JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。

要約

カルシウム指標の使用に神経回路のダイナミクスとその制御の私達の理解が高まります。マップを完全に神経系と透明な解剖学、線虫線虫は、カルシウムの指標を使用してリアルタイムのダイナミクスを理解するための理想的なモデルを示します。マイクロ流体技術や実験のデザインと組み合わせて、これらの指標を用いたカルシウム イメージング研究は自由移動と閉じ込められた動物で実行されます。しかし、ヴォックストロットらで説明されている嗅覚のチップなどの捕集装置を利用した前の調査があるより少なく共通の男性、両方の形態学的および構造的より一般的な両性具有者で使用するために設計されたデバイス異種。適応嗅覚チップを設計、若い大人動物を用いた男性神経イメージングにおける効率性の向上のために作製します。ターンは、動物を回転し、2 D イメージングで二国間ペア内で個々 のニューロンの分離を可能にするポートをロード ワームに組み込まれました。ワームは、以前両性研究に従ってマイクロ流体デバイス内での匂いの流れを制御する公開されます。カルシウム濃度は ImageJ のオープン ソース ソフトウェアを使用して分析しています。男性ベースのc. の elegansの量の増加対応記載手順必要がありますカルシウム イメージング研究、セックスに固有の神経信号のメカニズムの私達の理解を深めます。

概要

マイクロ流体デバイスなどを提供正確に制御された環境へのアクセス増加前記動物、線虫C. elegans、実験操作1をすることができます。これらの研究は、行動アッセイ、カルシウム イメージング、または実験結果1,2,3,4より正確な測定の結果、特定の表現型にも上映 5,6。マイクロは、試薬の最小限の量を活用しながら、詳細な実験を実行できる小規模液体条件を提供します。新しいマイクロ流体デバイス設計の一定の生産、アリーナ自然正弦波運動線虫の行動と神経イメージング研究における神経イメージング デバイスをトラップすることができるから、それぞれの使用方法が異なります・高スループットによる遺伝的形質解析画面4,5,6,7は、デバイスへの嗅覚研究。次のマスター型の製作、マイクロ流体デバイスが構築する高価な-マスターの再利用性を与えられる- で使いやすい、高スループット研究を介して迅速なデータを生成することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) などの高分子材料を用いたデバイスの作製時間以内の新しいデバイスを作成できます。

カルシウム イメージング研究は、リアルタイム8,9,10,11にこれらの細胞のダイナミクスを測定するのに遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) ターゲット細胞で発現を使用します。線虫 c. エレガンスの透過的な性質は、生きている動物のこれらの蛋白質の蛍光レベルのレコーディングのためことができます。GECIs が伝統的に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) に依存-用いたセンサー GFP カルモジュリン M13 ペプチド (GCaMP) より最近の研究より良い信号対雑音比と赤いシフト励起プロファイルを許可するこれらのセンサーを適応しています。GCaMP6s や GCaMP6f などのセンサーを含む、これらの仕様が付いている蛋白質を変化の次の GCaMP3 の開発 (低速と蛍光をオフ-料金をそれぞれ高速)、RFP カルモジュリン M13 ペプチド (RCaMP)、および赤いシフトがあります。活性化のプロフィール。線虫の細胞特異的遺伝子のプロモータ配列でこれら GECIs の組み合わせ興味、特にニューロン12,13,14,15のセルを対象します。,16。

マイクロ流体研究にc. の elegansの使いやすさを感じ取ることが、ほぼすべての研究が両性具有に焦点を当てた。男性のみは 0.01 0.02 にもかかわらず野生型人口の % は、非常に貴重な所見はその特性から生じる。両性系の物理のコネクトームは何十年も17に完全にマップされている、男性のコネクトームの動物18の頭部領域を中心に、不完全なままです。男性のカルシウム イメージングの使用は男性の神経系と 2 つの男女間の差異の理解を生成するのに役立ちます。線虫 c. エレガンスの成人男性のサイズを小さく大きいの両性具有の設計された伝統的な嗅覚デバイスの読み込みポートで効果的かつ信頼性の高いトラップを防ぎます。これに対処するためヴォックストロット嗅覚チップ19の修正版は開発された狭い読み込みポート、チャネル背の低いと、ワームのロードのポート (動物を回転)、二国間左/右の可視化が可能になります神経のペア。このデザインができます: 若い成人男性の (1) の有効なトラップ、二国間の対ニューロンの両方のメンバーと男性のニューロンの神経活動の (3) の精密な画像処理の可視化のための動物の (2) のより信頼性の高い向き。

ますます、研究は、線虫の男性が様々 な ascarosides (ascr) または線虫フェロモン20,21,22,23 に両性具有とは異なる応答を示す ,24。したがって、ダイナミクスと男性のコネクトーム内表現の理解を深めると、さらにもっと適切ななっています。男性c. の elegans含む両性25,26, に存在しない 87 セックス特定ニューロンとしてのコネクトームを変更-未定方法。これらのユニークなダイナミクスをイメージすることは、私たちはセックス固有の応答と脳内表現を理解しです。

このプロトコルは男性のc. の elegansの神経イメージングのため男性に適応した嗅覚チップの使用を説明しますその。灰は 1 M グリセリン男性、以前の雌雄同体に確実に応答する侵害受容ニューロンの研究27。Ascarosides への暴露は、テストされる動物の大きい数を必要とする動物から動物へ変数を応答を引き出すことがあります。男性固有の CEM ニューロンの応答以前示されている、電気生理学とイメージング研究、カルシウム ascaroside #323に必ず対応します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1 ですデバイス作製

注: を参照してください参照 1。

。

注: シリコン マスター 1 , 7 上の SU 8 フォトレジストをパターン化の標準的な写真平版の技術を使用してシリコン マスター金型を作製しました。ウェハ パターン形成用フォトマスクは、25,000 dpi で印刷されました。男性適合デバイス機能ヴォックストロット嗅覚チップ デザイン 19 ポートをロード、m. ジマー (個人的な対応、2016) から得られるデザインを適応させるワームに変更。ターンは、動物の回転を制御する含まれています。ポート チャネルの読み込みワームの幅は、50 μ m に狭められています。すべてのチャンネルが 32 μ m 背の高いです。ユーザーがその後に従うことができますシリコンモールド マスターがユーザーに利用可能なプロトコル、前述 1

。
  1. 重量 10:1 の比率でミックス PDMS ベースと硬化剤
    2. 。
  2. 転送ピペットを徹底的にミックスします
    3. 。
  3. すべての目に見える気泡の除去まで、1 時間真空デシケータで混合物をドガします
    4. 。
  4. は、厚さ 5 mm (100 g) それまでに 150 mm 直径の皿にシリコン金型マスターに混合物を注ぐ。パスツール ピペットを使用して混合物に導入されているほこりや泡を削除します
    5. 。
  5. 65 ° c 少なくとも 3 時間または一晩焼く
    6. 。
  6. メスを使用して、金型から PDMS を切り取って、かみそりの刃を使用して別のデバイスを切ろう
    7. 。
  7. 1 mm の皮膚穿孔器の入口と出口の穴をパンチします
    8. 。
  8. フラッシュ dH の穴 2 O, エタノール, と再び dH 2 O パンチから粒子を除去します。乾燥空気ストリーム パルス デバイス
    9. 。
  9. 粘着テープ、ほこりや成功した結合を許可するデバイスの残りの破片の取り外しを使用してデバイスの上側とチャネルの側面をきれいします
    10. 。
  10. プラズマ結合デバイス第 1 カバー ガラスに、チャネル側。
    1. 公開カバーガラスとデバイス (チャネル側を) 30 の 100 W などの適切な接合を可能にする条件を使用して空気プラズマ s か 60 24 W s.
      注: 結合効率を改善するために設定を調整できます。プラズマ接合条件が接着性能を改善するためにしようとしたときに、適切な洗浄として重要ではないです。理想的なプラズマ条件下でも不十分な洗浄装置が結合しません
      2. 。
    2. 5 の親指でダウン デバイスのチャネル側にカバーガラスを反転 s.

2。バッファーの準備

  1. 滅菌 10 x の在庫から S 基底 (100 mM NaCl と 0.05 M KPO 4、pH 6.0) x 1 Dilute
    2. 。
  2. バッファー ソリューションはすべての 1 S 基底 x 1 mM の最終濃度 1 M tetramisole 株式を希薄化します
    3. 。
  3. 両方にフルオレセインを追加、" フロー制御 "、" バッファー " 貯水池。
    1. 1 x の S の基底のフルオレセインの 100 mg/mL 素材を作成します
      2. 。
    2. フロー制御で 1 μ G/ml と 0.1 μ g/mL のバッファー内の最終濃度に株式を希薄化します
      3. 。
  4. 刺激を作成します。
    1. S 基底 × 1 で 1 M の最終濃度に希釈グリセロール
      2. 。
    2. 1 X の S の基底に 1 μ M の最終濃度に希釈 ascaroside #3 (ascr #3).

3。デバイスのセットアップ

注: 1 を参照してください

。

figure-protocol-2180
図 1。マイクロ流体デバイスのセットアップ。(A) タンクとチューブ。30 mL シリンジのプランジャーとして機能せず、" 貯水池。 " これは 3 つの流れオプション ルアーロック バルブに接続されています。1 つの出口は、マイクロ流体デバイスに接続するチューブが挿入針 (オレンジ) に接続されている他、プランジャー付き 3 mL の注射器に接続されます。(B) 全体的なマイクロ イメージング実験のセットアップ。デバイスは、対物レンズの上の逆落射蛍光顕微鏡のステージに配置されます。" フロー制御 " バッファーがセットアップ上の棚ユニットによって制御されている三方弁を通過。行バッファーは、デバイスの適切なポートに挿入されます。(C) マイクロ流体デバイスのポート。" フロー制御 " ポート側面他の入口ポート: " 刺激 " と " バッファー " ポート。" コンセント " ポートは、一番右。ワーム読み込みアリーナの場所のため、" ロード ワーム " ポートは、デバイスの中央のポート。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。
  1. 準備 3 3 ウェイ ルアーロック バルブ、3 mL シリンジと同様 ( 図 1 a) のようにルアーロック バルブに付いている針に 30 または 60 mL シリンジをアタッチすることにより流体の貯水池。マイクロ流体デバイスに拡張管に針を接続 ( 図 1 a のように -B).
  2. タンクとチューブから空気の泡を削除します
    3. 。
  3. S 基底 x 1 に接続されているチューブで 3 mL シリンジを記入し、コンセントに差し込みますポート
  4. バッファーが入口の穴の上部に表示されるまで、ゆっくり注射器に圧力を適用します
    5. 。
  5. 適切な入口の穴にフロー制御、バッファー、および刺激のチューブを接続 ( 図 1 b のように -C)、滴の液体が両方読み込みポートであることを確保する穴と添付するバッファー チューブ
    6. 。
  6. もう一度、軽くポート入口を読み込みワームに水滴が表示されるまでに、出口ポートに接続されている注射器に圧力を適用します
    7. 。
  7. ポートの読み込みワームに固体ブロックのピンを挿入
  8. 出口ポートからシリンジを外し、家真空 (-670 Torr) に接続されているコンセントの線を取り付けます
    9. 。
  9. 検査フローの任意の気泡のデバイス チャンネルは、視覚的に、カメラと互換性のあるソフトウェアを介してビデオの確認を使用、オープン ソース ソフトウェア マイクロ マネージャーなど。マイクロ マネージャーの使用に関するヒントについて、手順 6 を参照してください。
    1. 任意の気泡が存在する場合を待つ壁の任意の動物をロードする前にそれらを追放したり、PDMS に吸収される; 気泡の存在は、デバイスを介して流体の適切な流れを邪魔します
      2. 。
  10. デバイス内の適切な流動を確認 GFP フィルターを用いたワーム三方弁を作動し、バッファーの切り替えを観察することによって読み込み前。
    1. を決定する適切な流動ダイナミクス: フロー コントロールと緩衝溶液内に存在のフルオレセインを観察 ( 図 2 D -2E) コントロールを押してフロー コントロールの値が変更されたときの変更バルブのリンク ( 図 1 b) を 3 方向バルブに対応するボタン
      2. 。
    2. マイクロ マネージャーを開くと後をつけ " ライブ " デバイスのライブ画像を観察します。デバイスでバッファーの流れを観察する蛍光光源をオンに ( 図 2 D -2E).

figure-protocol-4461
図 2: 男性適応マイクロ流体嗅覚チップ。 ワームが公開されている場合のデバイスの流れ (A) パターン バッファーにします。バッファー (B) はブラウンに示すように、フロー制御 (FC) は白で刺激 (S) を黄色で表示。ポートをロード ワームはワーム向きのよりよい制御を可能にする、曲線を含むように適応されています。ワームは、刺激にさらされている場合のデバイスの流れ (B) パターン。バッファー (B) はブラウンに示すように、フロー制御 (FC) は白で刺激 (S) を黄色で表示。適応デバイス試作としての (C) の測定。42 μ m 男性の幅用 50 μ m チャネルを開けるポートをロード ワームを終了します。チャンネルの高さの測定値は、設計で 25 μ m の目標にもかかわらず、32 μ m です。(D E)A トラップ男性表現する p スラ 6:: GCaMP3。スラ 6 プロモーターは灰固有ではなく、ASI のカルシウム濃度は認められなかったが、ASI ニューロンにいくつかの表現を発生可能性があります。画像は、明視野と蛍光照明の組み合わせ (D) (E) は蛍光灯だけ。スケール バーは、堅牢な神経活動と 42 μ m. (F)、灰ニューロン応答 1 M グリセリンの刺激を示します。青色の領域は、1 M グリセリンの刺激の時間を示します。灰色の領域を示す n の標準エラー 7 ワームから 20 パルスを =。赤の痕跡を示す脱分極応答。Y は、ΔF/F 0 を表示します。スケール バーを示します 5 s. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

4 動物準備

注: を参照してください参照 23.

。
  1. イメージング灰 1 M グリセリン レスポンス。 P スラ 6 の肯定的な
    1. 場所約 20 c. の elegans 男性:: 線虫成長媒体 (NGM) 寒天プレート上に GCaMP3 配列式は芝生の エシェリヒア属大腸菌 OP50 シードします。配列陽性動物の識別のため蛍光 GECI の式および/または共同のインジェクション マーカーを使用します
      。 注: 配列の肯定的な動物、使用 GECI によると蛍光を発する (GCaMP を表現する動物 など 蛍光を発する青色光刺激の下で緑 RCaMP 動物、緑光刺激の下に赤に蛍光を発する中)。共射出マーカーは GFP と、RFP など、他の蛍光蛋白質から rol 6 などの表現型マーカーの範囲や pha 1 突然変異 28 などの支配的な表現型を救出することができます。
      1. 直前の試金、ピック若い成人男性を選ぶ場合。アッセイの前日を選ぶ場合選ぶ L4 幼虫男性
        2. 。
  2. CEM 1 μ M ascr #3 レスポンスをイメージングします。
    1. ピック約 20 L4 線虫 男性 (fkEx98 [p pkd 2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX 1];pha 1(e2123ts);彼 5(e1490);ライト 1(ce314))した dsRed 共射出マーカー式の正である
      。 注: 男性の話のレイ ニューロン内の下流式は観察し、4 つの CEM 細胞内 GCaMP 式より確認を容易にします
      2. 。
    2. イメージングの実験を実行する前に 5-14 h の OP50 エシェリヒア属大腸菌 の芝生とシード NGM 寒天プレート上の両性具有からこれらの男性を分離します
      。 注: 5 h 以上の孤立していない男性行動 ascr #3 に応答しない、したがってここでの観測より、ascaroside をさらに少ないカルシウム濃度を示すことがあります
      3. 。

5。動物読み込み

注: refefence 1 を参照してください

。
  1. 標準ワーム メンテナンス技術を使用して、シードされていない NGM 寒天プレート上に 1 つのワームをピックアップします。
    1. ピック、ピックに細菌を拾うピック (白金線を平坦化製) を燃やすことによってワーム、" を軽くたたく " それを拾うには、ワーム。独自をクロールすることができます、新しいプレートの上にワームをそっと置きます
      2. 。
  2. シードされていないプレートに約 5 mL の S の基底 x 1 を追加、プレートが殺到
    3. 。
  3. S 基底 x 1 が入力されている読み込み注射器 (すなわち、 3 mL シリンジ添付チューブ付き) にワームを引く。
    1. ワームのみチューブに、注射器にすべての道を吸うしてください
      。 注: ワームは、注射器に移動した場合、それはほぼ管にそれを取り戻すことは不可能です
      2. 。
  4. アウトレット ルアーロック バルブを回すことによって流れが停止する真空をオフにします
    5. 。
  5. ポートの読み込みワームをブロック固体ピンを削除
  6. 出口ポート ( 図 1 b) に接続して、それはガス抜きルアーロック バルブを有効にします
    。 注: 場所および動物 (ステップ 5.8 5.13) の向きを確認するライブ ビデオ フィード ワームの読み込み中を使用します
    7. 。
  7. ポートの読み込みワームにチューブを読み込みワームを挿入
  8. ワームは、チャンネルの読み込み中に表示されるまで、優しく注射器に圧力を適用します
    9. 。
  9. ワームがチャネルを入力するを防ぐためにシリンジのプランジャーを引いて、ワームに尾最初チャネルを入力する起動する場合
    10. 。
  10. を適用して頭最初チャネルに入るまで圧力を逆転を切り替える
    11. 。
  11. 3 ウェイ ルアーロック バルブを回して真空雰囲気ではなく真空を開いてする出口ポートに接続されているオープン
    12. 。
  12. 頭が自由に移動できる、方向を設定し、バッファーの流路がそう遠くないさらされているようなワームの頭を配置するシリンジのプランジャーを押すことによって手動で圧力を適用 ( 図 2 D 2E).

6。刺激と獲得

  1. マイクロ マネージャーなど顕微鏡によるオープン ソース ソフトウェアを使用して、青の光励起を使用して 10 フレーム/秒で TIFF スタックとして画像をキャプチャすることにより記録 (470 nm) 30 s.
    2. 100 さんにメイン メニューに露出を設定
    1. オープン
    2. " マルチ D Acq。 " ソフトウェアのメイン メニューから。設定、" 数 " に " 300、" と " 間隔 " に " 0 " をクリックして " 取得! " ビデオを取得する。
      3. 。
  2. 適用取得を開始した後刺激 5 s の 10 s パルス。必要に応じて刺激アプリケーションの期間を調整します。
    1. 5 を取得した後、ビデオの s 変更対象動物に刺激を適用するフロー制御バッファーを制御する三方弁です。弁リンク ( 図 1 b) の一番左のボタンをクリックします
      2. 。
    2. 刺激露出の後 10 秒 (この時間を調整することができますユーザーが望ましい)、バルブのリンクを一番左ボタンをもう一度クリックしてバッファーのフローの変更します
      3. 。
  3. 30 のウィンドウがベースラインに戻り GECI 蛍光できるように完了するまでのみバッファーの下で記録
    4. 。
  4. は、必要に応じて繰り返します。買収の終わりと次の試験の開始の間待機 30 s.

7。画像解析

  1. ImageJ、オープン ソース ソフトウェアと ImageJ ウィンドウにファイルをドラッグすると、TIFF スタックを開く
    2. 。
  2. カーソルを使用してドラッグして関心のニューロン (ROI) 関心の領域を設定します。( 図 3 a) のように関心のニューロンの相馬を含めるリージョンを設定します
    3. 。
  3. オープンをクリックしてスタックの間で投資収益率の蛍光強度の z スタックをプロット-> 画像 > スタック - > プロット z 軸プロファイル
    4. 。
  4. をクリックして " リスト " ウィンドウで開きます。[編集] - > 値をコピーするコピーします。値を貼り付けるスプレッドシート プログラムにします
    5. 。
  5. GCaMP 式が含まれていないワームの領域に投資収益率をドラッグすると、各パルスの背景の蛍光性を分析します
    6. 。
  6. ニューロンの蛍光強度の値からバック グラウンド蛍光値を減算して、パルスごとの背景差分を実行します
    7. 。
  7. ΔF/F 0 各パルスの各フレームを計算します。
    1. 最初の 1 の投資収益率の平均強度の値として計算 F 0 獲得 (例えば フレーム 1-10) の s
      2. 。
    2. ΔF/F 0 を計算 F 0 値によって興味のフレームの背景減算値で除して計算します
      3. 。
  8. イメージすべてのニューロンのすべての刺激パルスを繰り返します
    9. 。
  9. 灰, などの一貫した応答プロファイル ニューロン各ニューロンのすべてのパルスを平均し、( 図 2 f) のように SEM を計算します
    10. 。
  10. は、各ニューロンの時間をかけて sem 平均 ΔF/F 0 をプロットします
    。 注: このインスタンスそれは同様にそれぞれの試験の個々 の神経細胞の反応のヒートマップなどを含めるの一般的です。繰り返しの刺激で刺激への露出にカルシウムのトランジェントの一貫した変更を示さないニューロンまたは異なる個人 23 では、それはよりのようにの個々 の脈拍のトレースの表示に該当する可能性 図 4)。データを表示する方法を決定する方法の詳細について の議論 を参照してください
    11. 。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

全体的なデバイスの設定の例は、図 1 aBで見ることができます。図 1 aは、適切な貯水池建設とセットアップを示しています。図 1 bは、マイクロ流体デバイスに貯水池の接続を示しています。図 1は、個々 のポートをわかりやすくするためのラベル付きのマイクロ流?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

男性に適応した嗅覚チップは、男性c. の elegansの効率的なトラップの方向のより詳細に制御でき狭いロードポートにターンを組み込みます。Z スタックを必要とせず、神経の二国間ペアの左と右の両方のメンバーの可視化が可能になります。この曲線は、アッシュ (2 D 図-e)29,30などの蛍光マーカーで 1 つだけ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

男性; に対応した初期設計ファイルをご提供するマヌエル · ジマーを感謝したいと思います合成と ascr; #3 の供給のためのフランク ・ シュレーダー洞察力とイメージングと分析支援のためロス Lagoyこの原稿のレビューに貢献したクリストファー ・ シュートと一緒に、マスターの作製とローラ Aurilio.この作業に資金は国立衛生研究所の助成金 1R01DC016058-01 (バッハ)、全米科学財団助成金あわせて 1605679 (D.R.A.)、バローズ Wellcome キャリア賞科学的なインターフェイス (D.R.A.) の下で提供されました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon WaferUniversity Wafer452
SU-8 2035MicroChemY111070-0500L1GL
DeveloperMicroChemY020100-4000L1PE
Wafer MaskCad/Art Services-Custom order. Printed at 25,000 dpi.
Sylgard-184Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm Dermal PunchesAcuderm Inc.P150
Soft TubingCole-PalmerEW-06419-01
Hard TubingIDEX Health & Science1622
PinsNew England Small TubeNE-1027-12
Blocking PinsNew England Small Tube0.415/0.425" OD x .500 LongBatch PB07027
3 mL syringesBD309657
30 mL syringesVitality Medical302832Used as buffer reservoirs.
Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene LuerComponent Supply CompanyNE-231PL-50
Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterileCole-PalmerEW-30600-07
Fisherfinest Premium Cover GlassFisher Scientific12-548-5M
Mercator Control System LF-5 Plasma SystemMercatorLF-5
Scotch TapeScotchBSN43575
Series 20 ChamberWarner InstrumentsP-2
Vacuum DesicatorBel-Art Scienceware42025000024 cm inner diameter.
Weigh BoatsCole-PalmerEW-01017-27
Classic Plus BalanceMettler ToledoPB1501-S/FACT
Glass Pasteur PipettesCole-PalmerEW-25554-06
Transfer pipettesGenesee Scientific30-202
OvenSheldon Manufacturing Inc9120993Model Number: 1500E.
60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishesTriTech ResearchT3308
Zeiss Axio Observer.A1Zeiss-
Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOSHammamatsuC11440-22CU
Blue Fluorescent LightLumencorSOLA SM6-LCR-SA24-30V/7.9A DC.
Illumination AdaptorZeiss423302-0000
Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation ValveParker001-0017-9003-way valve for controlling flow.
ValveLink8.2®AutoMate Scientific01-18Flow Switch Controller
Micro ManagerMicro-Manager-Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJImageJ-Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological GradeApex9012-36-6
PeptoneApex20-260
CaCl2VWRBDH0224-1KG
MgSO4Sigma-Aldrich230391-1kg
CholesterolAlfa AesarA11470
EthanolSigma-Aldrich270741-4L
TetramisoleSigma-AldrichL9756-10(G)Store at 4 °C.
FluoresceinSigma-AldrichFD2000S-250mgLight Sensitive. Store in photoprotective vials.
GlycerolSigma-AldrichG6279-1L
Ascaroside #3--Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).
NaClGenesee Scientific18-215
KH2PO4BDHBDH9268.25
K2HPO4J.T. Baker3252-025
ASH GCaMP3 line--CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.
CEM GCaMP6 line--JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics CenterOP50
"Reservoir"--To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle.

参考文献

  1. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
  2. Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
  3. Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
  4. Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
  5. Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
  6. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023(2016).
  7. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
  8. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2(2013).
  9. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).
  10. Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31(2014).
  11. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  12. Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
  13. Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
  14. Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
  15. McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
  16. Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).
  17. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).
  18. White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
  21. Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  22. Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
  23. Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
  24. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  25. Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
  26. Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
  27. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
  28. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  29. Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037(2012).
  30. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  31. García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
  32. Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
  33. Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).
  34. Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
  35. Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

127GCaMP CEM ascaroside

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved