白蝶貝からの内生菌の抽出方法<em&gt;ベミシア・タバチ</em

要約

ここでは、白斑Bemisia tabaciからの内胚葉を切開および濾過により単離するためのプロトコールを提示する。増幅後、DNAサンプルは、その後のシークエンシングおよび内寄生虫とコナジラミ間の共生の研究に適している。

要約

細菌共生生物は、宿主と親密な関係を形成し、ほとんどの場合宿主に利点を与える。ゲノム情報は、宿主における細菌共生生物の機能および進化を研究するために重要である。ほとんどの共生物質はインビトロで培養できないため、ゲノム配列決定のために適切な量の細菌を単離する方法は非常に重要です。コナジラミBemisia tabaciでは、いくつかの内寄生虫が同定されており、複数のアプローチによる有害生物の発生および生殖において重要であると予測されている。しかし、協会を支える仕組みはほとんど知られていません。この障害は部分的に、白癬菌の内在性物質（ほとんどが細菌細胞に抑制されている）が宿主細胞から分離するのが困難であるという事実に由来する。ここでは、主に解剖学的検査によって白癬B. tabaciからの内在性物質の同定、抽出および精製のための段階的プロトコールを報告するオンにして濾過する。この方法によって調製された内毒素試料は、依然として異なる内毒素種の混合物であるが、その後のゲノム配列決定およびバチルス・タバチにおける内在性の可能な役割の分析に適している。この方法は、他の昆虫から内生菌を単離するためにも使用することができる。

概要

節足動物^1では 、相対的な宿主と密接な共生関係を形成する細菌が広がっている¹ 。内分泌攪乱物質は、栄養代謝、繁殖、環境ストレスへの応答2,3、4などのような宿主の局面にほとんど全ての発育段階⁵において影響を及ぼすことが実証されている⁵ 。しかし、協会の基盤となる仕組みはまだほとんど知られていません。ゲノミクスは、細菌の潜在的な機能と役割を研究する際に重要かつ重要です。いくつかの基本的な情報、 すなわち 、分類学的状態、機能遺伝子、代謝経路、分泌系は、共生している共生生物の潜在的役割についての光を放出するゲノム配列から推測することができる。ハイスループット配列決定の開発により、膨大な数の細菌ゲノムが配列決定されている様々な機能を明らかに⁶ 。

内寄生虫は、アブラムシ⁷ 、ナンキンムシ⁸ 、オオバコ⁹ 、褐斑病¹⁰および蝉¹¹などの半翅類において極めて重要である。例えば、アブラムシのBuchneraは、必須の共生生物として、アブラムシのゲノム¹²由来の遺伝子とともに、必須のアミノ酸生合成に関与することが示されている。さらに、 ブフネラ（Buchnera）の転写調節もまた明らかにされている¹³ 。 オオバコでは、 Carsonellaが配列決定され、今までに発見された最小の細菌ゲノムにランクされている¹⁴ 。これらの内在性の特徴はすべて、ゲノム配列に基づいて推測されます。これらの内在性物質はインビトロで培養することができないので、seqのために適切な細菌を単離するためにいくつかのアプローチが適用されている覚醒する。アブラムシでは、遠心分離および濾過により内腔菌を抽出し、さらなるゲノムおよび転写分析に供する⁵ 。褐斑病菌では、昆虫ゲノム¹⁰全体とともに内生菌が配列決定される¹⁰ 。

Whitefly B. tabaciは、35種以上の形態学的に区別不能な種（潜在種）を含む種複合体であり、そのうち2種の侵略種が世界中に侵入し、農業生産に多大な害をもたらした¹⁵ 。注目すべきことに、 B. tabaci種内の内在性物質は、害虫^16の発生において重要であることを示している。今日まで、8種の内在性物質が、 ハリネリチア 、 リケッチア 、 アルセノフォヌス 、 カルディニウム 、em> Wolbachia、 FritschaおよびHemipteriphilusは、17,18を定義した。

以前に記載された半体とは異なり、コナジラミB. tabaciはわずか1mmの非常に小さな昆虫である。ほとんどの内在性物質は、バクテリア細胞¹⁹ （B細胞において細菌をさらに形成する共生物質を含む特殊細胞）に限定される。さらに、これらの内在性物質はインビトロで培養することができない。バチルス・タバチ（ B. tabaci）から内寄生虫を得るための唯一の方法は、細菌を解剖することである。しかし、解剖が困難である。第一に、脆弱な細菌は、常に分離するのは難しい白蝶の他の組織とつながります。第二に、白蝶の小さなサイズは、十分な細菌の分離を制限する。第3に、内在性細菌は細菌の中に集まり、単一の細菌種を獲得することを非常に複雑にする。

プロトコル

1.白蝶貝の飼育と種識別

1. 27±1℃、湿度70±10％、光14時間：暗期10時間の標準条件下で、カゴGossypium hirsutum （Malvaceae）（cv。Zhe-Mian 1973）をカゴで維持する。
2. 個々の成熟白コショウを集め、30μLの溶解緩衝液（10mMトリス、pH8.4,50mM KCl、0.45％[wt / vol] Tween-20,0.2％[wt / vol]ゼラチン、0.45％[vol / vol]ノニデットP40,60μg/ mLプロテイナーゼK）。
3. ホモジネートを65℃で1時間インキュベートし、次に100℃で10分間インキュベートする。
   注：65℃でのインキュベーション時間は必要に応じて増やすことができます。 100℃でのインキュベーション時間は、Proteinase Kを十分に不活性化し、DNA損傷を避けるために厳密に制御する必要があります。
4. ミトコンドリアシトクロムオキシダーゼIプライマーに基づいて、whitefly DNA（セクション1.3で得られた）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。
   COI-F：5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
   COI-R：5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '
   1. 1UのTaq DNAポリメラーゼ、10μlのBuffer、0.2mMのdNTP、0.2mMの各プライマー、2μLのwhitefly DNAを含む25μLの最終容量でPCR反応を行います。
   2. 95℃で3分間の変性後、95℃で45秒間（変性）、50℃で45秒間（アニーリング）および72℃で1分間（伸長）の35サイクル、およびさらなる伸長のために72℃でさらに10分間。
5. DNAゲル抽出キットを使用してPCR増幅産物を推奨プロトコールで洗浄します。
6. 精製したDNAサンプルをDNAサンプルシークエンシングシステムで、製造者の指示に従って配列決定する。
7. Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）を使用してシークエンスの潜在種を特定し、他の種の汚染を避けるために配列を分析するes。

2.内分泌攪乱の同定と局在化

1. 白蝶状DNA（ステップ1.3で取得）にPCRを行い、白蝶内の各内毒素の特定の遺伝子を増幅する（PCRレシピはセクション1.4に記載されており、PCR手順およびプライマーは表1に記載されている ）。
2. 以前に公表されたプロトコール²⁰ （1％アガロースゲル、ランニングバッファーとしてTris-アセテート-EDTA、電圧5V / cm）に従って増幅した試料をアガロースゲル電気泳動に付して、各細菌の特異的遺伝子を同定する。
3. 白い葉の中の細菌種を決定するために、各バンドを回収し、配列決定する（1.5-1.7節参照）。
4. 以前に公表されたプロトコール¹⁹に従う、内腔の位置を同定するために、ウンシュウの蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を実施する。
   注：必要に応じて蛍光プローブの濃度を上げてください。

透過型電子顕微鏡（TEM）

1. 2.5％[vol / vol]グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）中に白鳥を4時間浸漬して固定する。
2. リン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）中でサンプルを3回、毎回15分間洗浄する。
3. 1％[wt / vol] OsO ₄を含有するリン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）に試料を2時間浸して再度固定する。
4. 毎回15分の段階的なエタノール（30％、50％、70％、80％、90％、95％および100％）で試料を脱水する。
5. サンプルを100％アセトンに20分間浸して浸します。
6. サンプルを100％アセトンと100％Spurr樹脂（1：1）との混合物中に室温で1時間置く。
7. 試料を100％アセトンと100％Spurr樹脂（1：3）の混合物に室温で3時間移す。
8. サンプルを100％Spurr樹脂（70℃でインキュベート）に9時間以上浸して浸します。
9. 白を用いて、マイクロを用いてサンプルを切る私に。
10. 絶対ウラニルアセテートに5〜10分間浸漬し、続いて50％アルカリ性クエン酸鉛にさらに5〜10分間浸漬することにより、超薄膜（セクション3.9で得たもの）を染色する。
    注：セクション3.1-3.10で利用されている試薬の量は、サンプルによって異なります。サンプルが試薬に浸されていることを確認してください。
11. 透過型電子顕微鏡（15,000X）でサンプルを観察し、さらなる使用のために細菌の局在、形状およびサイズを決定する（セクション4.6を参照）。

4.白蝶菌の解剖および精製

1. 1倍PBS溶液100μLを顕微鏡スライドに加える。綿の葉から3〜4齢のニンフをとり、PBS溶液に浸します。
2. 実体顕微鏡下で細かい昆虫の針を使用し、白蝶身からバクテリアを引き出します。
   1. ゆっくりとニンフの片側の穴を切り、もう一方を少し押してくださいバクテリオミセスを排除するための側面。
3. 0.5-10μLピペットで20μLのマイクロローダー（細菌のサイズに合うように先端を切断したもの）をマウントする。個々のバクテリオミウムをPBS溶液からマイクロローダーに抽出する。
4. 細菌溶液を洗浄して、細菌溶液をPBS溶液にピペッティングし、細菌を抽出することによって、他の白癬組織の汚染を除去する。 3回繰り返します。
5. 直ちに、洗浄した細菌を60μLの1×PBS溶液を含む遠心管にピペットで移す。
6. 組み立てたバクテリオロームを5μmのフィルター膜（バクテリアのバクテリアと核の大きさで確認）にシリンジでろ過する。混合液をフィルター膜に完全に移動するために複数回繰り返します。
   注：増幅とシークエンシングのより良い結果を得るには、100以上の細菌を集めます。細菌の損失を減らすために1x PBS溶液を使用して最初にフィルター膜をぬらしてください膜に結合する。

Endosymbiontゲノムの増幅

1. いくつかの改変を加えた推奨プロトコールによるDNA増幅キットを用いて、ろ液（主にコナジラミの内胞子を含む）を増幅する。
   1. 血液または細胞からのゲノムDNAの増幅の推奨プロトコールを選択し、その後の実験のために緩衝液D2を調製する。
   2. 1.5μLのろ液（セクション4.6を参照）を遠心チューブに直接添加し、続いて1.5μLのBuffer D2を加えよく混合します。
   3. 氷上で10分間インキュベートし、停止液1.5μLを加える。
   4. 15μLの反応バッファーと1μLのDNAポリメラーゼを添加し、穏やかに混合する。
   5. 混合物を30℃で16時間インキュベートし、続いて65℃で3分間インキュベートする。
2. bac用に設計された特異的プライマーを使用することにより、増幅された濾液上で直接PCRを実施する（必要に応じて増幅されたサンプルを希釈する）細菌種を確認するために使用した（2.1節参照）。
3. 以前に公表された方法²¹ （PCRレシピはセクション1.4に記載されている）に従ってwhitefly遺伝子ベータアクチンおよびEF1プライマーを使用することによって宿主ゲノムの汚染があるかどうかを確認するためにPCRを行う。

6.エンドサイトーシスメタゲノム配列決定

1. 配列の前に増幅されたろ液を分光光度計と蛍光光度計（製造元の指示に従う）に供して、試料の品質および試料が配列決定の基準を満たすかどうかを試験する。
2. 増幅したものを製造者の指示に従ってゲノムシーケンサーに供する。

結果

ここでは、 B. tabaci複合体の中東アジアマイナー1（MEAM1）種を例として取り上げた。コナジラミを飼育するためのコットンおよびコナジラミのいくつかの発生段階を、 図1に示す。コットン植物、成虫コナジラミ、およびコナジラミの第1、 ^第 2 ^および第 4齢の幼虫（第3齢の幼虫は^第 4齢の幼虫と同様に見える）。第...

ディスカッション

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polymerase	Takara	R001A	including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit	Qiagen	28704
DNA sample sequencing system	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
Transmission electron microscopy	Hitachi	H-7650 TEM
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL microloader	Eppendorf	F2771951
Filter holder	Millipore	SX0001300
Filter membrane filter	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Genome Sequencer	Illumina	Hiseq 2000