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要約

これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。

要約

心臓病は、世界中の人間の死の第 1 原因です。数多くの研究は、人間の肥満と心疾患との間の強力な接続を示しているより多くのツールと研究努力は良い関与の解明に必要な。世紀以上ショウジョウバエの遺伝的非常に解き得るモデルは、キー遺伝子と種を渡って節約される非常に証明した分子経路の発見に尽力されています。多くの生物的プロセスと疾患メカニズム機能開発 (例えば、ボディー プラン、心)、がん、神経変性疾患など、その場で保存されます。最近では、肥満やモデル生物で心臓病などの二次疾患の研究は人間のメタボリック症候群に関与する主調整装置の識別に非常に重要な役割を果たしています。

ここでは、効率的なツールとして、肥満、すなわち、過剰な脂肪の蓄積を誘導し、タグの蓄積の形で脂肪のコンテンツを監視する効率的なプロトコルを開発このモデル生物を使用する提案します。非常に節約されただけでなく、以下の複雑なゲノム、フライは急速な実験、費用対効果と組み合わせての短い寿命もあります。このペーパーは、高脂肪の食事療法 (HFD) 肥満と脂肪、再現性の高いことを目的に関連する増加を測定するための高スループット triacylglyceride (タグ) アッセイを誘発するショウジョウバエの餌の詳しいプロトコルを提供しますと大規模な遺伝的または化学スクリーニングのため効率的です。これらのプロトコルは、効率的に、肥満に関係する規制メカニズムの調査し同様、創薬研究開発に及ぼす薬剤の候補者の試験のための標準化されたプラットフォームを提供する新しい機会を提供または肥満、糖尿病関連代謝疾患の予防。

概要

我々 は、肥満とその関連の経済負担が世界的な問題1時間です。すべての 3 つのアメリカ人のうち 2 つは太りすぎまたは肥満関連の心臓病理学、成人2以内の死亡の主な原因であります。モデル生物を用いたメタボリック シンドロームの調節に関与する遺伝的および分子コンポーネントを適切に調査する新しい効率的な方法が必要です。この理由から、ヒトとマウス3,4,5,6を含む哺乳類で最も基本的な生物的プロセスを共有するのでミバエショウジョウバエモデルを選択します。ショウジョウバエのゲノムの進化の過程で非常に節約されたが、全体的にはるかに少ない遺伝子重複と代謝複雑さで、多くの人間の病気4に関与する基本的なメカニズムを理解するために理想的な小さい,7,8しますまた、脂肪組織、消化管によって特徴的なプロセスが実施と膵臓がフライで表され、人間9,に類似している糖・脂質代謝、たとえば、規制機能を仲介する。10,11。また、肥満、インスリン抵抗性や人間の糖尿病のコントロールに関与する基本的な分子経路はキイロショウジョウバエ12,13,14保存機能,15,16. 高等生物のようなショウジョウバエが哺乳類心臓3,17のそれに類似したプロセスによって開発中に形成される心臓の鼓動。したがって、プロトコルと高スループット タグ分析、ショウジョウバエの遺伝学的ツール ボックスを使用して有効なスクリーニング目的のために適応を供給信頼性の高い HFD の開発研究し、遺伝的基礎を理解するための重要な手段を提供します。複雑な代謝性疾患の基になります。

HFD 食品自体はほとんど18メタボリック シンドロームと関連付けられる知られている飽和脂肪酸で構成されているココナッツ オイルを添加した標準研究所はえの食糧から作られます。齧歯動物などの哺乳類モデルで肥満を誘発するヶ月19,20を取ることができる、私たちの最適化された HFD 効果的かつ再現性をもって、ショウジョウバエのプロトコルを供給増加の問題で個体の脂肪分日12,14。このプロトコルでは、タグの高スループット試金と組み合わせて効率的な検診遺伝的要因、環境の影響および脂肪質の新陳代謝の新しい変調器を発見する新薬候補の効果をことができます。その結果、これらのプロトコルは、理解や戦闘肥満および肥満関連人間の病理学に関連します。

餌のプロトコルは多目的、単一の飽和または不飽和の脂肪酸の代謝と機能の効果を研究に適用可能性があります。タグにあるこの高スループットの分析の使用、キイロショウジョウバエに限定されないが、キューティクルやタフな細胞外マトリックス (例えば、他のショウジョウバエの種、線虫と小さいモデル有機体の様々 な適応があります。およびその他の新興の無脊椎動物モデル) 代謝病期や成人期開発のあらゆる段階で異なる環境、遺伝的または生理学的な条件の下で脂肪の量を測定します。タグ アッセイは遊離脂肪酸、グリセロール、グリセロール 3-リン酸、最終的に 4-アミノアンチピリン (4-AAP) と 3, 5 - と反応して H2O2にタグが低下する酵素反応の一連の比色測定に基づいてジクロロ-2-ヒドロキシ ベンゼン スルホン酸 (3, 5 DHBS) 96 ウェルの分光光度計を用いて測定した赤い色の製品を生産します。

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プロトコル

1。 栄養 HFD

figure-protocol-63
テーブル 1。フライ食品のレシピ
。 この表は、当社のコントロールの食品を準備するための異なる材料をまとめます。食品の 10 mL バイアルに注がれ、冷却、長期的な保存のための 4 ° C で保存に行ったら、.

  1. HFD 準備
    1. 高脂肪食品の 1 キロをするためには、既製の通常はえの食糧の 700 グラムの重量を量る (表 1 参照) および分析用天秤を使用して 2 つの独立したコンテナーにココナッツ オイルの 300 g.
    2. は、内容が完全に溶けるまで電子レンジで個別に各コンテナーを熱します。はえの食糧コンテナーにココナッツ オイルを注ぐ。油はよくはえの食糧に混合するまで泡立て器を使ってかき混ぜる
      。 注: 食品や油の塊も見えるはずです。はえの食糧が電子レンジで溶けて、食べ物をミックスして沸騰を防ぐため 1 分の間隔で停止します
      3. 。
    3. 再高脂肪食品の重量を量る。総重量が 1 kg 未満のもの (食品の + 300 g ココナッツ オイルの 700 g)、水 (約 10 mL) 加熱蒸発を補うために、1 キロに体重を取り戻すことを追加
    4. 注ぐ十分に混合された約 10 mL バイアル (バイアル量の約 25%) あたり高脂肪食品。次に、ハエを防ぐために寒冷紗をかぶせて ' 汚染。室温で 1 時間冷却し、4 週間をストレージのための 4 ° C にバイアルを転送します
      。 注: 通常の食品 (NF) は、コントロール食品として使用されます。またバイアルあたり NF の 10 mL バイアル ボリューム (約 25%) を注ぐ。HFD 食糧のため、NF 食品の 30% をココナッツ オイルに置き換えます。コントロールと実験条件は、ハエは NF と HFD (バイアルあたりの食品の 10 mL) の同じ量を与えられた
      5. 。

figure-protocol-1072
図 1 。ショウジョウバエ の餌 HFD
。 スキームは、(ココナッツ オイル添加) と制御料理 (ココナッツ油 NF の添加せず通常国会) または HFD のハエの異なる餌手順を示します。全体のプロセスは、成虫の初期コレクションの後 10 日間かかります。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。
    キイロショウジョウバエ の給餌 HFD

  1. 注: このプロトコルには制御料理と HFD のフライラインと互換性のある手順を餌が含まれています。制御と実験のハエは、同じ量の食べ物 (NF または HFD) を含むバイアルに配置されます。
    1. 使用 CO 2 ハエを麻酔する
      。 注: 初心者、読み取りを参照してください発生と キイロショウジョウバエ の処理の概要について 21
      2. 。
    2. 収集 0 5 バイアル (反転) による移転から日古いハエ NF (以前は室温で暖められた) を含む新しい瓶にハエ。21 日の 5 その他のハエの年齢を聞かせて ° C
    3. 5 日間の終わりに、4 から HFD と NF を含むバイアルを取る ° C
      注: 低温が生きているハエを強調することさせて使用する前にウォーム アップするために室温で 30 分間座ってバイアル
      4. 。
    4. ワイプを使用して、きれいにし、瓶の側面から余分な水分を削除します
      5. 。
    5. についてフィルター紙の小片を挿入 1 cm × 3 cm、あらゆる余分な液体を吸収する高脂肪食品にします
      。 注: この手順は HFD 食品へのこだわりからハエを防止するため重要です
      6. 。 次に、
    6. は (反転) によって高脂肪食品にハエを転送します。5 日間の水平方向に彼らの側に (立っていない) 21-22 ° C でバイアルをレイアウトします
      。 注: これは部分的に高脂肪食品の原因、食品と死ぬに固執するハエを溶かすことができるよう高温を避けてください
      7. 。
    7. 後 5 日転送 (反転) で 30 分間空を彼らの勇気を許可するように食べ物がなくても新しい瓶に NF と HFD から飛ぶ。次に、ハエを計量に進みます
      。 注: プロトコルを供給この HFD で重要な手順の 1 つは十分に混合された HFD、はえの食糧または凝縮油の任意のチャンクの無料の準備です。均質な混合と HFD 45-30 ° c の冷却をお勧め、バイアルに注ぐと 4 ° c. の適切な年齢で、食べ物を保存する前にコントロールと実験ハエのマッチングです事前の栄養と環境条件の制御だけでなく、重要ですHFD の餌。供給フェーズでは、制御と実験ハエ与えられなければならない NF と HFD の同量。決して過密バイアルまたは (次世代影響を避けるため) にボトルからハエを収集します。NF と HFD 食餌療法の制限やその他の混雑の効果を避けるために給餌中にバイアルあたり最大 25 ハエを常に置きます。HFD は 30% ココナッツ オイルから成る、こうして 22 の ° C の上の温度は部分的に油性食品と死ぬに固執するハエを引き起こして、HFD を溶かす可能性があります。HFD のハエを置く前に、残油を削除し、食品の任意の余分な水分を吸収するフィルター紙を挿入するバイアルをクリーンアップします。、HFD のハエのインキュベーション中にバイアルはハエの無脂肪水平表面を提供するためにその両側に配置されます。
  2. ハエを計量
    1. 遺伝子型およびテストする性別ごとに事前にラベルが付いた、空の 1.7 mL の管の重量を記録する超高感度スケールを使用します
      2. 。
    2. 1.7 mL チューブの重量を量った 1 つにブラシでステータスを供給事前麻酔フライ麻酔薬または CO 2 を使用して同じ品種、性別、36 のハエを収集し、
      3. 。
    3. 同じ超高感度スケールでハエを含むチューブの重量を量ます
      4. 。
    4. は、この数式を次平均飛行重量を決定する:
      figure-protocol-3224
      注: このプロトコルでハエの数は 36 です
      5. 。
    5. フラッシュは 2 分収集の液体窒素に急落して、ハエを含む 1.7 mL の管を凍結し、チューブをボックスに入れています。-80 ° C (望ましい温度) にタグの試金で使用されるまでストレージ ボックスを次に、転送します
      。 注意: 液体窒素は非常に低温です。適切な個人用保護具を使用してください
      6. 。

2。タグ アッセイ

  1. タグの標準濃度の準備
    1. PBT の 500 mL を準備 (PBS 1 X 0.05% トリトン).
    2. 使用 0.5 mL チューブとタグ ソリューション (材料表) の準備空白 (PBT のみ) の 100 μ L、100 μ L (2 μ g/μ L 1 μ g/μ L 0.5 μ g/μ L; 0.25 μ g/μ L; 六つの標準的なタグの濃度の0.125 μ g/μ l。0.0625 μ g/μ L)、PBT と
      3. 。
    3. 氷のチューブを設置し、ハエを研削進みます
      4. 。
  2. ハエを研削
    1. -80 ° C (手順 1.3) から冷凍のハエを取る。氷に乗って飛ぶを含むチューブを転送
    2. まず、96 ウェル ボール ディスペンサーにボールを粉砕 2 mm 金属を置き、余分なボールを削除する小さなブラシを使用します
      3. 。 金属製のボールを研削板に直接転送するボール ディスペンサーとフリップの上に逆さま
    3. 96 ウェル研削場所プレート。ウェルあたり 1 つのボールがあります
      4. 。
    4. 96 ウェル研磨プレートの各行に PBT 600 μ L を追加マルチ チャンネル ピペットを使用します
      5. 。
    5. 鉗子、ウェルあたり 3 ハエを追加。96 ウェル研磨プレートの各の行/ウェル中のハエの遺伝子型、性別、食品の状態を示します
      6. 。
    6. はしっかりと 96 ウェル研削プレート キャップを置きます。テープは、漏れがないことを確認する上に配置可能性があります
      7. 。
    7. は、研削盤に 96 ウェルプレート研削を正しく配置します。最高速度およびプレスにマシンを設定 " を実行 " 3 分のハエを挽く
    8. 後 3 分、研削を停止し、プレート遠心分離に進む: 画4,000 x g、4 ° C で 15 分間 ge遠心分離の後研削プレート上澄みをペレットと混合を避けるために慎重に管理します
      9. 。
  3. サンプル読み込みとタグ定量
    1. 新しい分光光度計 96 ウェル プレートを取る。タグ試薬を 200 μ l 添加のプレートの各行を読み込むマルチ チャンネル ピペットを使用します
      2. 。
    2. 空を作成する最初の行の最初のウェルに PBT の負荷 20 μ L。上下にピペッティングで混ぜます。気泡の形成を避けるためします
      3. 。 最初の行の上下にピペッティングによるミックスの
    3. ロード 20 μ L に残り (ステップ 2.1.2) から各標準希釈の井戸。気泡の形成を避けるためします
      4. 。
    4. 分光光度計 96 ウェル プレート内の対応する行に研削板の各行から上澄みの 20 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して転送します。上下のピペットをよく混ぜます。気泡の形成を避けるためします
      5. 。
    5. 次に、96 ウェルのプレートの上にガス透過性の箔を配置します
      6. 。
    6. インキュベート 37 ° C で 10 分間でプレート
      注: 井戸の中に泡がある場合すべてのバブルを削除する 2,000 x g で 2 分間プレートを遠心分離機します。気泡の存在は吸読書を妨げます
      7. 。
    7. 550 でプレートの各ウェルの吸光度を読み取り海里に互換性のあるマイクロ プレート リーダーを使用してあります。次に、標準曲線をトレースし、未知試料の濃度 [μ g/μ L] を決定します
      8. 。
    8. あたり平均日本フライ級、タグのコンテンツの量を決定する次の数式を使用して、:
      figure-protocol-5257
      注: このプロトコルで 3 ハエが PBT 600 μ L でみじん切り; その結果、フライあたりの平均容積は 200 μ L.
  4. ブラッドフォードの試金とタンパク質含量、タグのコンテンツを正規化
    1. 7 つの準備のウシ血清アルブミン (BSA) 標準希釈液 100 μ L (200 μ G/ml; 150 μ g/mL 100 μ g/mL 75 μ g/mL 250μ g/ミリリットルです。500 μ g/ミリリットルです。1,000 μ g/mL)、PBT と
      2. 。
    2. 新しい 96 ウェル プレートし、プレートのそれぞれの行に 1 X ブラッドフォード試薬 200 μ L を読み込む
      3. 。
    3. 最初の行の最初のよく、空白を作成する PBT の 10 μ L を追加。上下にピペッティングで混ぜます。気泡の形成を避けるためします
      4. 。 最初の行の上下にピペッティングによるミックスの
    4. 追加 10 μ L に残りの各標準希釈の井戸。気泡の形成を避けるためします
      5. 。
    5. 96 ウェル プレートに対応する行に研削板の各行から培養上清中のハエの 10 μ L を転送マルチ チャンネル ピペットを使用しています。上下のピペットをよく混ぜます。気泡の形成を避けるためします
      6. 。
    6. 96 ウェルのプレートの上にガス透過性の箔を配置します
      7. 。
    7. では、5 分間室温でプレートを孵化させなさい。井戸の中に泡がある場合はそれらを削除する 2,000 x g で 2 分間プレートを遠心分離機します
      。 注: 気泡の存在は吸読書を妨げます
      8. 。
    8. 使用ブランクの吸光度を読み取り、標準と 595 で不明なサンプル分光光度計海里にあります。標準曲線を使用し、各行にサンプルの濃度 [μ g/μ L].
    9. 正規化次の数式を使用して蛋白質のレベルとコンテンツのタグ:
      figure-protocol-6233

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結果

キイロショウジョウバエ、という場合に、他の種の間にある性の二形性男女22。男性22より、腹部の脂肪質に、女性が多いことが知られています。提案プロトコルの有効性をテストするには、タグ規格研究所野生型 (w1118) の男女の違いをタグの内容にハエを決定するアッセイを行った。データは、女性がある男?...

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ディスカッション

マウスの肥満誘導は、ヶ月19,20を取ることができます。ハエ、プロトコルを供給この HFD は日以内の 18 h (図 2を参照) 後にのみ脂肪蓄積の増加を引き起こしている問題で過剰の脂肪蓄積の誘導のことができます。HFD 説明プロトコルと餌はグルコース コンテンツ12を増加し、 Bmmリパーゼと PGC 1 式

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 はこの原稿を編集のエリカ ・ テイラーを感謝したいです。この作品は、国立衛生研究所 (P01 HL098053、P01 AG033561 および R01 HL054732) r. b. に、博士課程終了後の研究サプリメント (R01 HL085481) と親睦 (AAUW) から S.B.D.、助成金、S.B.D. に米国心臓協会からの助成金によって賄われていた・ R.T.B.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Talboys Ball dropper/bead DispenserTalboys#: 930150
Talboys High Throughput HomogenizerTalboys#: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel OPS Diagnostics, LLC# GBSS 156-5000-015000 balls
Masterblock 96 Well deep MicroplatesGreiner Bio-One# T-3058-1case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottomSigma Aldrich# M443640 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell platesSigma Aldrich# C360650 sealing plates
Reagent Reservoirs Thomas Scientific# 1192T7112/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040Thermo Scientific# 46610401-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070Thermo Scientific# 466107030-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020Thermo Scientific#466102010-100ul multipipette
Multichannel tipsDenville Scientific Inc# P3131-Sfor 10 uL pipette
Multichannel tipsDenville Scientific Inc# P3133-Sfor 200 uL pipette
Multichannel tipsDenville Scientific Inc#P1125for 100 uL pipette
Forceps Roboz Surgical# 5 DumontsSuper fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64Cole-Parmer scientific experts# EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading BalanceCole-Parmer scientific experts# EW-11333-49
96-Well microplate CentrifugeHettich Zentrifugen# Rotina 420R
Microplate ReaderMolecular devices# SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker IncubatorBiostad# 3527
Infinity Triglycerides reagentThermo Scientific# TR22421
Triglyceride StandardStanbio#2103 - 030
Quick Start Bradford Protein AssayBio-RAD# 500-02051x dye Reagent
Coconut oilNutiva# 69275220001415 0z jar
PBS 10XThermo Scientific# AM9625500 ml
Triton X-100Sigma Aldrich# 9002-93-1
Gas-permeable FoilMacherey-Nagel# 74067550 pieces
filter PaperVWR# 28317-241Pack of 100
Drosophila vialsGenesee ScientificCat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin StandardBio-Rad# 5000206
FlyNap AnestheticCarolina# 173025100 mL
Kimwipes Low-LintUline# S-81151-Ply, 4.4 x 8.4"

参考文献

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