ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

要約

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。

要約

タンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピングは、遺伝子調節、クロマチンリモデリング、および他のクロマチン常駐プロセスを理解するために重要です。ホルムアルデヒド架橋、その後のクロマチン免疫沈降およびハイスループット配列決定（X-ChIP-seq）は、ゲノム生物学に対する多くの貴重な洞察を得るために使用されてきた。しかしながら、X-ChIP-seqは、架橋および超音波処理に関連する注目すべき制限を有する。ネイティブChIPは、架橋を省略することによってこれらの欠点を回避するが、多くの場合、クロマチン結合タンパク質の回収率が低い。さらに、すべてのChIPベースの方法は、抗体の品質を考慮する必要があります。目的のタンパク質のDNA修飾酵素への融合を含むタンパク質-DNA相互作用をマッピングするための酵素的方法もまた、タンパク質-DNA相互作用をマッピングするために使用されている。我々は最近、ChEC-seqとして高スループット配列決定法を用いて、このような方法の一つであるクロマチン内在性切断（ChEC）を組み合わせた。 ChEC-seqは、クロマチンアソーク生存細胞中のカルシウムの存在下で標的とされたDNA切断を生成するために、ミクロコッカルヌクレアーゼ（MNase）に対する関心対象のタンパク質を同定する。 ChEC-seqは免疫沈降に基づいていないため、架橋、超音波処理、クロマチン可溶化、抗体品質に関する潜在的な懸念を回避し、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えた高分解能マッピングを回避します。 ChEC-seqは、ChIP-seqの知見を検証し、ゲノム規制への新たな洞察を発見するための独立した手段を提供し、ChIPに強力に対応するものと考えています。

概要

転写因子（TF）、クロマチンリモデーダー、および他のクロマチン関連調節因子の結合部位のマッピングは、すべてのクロマチンベースのプロセスを理解する上で重要です。ゲノム生物学への多くの重要な洞察を得るために、クロマチン免疫沈降法およびハイスループットシーケンシング（ChIP-seq）アプローチが用いられてきたが、それらには顕著な限界がある。我々は最近、これらの欠点を回避するために、クロマチン内在性切断および高スループット配列決定（ChEC-seq） ¹と呼ばれる別の方法を導入した。

ChIP-seqは、タンパク質-DNA相互作用を保存するために、初期ホルムアルデヒド架橋工程（X-ChIP-seq）で行われることが最も多い。しかしながら、最近の多くの研究により、X-ChIP-seqは、一過性または非特異的なタンパク質-DNA相互作用を2,3,4,5 ^、偽陽性結合部位を生じさせる。さらに、X-ChIP-seq実験においてクロマチンを断片化するために一般的に使用される超音波処理は、オープンクロマチンの領域を優先的に切断し、これらの領域^9,10からの断片の偏った回収をもたらす。超音波処理はまた、エキソヌクレアーゼ消化工程の追加が分解能11,12を大幅に改善することができるが、最終的に結合部位分解を制限する、断片長の異種混合物を生じる。親和性精製された天然に単離されたクロマチン（ORGANIC） ¹³由来のゲノムの占有領域などのネイティブChIP法は、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理に関連する潜在的な偏りを緩和する、ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）しかしながら、天然のクロマチン抽出に必要とされる比較的穏やかな条件下での多くのクロマチン結合タンパク質の溶解度が低く、潜在的にダイナミックレンジおよび/または偽陰性の減少を招く可能性がある¹⁴ 。

ChIP-seqの種々の反復は、タンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピングに最も一般的に使用されるが、目的のタンパク質と様々なDNA修飾酵素との融合に基づくいくつかのマッピング技術も実施されている。そのようなアプローチの1つは、目的のクロマチン結合タンパク質がダムに遺伝的に融合され、この融合が細胞または動物において発現され、タンパク質の結合部位に近接したGATC配列のメチル化をもたらす、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ同定（DamID） ¹⁵である。 DamIDは、免疫沈降に頼らず、架橋、抗体またはクロマチンの可溶化を回避するという点で有利である。それはインビボでも行われる 。しかしながらDamIDの分解能はキロベーススケールに限定され、Dam融合タンパク質のメチル化活性は構成的である。酵素的融合に基づく第2の方法は、興味のある因子のトランスポザーゼへの融合を用いて、トランスポゾンの部位特異的組込みを指示するCalling Card-seq ¹⁶である。 DamIDと同様に、Calling Card-seqは免疫沈降に基づいていないため、同様の利点があり、分解能が向上するという利点があります。しかし、Calling Card-seqは、トランスポゼースの配列バイアスによって制限され、トランスポゾン挿入部位に近い制限部位の存在にも依存する。

Laemmli研究室で開発された第3の酵素的融合法は、クロマチン内在性切断（ChEC） ^17である。 ChECでは、クロマチン関連タンパク質とMNaseとの融合物が細胞内で発現され、MNaseを活性化するためにカルシウムが添加されると、DNAはタグ付き結合部位の近位で切断される因子（ 図1 ）。サザンブロッティングと併せて、ChECは、酵母^17,18中の多数の個々の遺伝子座でのクロマチン構造およびタンパク質結合を特徴付けるために使用され、低解像度マイクロアレイ分析と組み合わせて、核細孔成分と酵母との相互作用を調べたゲノム¹⁹ 。 ChECは、DamIDおよびCalling Card-seqと同様の利点を提供し、プライマー伸長¹⁹によって分析された場合、その分解能はほぼ1塩基対である。 ChECはまた制御可能である：MNaseによる頑強なDNA切断はミリモルのカルシウムの添加に依存し、MNaseは生酵母細胞で観察される低遊離カルシウム濃度で不活性である²⁰ 。

これまで、我々は、ChECを高スループット配列決定（ChEC-seq）と組み合わせることにより、TF結合部位の高分解能マップを提供すると仮定した。確かに、ChEC-seqは、出芽酵母一般制御因子（GRF）Abf1、Rap1、およびReb1のゲノム¹にわたる高分解能マップを生成した。我々はまた、ChEC-seqを、直接的にDNAと接触しないChEC-seqの適用可能性を拡大し、ChIP-seqによってマッピングすることが困難な、モジュラーメディエーター複合体、保存された必須の全体的転写共活性化剤²¹に首尾よく適用したベースの方法。 ChEC-seqは、ChIP-seq結果の独立した検証と、クロマチン常駐プロセスの新しい洞察の生成の両方の強力な方法です。ここでは、出芽酵母におけるこの方法の実施のための段階的プロトコールを提示する。

プロトコル

1.酵母菌株の生成

1. MNaseでタグ付けされた目的の因子を有する酵母株を作製する。
   1. 指定された反応混合物（ 表2 ）およびサイクル条件（ 表3 ）を用いて、所望のベクター（ 表1 ）からMNase標識カセットをPCR増幅する。 5μLのPCR反応物と1μLの6X DNAローディング色素を混合する。各PCRアリコートを0.8％アガロースゲル上で120Vで40分間実行する。予想される製品サイズは〜2.3kbです。
   2. 増幅されたタグ付カセットを、標準的な酢酸リチウムトランスフォーメーション²²を使用して選択した株に形質転換し、選択を行う。
   3. コロニーPCRによるタグカセットの正確な組み込みを確認する。
      1. スクリーニングするコロニーの数について、指定の反応液（ 表4 ）を調製する。必要になるまで氷上に置いてください。
      2. 各コロニーの一部を選んでテス滅菌した爪楊枝またはピペットチップを用いてPCRチューブの底に移した。
      3. 拾ったコロニーを1分間高出力でマイクロ波処理する。
      4. 各マイクロ波コロニーに50μLのPCRミックス（ 表4 ）を加え、ピペットで上下にミックスします。指定されたサイクリング条件（ 表5 ）を使用してPCRを行います。
      5. 各PCRチューブに50μLのPCR反応液と10μLの6X DNAローディング色素を直接混合する。各サンプル10μLを1％アガロースゲル上で120Vで40分間泳動する。予想される製品サイズは約700bpである。
         注：必要に応じて、ウェスタンブロッティングによるMNase融合タンパク質の適切な発現を確認します。タグ付きタンパク質の分子量が約20.6キロダルトンシフトすることが予想される。
2. 目的の遺伝子のプロモーターの相同性に基づくクローニングをpGZ136（表1）に加え、ステップ1.1.2のように形質転換および選択することにより、遊離のMNase株を作製する。
   1. オルタナティ目的の遺伝子のプロモーターおよび3xFLAG-MNase-SV40 NLSをプラスミドベクターに組み込み、ステップ1.1.2のように形質転換および選択し、プラスミドの維持のための適切な選択条件で株を増殖させる。

2. ChEC

1. ChEC実験前日の午後/夕方に、MNaseタグ付き因子を有する菌株の単一コロニーを有する酵母 - ペプトン - デキストロース（YPD）または適切な選択培地3mLを接種する。この培養物を一晩インキュベートする（180RPM振とう、30℃）。
2. ChEC実験の当日の朝、終夜培養物を50mLの培地に希釈して、600nmでの光学密度（OD ₆₀₀ ）が0.2〜0.3になるようにする。 OD ₆₀₀が0.5〜0.7に達するまで、この培養物（180 RPM振盪、30℃）をインキュベートする。培養液が適切なOD _600に近づくにつれて、ヒートブロックまたはウォーターバスを30℃に設定し、Buffer A添加物（ Ta6）。
3. 培養液あたり5 mLのBuffer A +添加物（ 表6 ）を調製する。手順中にバッファーAを室温に保つ。
4. 90μLの停止液（ 表7 ）および10μLの10％SDSを含む微量遠心管を収集する各時点で調製する。分析した各新しい因子について、0秒、30秒、1分、2.5分、5分、および10分でサンプルを採取する。
5. 培養液を50 mLコニカルチューブに移し、1,500 xgで室温（RT）で1分間遠心します。
6. 細胞を緩衝液Aの1mLに徹底的に再懸濁し、再懸濁した細胞をマイクロチューブに移す。ペレットは、微小遠心分離機に1,500 xg、RTで30秒間再懸濁した。
7. 上清を吸引し、上下にピペッティングすることにより、緩衝液Aの1 mL中に細胞を完全に再懸濁する。ペレットは、微小遠心分離機に1,500 xg、RTで30秒間再懸濁した。このステップを1回繰り返します。
8. 緩衝液Aの570μL中に細胞を徹底的に再懸濁する.30μLの2％ジギトニン（0.1％最終濃度）、細胞の透過性を促進し、混合を逆転させる。
9. 30℃で5分間加熱ブロックまたは水浴中で細胞を浸透させる。
10. 細胞の均一な分布を確実にするために反応を上下にピペッティングします。停止溶液およびSDS（ステップ2.4）を含有する微量遠心管へのネガティブコントロールとして透過性細胞の100μLアリコートを除去し、短時間ボルテックスして混合する。
11. 1.1mMの1M CaCl ₂ （2mM最終濃度）を透過性細胞に添加してMNaseを活性化し、迅速に数回反転させるか、短時間ボルテックスして混合します。直ちに混合反応を30℃に戻し、タイマーを開始する。
12. 収集する各時点で、細胞を均一に分布させるために反応を上下にピペッティングしてから、100μLの透過細胞のアリコートを停止溶液とSDSを入れたマイクロチューブに加え、ボルテックスして混合します。分析された各新しい因子について、0秒（CaCl ₂添加なし）、30秒、1分、2.5分、5分、および10分の時点で測定した。
    注：30℃でDNAを迅速に切断する因子を用いたChEC実験は、MNase切断速度を遅くするために低温で行うことができる。
13. すべての時点を集めたら、各サンプルに20μg/ mLプロテイナーゼK4μLを添加し、ボルテックスして短時間混合し、55℃で30分間インキュベートする。
14. 各サンプルに200μLの25：24：1フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、激しく撹拌して混合し、最大速度および室温で微量遠心機で5分間遠心する。
15. 各水相（〜150μL）を新しいチューブに移す。 30μgのグリコーゲンおよび500μLの100％エタノールを添加する。 10分間または溶液が粘性になるまでドライアイス上で混合および沈殿させるために激しく攪拌する。
16. ペレットはDNAを最大速度で微量遠心分離で4℃で10分間沈殿させた。
17. 上清をデカントし、1mLのRT 70％エタノールでペレットを洗浄する。
18. エタノールを傾瀉し、残りを紙タオルでチューブを静かに軽くたたきます。ベンチトップ遠心分離機を使用して試料を簡単に回転させ、ペレットを乱さないように注意して残留エタノールを除去するためにピペットを使用する。室温で5分間空気乾燥したペレット。
19. ペレットが乾燥している間、それぞれ10mg / mL RNase AのpH 8.0 +1μLのトリス29μL中に乾燥ペレットを再懸濁するためのマスターミックスを作製する。 37℃で20分間RNAを消化する。
20. 1μLの6X DNAローディング色素と5μLの各サンプルを混合し、120Vで1.5％アガロースゲル上で40分間泳動する。

3.サイズ選択

注：サイズ選択の目的は、配列決定されるサンプルからゲノムDNAのマルチキロベース断片を除去し、約150bp（およそヌクレオソームDNAのサイズ）以下の断片を濃縮することです。配列データでは、<400bpの断片が濃縮され、ヌクレオソームDNAのサイズ（約150bp）の周りに顕著なピークがあり、サブヌクレオソーム断片のピークまたは広域分布がある。

1. 各サンプルに、75μLの固相可逆的固定化（SPRI）ビーズをポリエチレングリコール（PEG）溶液^23に加え、ピペットで10回上下させて混合する。ビーズ：DNA混合物をRTで5分間インキュベートする。
2. SPRIビーズインキュベーションの間、96μLの10mMトリス、pH8.0および4μLの5M NaClを含む微量遠心チューブを各サンプルに調製する。
3. チューブを磁気ラックに入れて、チューブの側面にビーズを集める。ビーズをチューブの側面に2分間集める。
4. 各上清をTrisおよびNaClを含む新しいチューブに移す（ステップ3.2）。
5. 各サンプルに200μLの25：24：1フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、ボルテックスして混合し、最大速度および室温で微量遠心機で5分間遠心する。
6. それぞれの水相を新しいチューブに移す。 30μgのグリコーゲンおよび500μLの100％エタノールを添加する。ドライアイス上でDNAを10分間または溶液が粘性になるまで沈殿させる。
7. ペレットプレッサーマイクロスピードで10分間、最高速度と4℃でDNAをピットした。
8. 上清をデカントし、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄する。
9. エタノールを傾瀉し、ペーパータオル上のチューブを反転させてゆっくりと軽くたたいて残りを取り除く。ベンチトップ遠心分離機を使用して試料を簡単に回転させ、ペレットを乱さないように注意して残留エタノールを除去するためにピペットを使用する。室温で5分間空気乾燥したペレット。
10. 25μLのトリス、pH8.0中で乾燥ペレットを再懸濁する。高感度アッセイを使用してサンプル濃度を決定する。 TF ChEC実験のために、サイズ選択後に10〜100ngのDNAが日常的に回収される。
11. シーケンシングライブラリを準備する。以前に記載されたように、サイズ選択に依存しないライブラリー調製プロトコル²⁴は、広範囲のフラグメントサイズ（25〜500bp）の配列決定を可能にするために望ましい。
12. ペアエンドモードのシーケンスライブラリ。高品質の読み取りのためには、各末端に最低25塩基の配列が必要ですマッピング。 1〜200万回の読み取りで、ChECサンプルに十分なカバレッジが得られます。
    注：ChEC-seqデータの分析は複雑な手順であり、この記事の範囲を超えています。データ分析に関する詳細な情報は、以前の刊行物1,21にあり、分析に使用されたカスタムスクリプトはGitHub（https://github.com/zentnerlab/chec-seq）で入手できます。 HOMER ²⁵ （http://homer.salk.edu）は、ChEC-seqデータのコマンドライン解析にも使用できます。

結果

成功したChEC実験の場合、アガロースゲル電気泳動によるDNA分析は、ゲノムDNAの塗抹および最終的な完全消化によって示されるように、DNA断片化の時間依存的な増加を明らかにする。場合によっては、従来のMNase消化で見られるのと同様のバンドのはしごが、消化の延長の後に観察される。これは、ヌクレオソーム枯渇領域（NDR）に結合する一般的な調節因子であるReb1...

ディスカッション

我々は、ChECが酵母タンパク質の多様なクラスを染色体上にマッピングすることができ、それが酵母の異なるファミリーのTFおよび他のクロマチン結合因子に広く適用可能であることを予期していることを示した。 ChEC-seqは、架橋、クロマチン可溶化、または抗体を必要としないという点で有利である。したがって、ChECは、不完全なタンパク質可溶化¹⁴による偽陰性など、ハ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
dNTPs	NEB	N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491L	Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polymerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001	It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, High Purity	EMD Millipore	300410-250MG	Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack	Promega	Z5342