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要約

このプロトコールの目的は、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置および免疫染色を実証することである。この技術は、聴覚研究におけるインビトロスクリーニングツールとして利用することができる。

要約

過去数十年間にわたり聴覚研究において顕著な進歩があったが、内耳の繊細な機械感覚構造の損傷または喪失を典型的に伴う状態である感音神経難聴（SNHL）の治療法はまだない。近年、精巧なin vitroおよびex vivoアッセイが出現しており、SNHLの治療法を開発するためのリソースを最小限に抑えながら、潜在的治療化合物のスクリーニングを可能にしています。特定の細胞型の均質な培養物が現在の研究において重要な役割を果たし続けているにもかかわらず、多くの科学者は現在、蝸牛外植片としても知られているより複雑な器官型の内耳細胞培養に頼っています。内耳内の組織化された細胞構造の保存は、内外の有毛細胞、らせん状神経節ニューロン、神経細胞を含む蝸牛インフルエンザの様々な成分のin situ評価を容易にするites、および支持細胞。ここでは、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置、および免疫染色を提示する。これらの外植片の注意深い準備は、SNHLに寄与する機構の同定を容易にし、聴覚研究共同体にとって貴重なツールとなる。

概要

感音神経障害（SNHL）は、内耳または上行する聴覚経路への損傷を反映する。難聴はヒトの最も一般的な感覚障害であるが、治癒療法はまだ存在していない2 。蝸牛や聴覚の脳幹インプラントは、重度から重度のSNHLの患者にある程度の聴覚を回復することができますが、これらの装置で提供される聴力は、特に聴覚の発声を理解したり、音楽を聴いたりする試みにおいて、

毛細血管変性は長い間、外傷性聴覚事象（ 例えば、大きな騒音への曝露）の主な結果と考えられているが、有毛細胞から聴神経へ情報を伝達するシナプスは少なくとも音響外傷3 と同様に脆弱であるという証拠が増えている3 、 4,5 > 、 6 。聴覚機能の評価のための現行の金標準である人間の聴力検査閾値は、内耳の特定の細胞損傷を予測しないので、細胞変性をできるだけ早期に検出し、適切な治療を開始するためにより洗練されたツールが必要です。

難聴のための有望な薬学的治療は、しばしば、インビトロでの均一な細胞培養物について試験されるが、このようなシステムは、蝸牛の微小環境を正確にモデル化しない。蝸牛細胞は、Corti 10,11またはSpiral Ganglion Neurons（SGN） 12の臓器を単離培養したときに失われる重要なインビボ過程である蝸牛8,9内の他の細胞型に影響を及ぼす栄養因子を分泌することが知られている分子マーカーを分析するしかしながら、「精密医学」の追求において、難聴のための新たなパーソナライズされた治療法を確立するためのインビトロデータの検証に必要であり得るインビボ研究は、かなりの資源と時間を必要とする。聴力検査とその後の蝸牛全体装着の中耳または円形窓膜注入を完璧に行うためにどれだけの労力が必要ですか？蝸牛外植体として知られている器官型ex vivo培養物の有望な化合物の効率的なスクリーニングは、 14,15,16,17 。

この記事では、治療された蝸牛外植片を生成、維持、評価するためのプロトコルについて詳述します。スクリーニングでの使用を含むこのモデルの特定のアプリケーションが強調されています遺伝子治療のためのウイルスベクターの比較評価を含む。 エクスビボでの外植片アプローチにより、研究者は、異なるタイプの細胞集団に対する所定の治療の効果を現場で視覚化し、細胞型特異的機構の同定およびその後の標的化治療の洗練を容易にすることができる。

全体的に、この技術は、蝸牛内に共存する非常に異なる細胞タイプ間の重要なクロストークを維持しながら、 生体外で蝸牛を研究するモデルを提供する。

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プロトコル

この研究プロトコールは、マサチューセッツ州の眼および耳の施設動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認された。実験は世界医師会の倫理規定に従って実施された。

1.解剖の準備

  1. 手術テーブルの準備
    1. 70％エタノールを使用して外科用テーブルを消毒する。
    2. 2つの非滅菌準備パッドを顕微鏡の隣に置きます。
    3. 熱殺菌した手術用ハサミ、メスハンドル、マイクロナイフ、鉗子（＃4と＃55の2つずつ）を含む計器トレイを準備します。器具トレイと50mmの透明壁のガラス底ペトリ皿を1つの非滅菌パッドに置きます。
    4. 無菌の＃15メス刃を得る。密封可能なプラスチック製の袋または容器（制度上のガイドラインに沿って死体を処分するため）。バケツの氷;冷たい滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む。これらのアイテムを他の非滅菌パッド。
    5. HBSSを50 mLのプラスチック試験管に移し、氷上に置きます。
  2. 文化の準備
    1. すべての材料を層流フードで準備する。 4つの標本ごとに、35mm4ウェルペトリ皿の4つのインレーに4つのオートクレーブ処理した10mmの丸いガラスカバースリップを入れる。
    2. 4つの標本ごとに、以下のものからなる300μLの全量を微量遠心チューブに混合する：組織接着剤10μL、NaHCO 3285μLおよびNaOH5μL。
    3. 得られた溶液45μLをすべてのカバースリップに入れ、室温で少なくとも20分間放置する。この溶液は数時間カバースリップ上に放置することができるが、O / Nを放置することはできない。
    4. コンタミネーションに対する2つの障壁を作り出すために、1つまたは2つの35mm 4穴ペトリ皿を10cmのペトリ皿の中に置きます。
    5. 98％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、1％N-2、および1％アンピシリン（（マイクロ）遠心分離管内で1ウェルあたり65μL）で洗浄した。使用前に25℃に加温してください。

2.マウスの蝸牛外植片の解剖

  1. 新生児マウスの断頭
    1. 60 mmのプラスチックペトリ皿を用意し、蓋に70％エタノールをスプレーして、表面が濡れるようにします。
    2. 冷たいHBSSをプラスチック製の実験室チューブから60mmのプラスチックの底部と50mmの透明なガラス底のペトリ皿に注ぎます。解剖されていないときはいつでも組織を冷たく保つために、プラスチック実験室管と両方のペトリ皿を氷上に保管してください。
    3. P3-P5歳の新生児マウスをラテックス手袋の切れた指の氷上に置き、低体温が意識消失（約1〜3分）を引き起こすまで待つ。
    4. 操作はさみでマウスをすばやく断頭し、シール可能なビニール袋に体を処分する。切断された新生児の頭を60mmのプラスチックシャーレの蓋の中の70％エタノール。
  2. 側頭骨の巨視的切開
    1. メスの刃を使用して、前端から後端（矢状縫合の上に直接）から表面切開を作ることによって、頭蓋骨の皮膚を除去する。
    2. 外耳道の両方をメスの刃で切って、皮膚を前方に折り畳んで頭蓋全体を露出させます。
      注：このステップには通常、解剖顕微鏡は必要ありませんが、視覚化を改善するために使用することができます。
    3. ＃15メス刃を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開きます。蝸牛の圧迫を避けるために、刃を前方から後方へ静かに上下に動かして頭蓋を切断してください。
      注：頭蓋骨はこの年齢で骨化してはならず、簡単に切るべきです。
    4. ＃15メスを使用して、軌道の直後の垂直カットを作成して、スナウトを取り出して破棄します刃。
      注：頭蓋骨の後部にはまだ脳と蝸牛が含まれているはずです。
    5. ＃4鉗子で鈍的切開を行い、前脳、小脳、および脳幹を処分する。
  3. 蝸牛の微視的抽出
    1. スコープの下に鉗子を置き、照明と焦点を最適化することによって顕微鏡（倍率6.5倍）と光源を調整します。
    2. 冷たいHBSSで満たされた60mmプラスチックペトリ皿に頭蓋の2つの半分を置きます。
    3. 周囲の静脈動脈（側頭骨内の曲がりくねった動脈）に隣接していると同定できる蝸牛/ eを完全に露出させ、＃4の鉗子を用いて臓器を側頭骨から鈍く分離する。
    4. 蝸牛を50mmの透明なガラス底のペトリ皿に移し、顕微鏡の下に置く。
    5. 氷上に頭蓋の他の半分と60ミリメートルのプラスチックシャーレを置きます。
    6. 蝸牛を前庭系から取り出し、＃4の鉗子で蝸牛耳の嚢（典型的には軟骨性）を慎重に切開する。それ以降のすべてのステップで＃55鉗子を使用してください。
  4. 組織処理の最終ステップ
    1. マイクロナイフまたは2つの鉗子を用いて、コルチ器官に付着した螺旋靭帯を残りの蝸牛および神経節から注意深く分離することにより、内耳組織の処理を続ける。
      1. 螺旋靭帯と有毛細胞領域との間の隙間のより暗くて半透明な領域に切断し、螺旋靭帯を最も基本的な側面で把握し、尖った方向に動いている間にゆるやかに引き離すことに続く。
    2. 検体を配置して、蝸牛の長手方向矢状図を取得し、マイクロナイフを用いて蝸牛を2〜3つの切片に切断し、これらの切片を頂端、（中央、）およびbアナルターン。ペトリ皿に水平に横たわることができる蝸牛外植片を達成するために、有毛細胞および神経突起の実際の層と上および下組織を除去する。
      注記：培養皿への安定した接着のための適切なサイズは、1つの蝸牛ターンの約半分である。
    3. 腹膜を静かに剥がして、コルチ器官のすぐ上の非常に薄い半透明の層である房膜を取り除く。
    4. Reissnerの膜をすぐにSGNよりも優れたものにし、両側に鉗子で触れ、剥がしてください。
      注：横に位置する損傷した有毛細胞領域をマイクロナイフで切り取って取り除きます。

3.検体の培養プレートへの移送

  1. 4つのカバースリップから45μLの組織接着剤溶液を除去する。各カバースリップを50μLの滅菌H 2 Oで洗浄する。水を吸引する。
  2. 1 mLのピペットを拾います。試料がチップの内側に付着しないように、約120μLのDMEMでピペットチップを濡らします。
  3. 1 mLピペットを用いて検体を個別に移す。 HBSSで満たされた、小さくて透明なガラス底のペトリ皿から最大70μLをピペットで取り、4ウェルのペトリ皿に4つのインレイ（カバースリップで調製）の1つに液体と共に試料を置く。
  4. 標本の向きが正しいことを顕微鏡（倍率50倍）で確認します。胸膜が除去された有毛細胞の領域が上向きであることを確認する。モディベラのトリムされた基底部分と一緒に、基底膜が下向きになり、カバースリップに付着することを確認する。
    1. 標本が検査の際に上下逆さまになっている場合は、ピペットチップに残っているHBSSをインレイに入れ、正しい方向になるまでピースの位置を変えます。
      NOTE：これは、退化につながる可能性のあるカバースリップからの構造的支持なしに有毛細胞が培地中に浮遊することを防止する。
  5. 1 mLピペットを使用して過剰のHBSSを吸引する。 15秒待ちます。
  6. 調製した暖かい培地（98％DMEM、1％N-2、および1％アンピシリン）60μLを検体に直接ピペットで加える。ピペットで検体に触れないように注意してください。内側および外側のペトリ皿カバーを交換し、37℃でO / Nをインキュベートする。
  7. すべてのストック溶液を適切な場所に戻し、死骸や残留廃棄物を処分し、施設ガイドライン（ 例えば、エタノールや次亜塩素酸塩を使用して）に従って手術テーブルを除染し、器具をきれいにしてオートクレーブし、 。

4.最終的な培養培地および対象物質の追加

注：蝸牛外植片は、10-16時間後に使用する準備ができている。

  1. 混合物を準備する97％DMEM、1％ウシ胎児血清（FBS）、1％N-2、および1％アンピシリン（マイクロ遠心管内のウェルあたり65μL;使用前に溶液を25℃に暖める）。
  2. 該当する他の物質を、それぞれの治療グループのソリューションに追加します。蛍光物質（ 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現ウイルス;最近の発表では、10 10 GCのアデノ関連ウイルス（AAV）を50μL中48時間使用した） 18 、光。
  3. 孵卵器から蝸牛外植片を含むペトリ皿を移し、層流フードの下に置く。
  4. インレーからのピペットで古い培地（FBS無し）を吸引する。
  5. 調製した温かい培養（処理）培地（97％DMEM、1％FBS、1％N-2,1％アンピシリン、および対象物質）1ウェルあたり60μLを添加する。
  6. ペトリ皿をインキュベーター（37℃）に戻します。
  7. ビューr細胞の移動、または蝸牛外植片の剥離の兆候を同定し、最大7日後に染色を実施するために、顕微鏡下で公式に観察する。

5.免疫蛍光 - 1日目

  1. ブロッキング溶液（94％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5％正常ヤギまたはウマ血清（2次抗体に応じてNGS / NHS）、および1％非イオン性界面活性剤（ 表の表を参照 ） （98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤をそれぞれの抗体とともに含む）で洗浄した。
    注：抗体には、1：400+（ミオシン7A、内外の有毛細胞用）およびマウス抗TuJ1 1：200+（β-チューブリン、SGN用）またはマウス（IgG1）抗マウス抗体（後シナプス密度）、およびニワトリ抗NF-H1：1000 +（ニューロフィラメント（neurofilament））、抗マウスモノクローナル抗体SGNおよび神経線維の場合）。 "+" means "以上である必要があります。
  2. ピペットを用いて培地を吸引する。検体に触れないように注意してください。
  3. 層流フードの下で、滅菌PBSで蝸牛外植片を2回すすぎ、各洗浄後に5分間シェイカー上に検体を置く。
  4. シェーカー（フードの下）で20分間4％パラホルムアルデヒド（PFA - CAUTION）に組織を固定する。 PFAを吸引する。
  5. 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。
  6. 蝸牛外植片を、シェーカー上で30分間、調製したブロッキング溶液（94％PBS、5％NHS、および1％非イオン性界面活性剤）中に置く。
  7. 蝸牛外植片をRTでのカウンター上の対応する一次抗体（使用前にボルテックス）O / Nを用いて調製ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）に入れる。
    注：ペトリ皿をプラスチック製のラップ（またはアルミ箔）で囲まれた湿ったペーパータオルで包みますGFPを発現するウイルスなどの蛍光物質を含む）を含み、皿を湿潤に保ち、抗体溶液O / Nの蒸発を防止する。

6.免疫蛍光 - 2日目

  1. ステップ5.1で4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色（300nM）を調製し、ストック抗体溶液を使用して一次抗体に相補的な正しい二次抗体混合物を得る。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギ488 1：200+およびヤギ抗マウス568 1：200+ ORヤギ抗マウス（IgG1）568 1：1000+、ヤギ抗マウス（IgG2a）488 1：500+、およびヤギ抗ニワトリ647 1：200+またはファロイジン568 1：200+（内外の有毛細胞用））。
  2. 一次抗体溶液を吸引する。
  3. 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。
  4. 蝸牛外植片を準備ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）にres（使用前にボルテックス）をカウンターで1.5時間インキュベートし、光から保護する。
  5. 二次抗体溶液を吸引し、DAPI染色液（シェーカー上に1分間置いてから吸引する）で蝸牛外植片をすすいでください。
  6. 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。
  7. 鉗子を使用して、4ウェルプレートから検体を含むカバーガラスを取り出し、蒸留水で満たされたレシピエントにそれらを浸し、ペーパータオルに垂直に接触させてカバースリップを乾燥させる。
  8. 顕微鏡スライド上に曇り止め装着媒体の一滴を置き、カバースリップを反転させて、下向きの組織を培地に浸す。
  9. 周りを覆って透明なマニキュアを使用してカバースリップをシールします（ガラスの下に試料を押しつぶすことなく）。乾燥した状態となるまで15〜20分間明かりから覆った部分にスライドを平らにしておきますそれらを箱に入れたり、共焦点顕微鏡の下で検査したりしてください。
    注：蛍光染色は、スライドを4℃または-20℃で保存することで最もよく保存されます。

7.共焦点イメージング

  1. 神経突起およびSGNを含むCorti地域の器官の概要およびズームイン画像を取得します。
    注：イメージングプロセスの標準設定：1,024×1,024ピクセル、400Hzの速度、フレーム平均3、20％の総合レーザー強度、通常20倍および63倍の油浸漬（潜在的に2倍デジタルズームと組み合わせる）。 405 5％DAPI、 "スマートゲイン" 766.8V、 "スマートオフセット" 0.0％〜488 15％のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、 "スマートゲイン" 622.2VのDAPI、Myo7A、およびTuJ1染色プロトコルのチャンネル設定が概説されています。 、 "スマートオフセット" 0.0％ - 561 13％テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、 "スマートゲイン" 562.4V、 "スマートオフセット" 0.0％。
  2. 画像をZスタックにマージするには、ソフトウェアを使用してz軸投影を得る。

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結果

多くのプロトコルがCorti外植片の器官に焦点を当てていますが、この技法はSGNを含む蝸牛ターン全体の解剖学的構造を保存しようとします。これにより、研究者は、Cortiの器官に加えて、SGNの神経突起および体細胞に対する所与の治療の効果を分析する機会を得ることができる。ここに記載されているように、モディオラスの一部を保存する解剖を行うことは、コルチ...

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ディスカッション

研究者は、蝸牛外植物を含む実験を行う前に解剖技術を完璧にしなければならない。有毛細胞は、学習曲線の早期に行われる解剖の間に一般的に損傷を受け、その完全性のための特に問題のある瞬間は、安定した手、適切な道具および経験を必要とする体膜の除去である。時間と資源を節約するために、解剖顕微鏡の下で視覚制御を行うべきであり、潜在的に損傷した領域に注目すべきであ?...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

この作業は、国立難聴者協会のR01DC015824（KMS）およびT32DC00038（SDサポート）、防衛省のW81XWH-15-1-0472（KMS）、Bertarelli財団（KMS）、ナンシーセイレスデー財団（KMS）、ラウアー耳鳴り研究センター（KMS）などがあります。 Jessica E. Sagers氏に感謝の意を表します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin, Sodium SaltInvitrogen11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)BD Transduction Laboratories612044
anti-Myo7A antibody, rabbitProteus Biosciences25-6790
anti-NF-H antibody, chickenEMD MilliporeAB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)Antibodies Inc.75-028
anti-TuJ1 antibody, mouseBioLegend801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mgCorning354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner ringsGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One227261
Clear Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
Distilled water, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 ForcepsFine Science Tools11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5%Sigma-Aldrich459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificR37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mLEMD MilliporeTMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless SteelMountainside MedicalTechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30°Fine Science Tools10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72VWR16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mLThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Normal Horse Serum (NHS)Invitrogen16050130
Operating scissorsRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, CrystallineSigma-AldrichP6148Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
Prep Pad, Non Sterile Medline05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mLEppendorf022363719Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mLEppendorf022363204Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15Fine Science Tools10015-00
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools10004-13
Stemi 2000-C Stereo MicroscopeZeiss 000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscopeLeicaN/A
Triton-X (non-ionic surfactant)IntegraT756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescenceVector Laboratories, Inc.H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thickZipline0609132541599

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