胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

要約

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。

要約

機能的な神経筋回路の確立は、運動軸索と標的筋肉の間の正確な接続に依存する。運動ニューロンは、周囲の細胞外環境から発する多数の軸索誘導手がかりに応答することによって、特定の経路に沿って移動する成長円錐を拡張する。成長円錐標的認識はまた、神経筋特異性において重要な役割を果たす。この研究は、後期段階16 ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学プロトコルを提示する。このプロトコールは、所望の突然変異胚を選別するための遺伝子型決定手順を含むいくつかの重要なステップを含む。ファシクリンII（FasII）抗体で胚にタグ付けするための免疫染色手順;固定された胚からフィレット調製物を生成するための解剖手順を含む。末梢のモーター軸索突起および筋肉パターンは、filleted embryosの平らな調製物では、whよりもはるかに良好に視覚化されるオレ - マウント胚。したがって、FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、モーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供し、機能喪失および機能獲得遺伝子スクリーンの両方に適用することもできる。

概要

ショウジョウバエの幼生における正常な運動のためには、胚発生の間に運動軸索と標的筋肉との間の正確で選択的な結合が不可欠である。腹部半分体A2〜A7の各々における30本の筋線維の胚形成は、段階16 ¹によって確立される。腹側神経脊髄で生成された36個の運動ニューロンは、軸索を末梢に伸ばして特定の標的筋肉を神経支配する² 。モーター軸索の経路探索および標的認識は、抗体（マウスモノクローナル抗体1D4） ^3,4による免疫組織化学によって視覚化することができる。野生型胚のモーター軸索突起パターンの複数の画像がウェブ^{5上で利用可能で}ある。 1D4抗体は、胚性中枢神経系（CNS） ^4の正中線の両側にすべての運動軸索および3つの縦軸索束を標識する ^{、 6} （ 図1Cおよび図2A ）。したがって、FasII抗体による免疫組織化学は、運動軸索誘導および標的認識の根底にある分子メカニズムを実証するために、神経筋結合に必要な遺伝子を同定するための強力なツールを提供する。

腹部半分体A2~A7のそれぞれにおいて、運動軸索は、2つの主要な神経枝である分節神経（SN）および椎間板神経（ISN） ^2,4 、および軽微な神経枝に選択的に束縛され、横断神経） ⁷ 。 SNは選択的に脱皮して、SNaおよびSNcと呼ばれる2つの神経分枝を生じさせるが、ISNはISN、ISNbおよびISNdと呼ばれる3つの神経分枝に分裂する。その中でも、ISN、ISNb、およびSNaモーター軸索投射パターンは、後期ステージ16胚がFasII抗体で染色され、フィレット化されたときに最も正確に視覚化される（ 図1Cおよび図2A ）。 ISN運動ニューロンは、それらの軸索を背側筋肉1,2,3,4,9,10,11,18,19、および20,2,4（ 図2A ）に神経支配するように拡張する。 ISNb運動ニューロンは、腹外側筋6,7,12,13,14,28、および30,2,4（ 図2Aおよび2B）を支配する。 SNa神経枝は、側方筋肉5,8,21,22,23、および24,2,4（ 図2A ）を神経支配するように突出する。 2つの運動軸索からなるTNは、筋肉25を神経支配するための分節境界に沿って同側に突出しており、筋肉25の外側二極樹状突起ニューロン（LBD）とシナプスを形成する周辺部⁷ （ 図2A ）。これらの標的筋の神経支配は、特定の選択点において運動軸索の選択的脱毛皮化を必要とするだけでなく、筋肉の認識を標的とすることを必要とする。さらに、中間標的として作用するいくつかの推定中胚葉誘導ポスト細胞は、ISNおよびSNa経路の両方で見出されたが、ISNb経路⁴では見出されなかった。これは、ISNbモーター軸索経路探索が、ISNおよびSNaモーター軸索ガイダンスと比較して明確な様式で調節され得ることを示唆し、また、周辺モーター軸索ガイダンスが、単一のガイダンスキューの差異または保存された役割を研究する魅力的な実験モデル分子⁸ 。

この研究は、ショウジョウバエの胚運動ニューロンの軸索突起パターンを視覚化するための標準的な方法を提示する。記載されたプロトコールは、1D4aで染色された固定胚を解剖する方法を含むフィブリル化調製物のために3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）で処理した。固定された胚の平らな調製物の1つの重大な利点は、周辺における軸索突起および筋肉パターンのより良好な視覚化である。さらに、この研究は、LacZ染色法を用いて所望の突然変異胚を選別するための固定された胚を遺伝子型決定する方法も示している。

プロトコル

1.準備

1. 0.5Xのウシ血清アルブミン（BSA）と0.5mLのt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（材料の表参照）を1×PBS（500mL）に加えて、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（PBT）溶液で500mLのリン酸緩衝生理食塩水少なくとも30分間攪拌した。 4℃で保存する。比較的新鮮なときに使用し、清潔な瓶に保存してください。
2. 4％パラホルムアルデヒド10 mLに、脱イオン水6.5 mLに16 mLストックパラホルムアルデヒド溶液2.5 mLと10 mL PBS 1 mLを加えて調製する。 4℃で保存し、1週間以内に使用してください。
   注意：パラホルムアルデヒド溶液との接触は避けてください。毒性が強いためです。
3. 1mLのDMSOあたり0.1gのX-Gal基質を溶解することにより、X-Gal基質（ジメチルスルホキシド（DMSO）中10％w / v X-Gal）を作製する。 100μLアリコートで-20℃で保存する。
4. 10mMリン酸緩衝液（pH7.2）、150mM NaCl、1mM MgCl 2、3μlを用いてX-Gal染色溶液を作製する。MK ₄ [FeII（CN） ₆ ]、3mM K ₃ [FeIII（CN） ₆ ]、および0.3％t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール。暗所で4℃で保存する。
5. 3％過酸化水素水を、30％原液の過酸化水素1:10を脱イオン水で希釈することによって調製する。
6. DAB 1錠（10mg）を35mLの新鮮なPBT溶液に完全に溶解して3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を調製する。 0.2μmのシリンジフィルターでろ過し、-20℃で910μLのアリコートで保存します。
   注意：すべてのDAB廃棄物を漂白剤に入れてDABを破壊してください。
7. リンゴジュースで卵子を作る。 1L 35gの寒天と1Lの脱イオン水を2Lフラスコに加える。 33Lのスクロース、2gのテゴセプト、および375mLのリンゴジュースを1Lフラスコに加える。 30分間オートクレーブしてそれらを溶かす。両方の溶液を約60℃まで冷ます。これらの溶液を攪拌してよく混合する。 60ミリリットルの培養皿あたり〜11 mLの混合溶液を注ぐ。
8. パン酵母をブレンドして酵母ペーストを作る（1：0.8の比）に入れ、4℃で保存する。

2.胚コレクション（1日目）

1. 若い雌雄のハエ（5日未満）を採取し、1〜2日間、少量の酵母ペーストを中央に含む卵板（60mm×15mm）をプラスチックビーカーケージに入れて維持する。
2. 後期段階16胚の最適な収集のために、午後5時にハエ（> 50）でボトルケージを設置し、3時間25℃で卵を産卵させる。
3. フライドポテトを新鮮なフードボトルに移す。
4. 蓋をして卵プレートを閉じ、25℃で加湿インキュベーター（〜70％湿度）で一晩インキュベートする。

3.免疫染色のための胚の調製（2日目）

1. 午前10時20分頃に1.8 mLのPBT溶液を卵板に加え、綿棒で卵を傾けながら胚を緩めます。
   注：コットンを使用して酵母ペーストを静かにマッシュすることによりスワブ上に多数の胚が見つかった場合にはそれを溶かす。固定の約40分前（午前11時頃）に胚の採取を開始する。
2. 1mLのピペットチップを使用して、卵プレートから1.5mLのマイクロチューブに胚を移す。
3. 胚を沈降させ、可能な限りPBT溶液を吸引する。 1mLのPBT溶液で胚を2回すすぐ。可能な限りPBT溶液を吸引する。
4. 50％漂白剤（ すなわち、脱イオン水で希釈）1mLでチューブを満たし、室温（RT）で3分間ナットでインキュベートすることにより胚を脱皮する。
   注：この手順では、脱皮した胚は死滅しません。
5. 脱皮した胚を沈降させ、できるだけ50％漂白剤を吸引し、1mLのPBT溶液で3回胚をすすいでください。
6. 0.5mLのヘプタンを添加し、続いて0.5mLの4％パラホルムアルデヒド溶液を室温で午前11時頃に管に加える。
7. インキュベートするRTで15分間ナッターで胚を摘出した。
8. 4％パラホルムアルデヒド溶液（最下層）を除去する。
9. 0.5mLの100％メタノールを添加し、30秒間激しくチューブを振盪することにより胚を脱皮する。
10. ヘプタン（ すなわち、最上層）を除去する。
11. 100mLのメタノール0.5mLを添加し、10秒間激しくチューブを振とうする。
12. 胚をチューブをタップして沈降させ、可能な限りメタノールを吸引する。 100％メタノール1 mLで胚をすすぎ、10秒未満振盪する。
    注：メタノールへの長期暴露はβ-Gal活性を破壊する。
13. メタノールを除去し、脱膜した胚をPBT溶液1mLで3回すすぐ。

4. LacZ染色を用いた胚のジェノタイピング（2日目）

1. PBT溶液1 mLをチューブに添加し、チューブを37℃のヒートブロックまたは水浴中で15分間インキュベートする。
2. インキュベーション中に、X-Gal染色溶液（1mLあたり1mL水浴中で曇るまで65℃で保存してください。それを37℃の水浴中でインキュベートする。
3. PBT溶液を吸引し、1 mLのX-Gal染色溶液と20μLのX-Gal基質をチューブに加えます。
4. 青色の沈殿が明らかになるまで、チューブを37℃で培養する。
   注：第2 ^および第 3 ^のブルーバランサのインキュベーション時間は、一般に2〜4時間の範囲である。
5. X-Gal染色溶液を除去し、1mLのRT PBT溶液で3回胚をすすぐ。
6. 針プローブまたは鉗子を用いて、所望の遺伝子型の胚（ すなわち、染色されていない白色胚）を光解剖顕微鏡（1.6X〜2.5X対物レンズ）で手で分類する。
   注： CyO、アクチン-LacZおよびTM3、アクチン -LacZなどのいくつかのブルーバランサーは、 アクチンプロモーターの制御下で細菌β-Gal（LacZ）を発現するトランスジェニック構築物を担持しているため、遍在的に青く染色された胚は、青バランサー染色体の1つまたは2つのコピー。したがって、染色されていない白色胚は、所望の致死対立遺伝子についてホモ接合である。

5.抗Fasciclin II抗体による胚の免疫染色（2-3日目）

1. 所望の遺伝子型の胚（ すなわち、染色されていない白色胚）を収集し、1mLピペットチップを用いて0.5mLマイクロチューブに移す。
   注：この段階では、キュービクルのセグメンテーションパターンや頭と尾の構造を含む形態学的基準に従って、胚を大まかにステージングすることができます。頭部の崩壊の間、卵が飼育されてから10〜16時間の間に、胚は最も前側の部分^9の顕著な減少を受ける。
2. 0.4mLのPBT溶液で胚を1回洗浄し、0.3mLのブロッキング溶液（PBT溶液中5％正常ヤギ血清および5％DMSO）を加える。
3. RTで15分間飼育して胚をブロックする。
4. 75μLの抗Fasciclin II抗体を添加し、チューブを室温で一晩インキュベートする。
5. 1回の洗浄につき少なくとも20分間、0.4mLのPBT溶液で胚を4回洗浄する。
6. ヤギ抗マウスHRP抗体（2μg/ mL）を含有するブロッキング溶液（PBT溶液中5％正常ヤギ血清）0.3mLを添加し、チューブを室温で一晩インキュベートする。
7. 0.4mLのPBT溶液で胚を6回洗浄し、1回の洗浄につき少なくとも20分間洗浄する。
8. チューブに0.3 mLのDAB溶液を加える。
   注意：手袋を着用し、すべてのDAB廃棄物/チューブ/チップを漂白剤に入れてください。
9. 3％過酸化水素2μLを添加し、望みの量の沈殿物が生成されるまで、チューブを室温で暗所でインキュベートする。
   注：1D4免疫組織化学のインキュベーション時間は、一般に0.5〜1時間の範囲である。
10. 0.4mLのPBT溶液で胚を4回洗浄する。
    注意：DAB溶液を除去し、最初の2回の洗浄はピペットで行い、di漂白剤でそれらを傷つける。
11. 70％グリセロール/ PBS溶液をチューブに0.2 mL添加し、室温または4℃で保存する。
    注：チューブは光から遠ざけてください。胚を90％グリセロール/ PBS溶液¹⁰中に置くことにより、より明瞭な調製物を得ることができる。しかし、90％グリセロール/ PBS溶液で清澄された胚を、70％グリセロール/ PBS溶液^10で浄化された胚よりも解剖することはより困難である。

6.胚のステージング、解剖、マウントおよび画像化（4日目）

1. ステージングのために、70％グリセロール/ PBSで平衡化した胚をガラススライド上に移す。
2. 腹部セグメント7（A7）、A8、およびA9 ISN神経が互いに接触するように収束する、および/または中腸が3つのバンドに細分される後期段階16の胚を収集する。
   注：1D4抗体で染色された胚は、ISNおよびISNbモーター軸索の投影パターンに基づいてステージングすることができる。 CNSを出た後、A7、A8、およびA9 ISN ne後期段階-16の胚の群は互いに接触するように収束し、続いて発散して背側の筋肉に遠くまで広がる（ 図1Aの矢頭）。しかし、16段階中期胚では、A7 ISN神経はA8 / A9神経と平行して伸びる（ 図1Bの角括弧）。さらに、両半分のA6 ISNb神経（腹側筋に垂直）の投影軸は、CNS縦軸索束の後端とほぼ整列している（ 図1Cの矢印および線）。これらの形態学的基準は、異なる遺伝子型によって多少異なる。あるいは、胚の形態学に基づいて胚をステージングすることができる9,11。ステージ17に先立ち、中腸は心臓のような形をしているのに対して、中腸はステージ17,12によって3つのバンドに細分されている。
3. 胚を解剖する。
   1. 1mを使用するLシリンジで、各胚をグリセロール液滴から移動させ、胚を腹面を上にして置く。体の長さの1/4とモーター軸索のない最も後部の領域で前部を切断する。
   2. ニードルプローブを使用して、エンドカット胚をグリセロールドロップから移動させ、ロールバックして背側を上にして、フィールドに水平に置きます。
      注：胚をグリセロール液滴の外に移動すると、胚に付随するグリセロールが少し粘着してしまいます。
   3. 単一の非常に細かいタングステンの針¹³を使用して背面の正中線に沿って胚を切断します。胚の後端で小さな切れ目を作って、背中の正中線を前部に向かって引き下げ続けます。反対方向に切断しても問題ありません。
   4. ニードルプローブを使用して、正中線切断した胚をグリセロール液滴の中に移動させ、背側を上に置き、各腹壁を腹側（対角線）方向に展開することによって体壁から腸を分離する（2.5X対物レンズ）。
      注：背中正中線が完全に切断されていることを確認し、左右の体壁を完全に分離します。
   5. 慎重にグリセロールドロップから正中線切断胚を移動し、細い針のプローブ（2.5倍の対物レンズ）を使用してガラススライド上に体の壁の2つのフラップを置きます。
   6. 非常に細かいタングステン針を使用して、横に（5Xの対物レンズ）それらを押すことにより、解剖された胚から内臓を除去する。
      注：別の同様の解剖手順のより詳細な説明は、ウェブサイト^5で見つけることができます。
4. マウントするには、70μlの70％グリセロール/ PBS溶液を2〜3μL添加して清潔な胚にし、細い針状プローブを使用して新しいスライドグラスに移し、7μLの70％グリセロール/ PBS溶液を広げてくださいセンター（2.5X対物レンズ）。
5. カバースリップ（18mm×18mm）を置く。カバースリップのエッジを通常のマニキュアでシールします（どちらか透明または着色されています）。
6. メーカーの指示に従って、微分干渉コントラスト（DIC）光学顕微鏡下で高解像度（20倍、40倍、および63倍油浸対物レンズ）で画像を取り込む。
   注：ISNbモーター軸索の場合、特に視覚化と表現型の解析がより容易になるためには、63X油浸対物レンズを使用することができます。

結果

神経発達中の運動軸索と標的筋肉との間の正確な接続は、選択的軸索 - 軸索反発および特定の選択肢^4での標的認識に依存する。 ショウジョウバエでは、運動軸索間の選択的反発は、Sema-1a、Sema-2a、およびSema-2b 8,14,15,16,17,18を含むクラス1と2のセマフォリン（Semas）の併用作用によって部分的に制御される。したがって、 Sema-1a機能の喪失...

ディスカッション

モーター軸索誘導欠陥の詳細は、蛍光標識されたもののレーザー走査共焦点顕微鏡によるよりも、DABで染色した胚のフィレット調製物により、より迅速かつより正確に得点される。したがって、固定された1D4染色胚のフィレット調製物は、誘導キュー分子の機能的特徴付けに最も適している。ネトリン、スリット、セマフォリン（セマ）、エフリンなどの4つの主要な手がかりとそれらの同族...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)