクトすることができるようにのみなど、多くの細胞を調製してみてください。複数のバッチを比較することができます。
8. それぞれのMicroCに小さなRNAの1μLに細胞の9μLを追加entrifugeチューブ。ピペットは、一度に設けられピペット電極チップにロードし、次いでトランスフェクションのための細胞および小RNAを混合します。
   注：典型的には、トランスフェクション前にピペット電極先端に泡を作成防ぐために混合物の十分があることを確認するために、細胞懸濁液の9.5μLを加えます。
9. 室温電解バッファE.プレイス3mLのピペットステーション内部キュベットを備えたキュベットを充填した後、キュベット内の位置にピペットを配置します。
10. 以下のパラメータを使用して、細胞および小RNAの直ちにエレクトロポレーション各10μLミックス：パルス電圧1,500-1,550 Vを、パルス幅10ミリ秒、及び3つのパルストランスフェクションデバイスに合計します。
11. エレクトロポレーションが完了した後、直接培養プレートの調製ウェルに1XのTh17分極媒体の500μLに細胞混合物を加えます。 5％CO _2、さらに2日間37℃のインキュベーターに入れプレート。
    注：ピペットでピペット電極チップを洗います上下PBS中で各トランスフェクションの間です。

3.収穫ヒトTh17細胞

1. 穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、マイクロピペットで培養培地中で細胞を再懸濁。機能的および/または遺伝子発現アッセイのための細胞を調製します。
   注：定期、十分な細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析および転写因子染色のために、または遺伝子発現分析のためのRNAの調製のために使用されるトランスフェクトされたTh17細胞の単一のウェルから得られています。

結果

正常ヒトTh17細胞をエレクトロポレーションの信頼性の高いシステムを開発するための最初のステップは、 インビトロ分化ヒトのTh17細胞培養におけるロバスト生成することでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、ケモカイン受容体CCR6および転写因子のRORγt（ 図1A、左）を発現しました。 T細胞は（右図1A）非偏光（THN）条件下で?...

ディスカッション

このプロトコルは、ヒトTh17細胞への小RNAの送達のための改良された方法を提供します。ヒトTh17細胞は、ここで使用されたが、低分子RNAとエレクトロポレーションのこの方法は、TH1、TH2及びTregのような他の初代ヒトTヘルパーサブセットと共に使用することができます。細胞はトランスフェクションの前に培養して活性化されなければならないので、ナイーブCD4 ⁺ T細胞についてうまく...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use