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要約

本稿では、「クロックスキャン」画像解析用の2つの新しいImageJプラグインについて説明します。これらのプラグインは、オリジナルのビジュアルベーシック6プログラムの機能を拡張し、ImageJフリー画像解析ソフトウェアパッケージにバンドルすることで、大規模な研究コミュニティでプログラムを利用できるようにします。

要約

画像解析のためのクロックスキャンプロトコルは、関心のある閉じられたまたはセグメント化された凸状の関心領域内で、境界内および外側（背景）内の平均ピクセル強度を定量化するための効率的なツールであり、強度プロファイル。このプロトコルはもともとは視覚的な基本6スクリプトとして2006年に開発されましたが、そのようなものとしては配布が限られていました。この問題に対処し、他の人たちによる同様の最近の取り組みに参加するために、オリジナルのクロックスキャンプロトコルコードを、ImageJやFiji ImageJのようなNIHが提供する自由に利用可能な画像分析プログラムと互換性のある2つのJavaベースのプラグインに変換しました。さらに、これらのプラグインには、複数の関心領域や画像スタックの分析など、元のプロトコルの機能の範囲をさらに広げるいくつかの新しい機能があります。プログラムの後者の機能は、アプリケーションに関連する変更を決定することが重要であるアプリケーション時間と場所へ。したがって、生物学的画像のスタックのクロックスキャン分析は、単一細胞内のNa +またはCa ++の広がり、ならびにシナプス的集団における拡散活性（ 例えば 、Ca ++波）の分析に潜在的に適用され得る結合またはギャップジャンクション結合細胞である。ここでは、これらの新しいクロックスキャンプラグインについて説明し、画像解析におけるアプリケーションのいくつかの例を示します。

概要

この作業の目的は、このタイプの画像解析に関心を持つ研究者にとって、プラットフォームフリーで、自由に利用できるクロックスキャンプロトコルを提示することです。クロックスキャンプロトコルは、2006年1月に開発されたもので、凸面形状領域（ROI）内のピクセル強度定量化の既存の方法を改善する目的で開発されました。取得中、プロトコルは、「バックグラウンド」ピクセル強度を測定する目的で、ROI中心からその境界にスキャンされた複数の放射状のピクセル強度プロファイル、またはROI外の所定の距離を順次収集する。プロトコルは、スキャンの方向に測定されたセル半径に従って、これらのプロファイルをスケーリングする。したがって、個々のラジアルスキャンの中心からROI境界までの距離は、常にXスケールの100％です。最後に、プログラムはこれらの個体を平均化する1つの積分放射状ピクセル強度プロファイルに変換する。スケーリングのために、「クロックスキャン」プロトコルによって生成される平均ピクセル強度プロファイルは、ROIサイズにも、妥当な限度内でもROI形状には依存しません。この方法では、異なるROIのプロファイルを直接比較したり、必要に応じて平均化または減算を行うことができます。また、このプロトコルは、物体の外側に位置する画素の平均強度の簡単な減算によって、背景雑音に対する任意の物体の積分画素強度プロファイルの補正を可能にする。生物学的試料中でのみ試験されているが、本発明者らのプロトコールは、原点（例えば、点源からの物質の拡散など）の周囲に配置された物理的または化学的プロセスの画像の研究に用いられる他の既存の画像分析ツール） 1 。

しかし、元の画像解析方法の主な制限は、プロトコルがdevこの問題に対処し、他の調査者2による同様の最近の取り組みに参加するために、VB6のクロックスキャン（VB6）を変換しました（Visual Basic 6（VB6）プログラムコードを2つのJavaベースのプラグインに統合し、NIHが提供し、自由に利用できるオープンソースとプラットフォームに依存しない画像解析プログラムImageJ 3とFiji ImageJ 4と互換性があります。複数のROIと画像スタックを処理するための元のプロトコルを使用しています。多くの画像解析アプリケーションは、複数のオブジェクトの統計解析を行う上でユーザーフレンドリーではないため、同時に複数の物体の分析を容易にすることが可能である顕微鏡画像データの堅牢な統計的評価、単一のセル/オブジェクトにおける信号強度分布に関しては、このプラグイン拡張で可能になりました。ここでは、Clock Scanプラグインについて説明し、画像解析におけるアプリケーションの例を示します。

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プロトコル

1.ソフトウェアのインストール

  1. バンドルされたJavaの最新バージョンと、ImageJまたはFiji ImageJのいずれかをそれぞれのWebサイトにインストールしてください（対応するWebサイトへのリンクはマテリアル表を参照してください）。以下のテキストでは、両方のプログラムを「ImageJ」と呼びます。
  2. マテリアル表で提供されるリンクを使用して、 "Clock_Scan-1.0.1。jar"と "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar"プラグインファイルをコピーし、ImageJプラグインディレクトリに貼り付けます。または、「プラグイン|プラグインのインストール」メニューオプションを使用して、これらのファイルをコンピュータのハードドライブに保存した後にインストールします。

2.クロックスキャン解析

  1. 標準クロックスキャンプラグイン（ 図1 ）：
    1. 関心のある画像を開くには、ImageJ "File | Open"メニューコマンドを使用します。
    2. 'ポリゴン'ツール、または '線分の分割'をクリックします。ツールを使用して、イメージを描画して、ROI全体またはこの領域の一部を概説します。ポリゴン選択の例については、 図1Aを参照してください（内側の破線の輪郭）。
      注記：ソフトウェアで利用できる他の選択ツール（長方形、楕円形、フリーハンドライン選択）も使用できます。
    3. メニューから「プラグイン|クロックスキャン」を選択すると、標準のクロックスキャンプロトコルポップアップオプションウィンドウが開きます。このコマンドは、アウトラインが自動的に追加されたROIマネージャウィンドウも開きます。
    4. プラグインオプションウィンドウを使用して次の操作を行います。
      1. スクロールバーを使用するか、対応する入力ボックスの値を変更して、ROIセンターのX座標とY座標を確認して変更します（物理的な中心の座標として自動的に計算されます）。 図 1Bを参照のこと。
      2. オブジェクトの外側の背景領域の大きさに応じてスキャンによってカバーされる場合は、「スキャンリミット」スクロールバーを使用してスキャンリミットを調整します。 図1Aを参照してください。
        注：スキャンリミットは、任意の方向のオブジェクトの境界を越えてスキャンをどのくらい進めるべきかを表す小数です。デフォルト値は1.20で、スキャンの長さはスキャン方向の​​オブジェクトの半径よりも20％長くなります。 図1A 、外側の破線参照）。
      3. 「実半径」、「背景を減算する」、「極座標変換」、および/または「標準偏差のプロット」チェックボックスを使用して、プラグインの出力を変更します。
      4. [OK]をクリックしてプラグインを実行します。 図 1C-Hを参照のこと 。
        注記：「標準偏差を有するプロット」および「極座標変換」または「実半径」および「極座標変換」を有するプロトコルの出力の例は、図 1Cおよび図 1Dおよび図 1Eおよび1Fにそれぞれ選択された「orm」オプションが示されている。計算された標準偏差（SD）値は、対象物の個々の放射状ピクセル強度走査間の変化を表す。プラグインウィンドウに「長さ」の行が表示され、ピクセル単位で測定されたROIのアウトライン長に関する情報が表示されます。
    5. 生成された "Clock Scan Profile Plot"では、 "List"コマンドを使用して、グレースケール画像用の2つのX列とY列のデータと、RGB画像のX列と4列のY列に表示される値をプロットします。 Y1、Y2およびY3列は、整数および個別の（赤、緑および青）カラーチャネル画素強度値で満たされる。
  2. 複数のROIクロックスキャンプラグイン - 複数のROI（ 図2 ）：
    1. 複数のROIを含む画像を開きます。
    2. [分析|ツール| ROIマネージャ]をクリックしてROIマネージャを開きます。
    3. ROIマネージャウィンドウで「追加」をクリックして、ROIマネージャに各ROIを追加します（手順2.1.2を参照）。イメージ内のすべてのROIに対してこれを行います。 ROIメトリックが関心のある場合は、「Analyze | Measure」コマンドを使用します。
      1. 複数の線分選択の例については図2Aを参照し、複数のポリゴン選択の例については図 2Eを参照のこと。
    4. [プラグイン]メニューの[マルチクロックスキャン]を選択すると、プロトコルオプションのポップアップウィンドウが開きます。
    5. プロトコルオプションウィンドウを使用して以下を実行します。
      1. 必要に応じて、ステップ2.1.4.2に従ってスキャン制限をリセットします。デフォルト値は1.20です。
      2. 必要に応じて、opt標準偏差でプロットする]チェックボックスをオンにしてSDバーで平均クロックスキャンプロファイルをプロットします。 図 2CおよびDを参照のこと 。
        注：計算されたSD値は、異なるオブジェクトの積分クロックスキャンプロファイル間の変化を表します。また、「選択したROIの数」に関する情報を表示するプラグインウィンドウの行に注意してください。
      3. [OK]をクリックしてプロトコルを実行します。
    6. 生成された "Clock Scan Profile Plot"では、 "List"コマンドを使用して、 "Plot Values"ウィンドウに表示される値をプロットします。カラーチャネルによる列指定については、「マルチクロックスキャンプロファイルプロット」の凡例を参照してください。
    7. ROIには番号が付けられており、任意のカラーチャネルのクロックスキャンプロファイルは、ROIがアウトライン化されて「ROIマネージャ」に追加されたのと同じ順序でプロットされます。
  3. マルROIクロックスキャンプラグイン - イメージスタックを使用して作業する（ 図3 ）：
    1. 関心のある画像スタックを開きます。
    2. [分析|ツール| ROIマネージャ]をクリックしてROIマネージャを開きます。
    3. スタック内の画像のROIを概説し、ステップ2.1.2および2.2.3で説明したようにROIマネージャに追加します。 ROIメトリックが関心のある場合は、 "Analyze | Measure"コマンドを使用します。
    4. [プラグイン]メニューの[マルチクロックスキャン]を選択すると、プロトコルオプションのポップアップウィンドウが開きます。
    5. プロトコルオプションウィンドウを使用して以下を実行します。
      1. 手順2.1.4.2の説明に従ってスキャン制限をリセットします。デフォルト値は1.20です。
      2. '標準偏差でプロットする'チェックボックスをオンにすると、SDバーで平均クロックスキャンプロファイルをプロットするオプションを選択します。
        注：計算されたSD値は、画像ステーションで選択されたオブジェクトの異なるインスタンス間の変化を表しますck。また、「スタック内の画像数」に関する情報を表示するプラグインウィンドウの行に注意してください。
      3. [OK]をクリックしてプロトコルを実行します。
    6. "Clock Scan Profile Plot"ウィンドウで、 "List"をクリックして "Plot Values"ウィンドウに表示される値をプロットします。ここで、Y列番号はスタック内の画像位置を表します。

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結果

説明目的でここで使用されている画像は、以前の細胞および組織の生物学的研究5,6,7およびAllen Mouse Brain Atlas 8から作成されたデータベースから取得されています。どちらのプラグインも、ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77、ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66、およびFiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66プログラム環境を使用して正常にテストされ?...

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ディスカッション

クロックスキャンプロトコル：クロックスキャンプロトコルは、画像解析の迅速かつ簡単なツールです。画像解析の既存の一般的なアプローチ（線形ピクセル強度スキャンまたはROIの平均ピクセル強度の計算など）と比較して、このプロトコルの利点は、先の刊行物1,9に詳細に記載されている。手短に言えば、このプロトコルは、対象物の境界線または対象外の所定の位置（背?...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反はないと宣言している。

謝辞

我々はFuji ImageJ Clock Scanプラグインのバージョンを私たちと共有し、このバージョンのプログラムを開発するよう促したTanja Maritzen博士とFabian Feutlinske博士（Leibniz Institute of Molecular Pharmacology、Berlin、Germany）に感謝します。我々はまた、プラグインのテストと改善を目的として、彼の部署のデータベースから画像を使用する親類の許可を得て、フリッツ・メルチャーズ博士（リンパ球発生部、マックスプランク研究所感染生物学研究所）に感謝しています。サポート：Translational Neurosciencesのセンター; NIH付与：P30-GM110702-03。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ComputerAnycompatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan pluginsfreewarehttps://sourceforge.net/projects/clockscan/Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0OriginLabNorthampton, MA, USAThis program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function

参考文献

  1. Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
  2. Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535(2015).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  4. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  5. Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
  6. Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
  7. Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).
  8. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
  10. Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).
  11. Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).
  12. Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).

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