マウスの腸内細菌叢に及ぼすバクテリオシンの影響を評価する方法

要約

バクテリオシンは、異なる生態学的ニッチで微生物の多様性を定義する際に重要な役割を果たすと考えられている。ここでは、バクテリオシンが動物モデルにおける腸内微生物の組成にどのように影響するかを評価する効率的な手順を説明します。

要約

腸内微生物の組成と健康との関係、特に人口バランスの維持に寄与する要因に関連した我々の進歩的な知識には、非常に興味深い疑問が生じる。しかし、これらの要因を評価するための利用可能な方法は限られています。バクテリオシンは、食物の獲得および/またはニッチの確立のための競争上の利点を与えることができる多くの細菌によって産生される抗菌ペプチドである。多くのプロバイオティクス乳酸菌（LAB）株は、病原体の増殖を防止することにより、ヒトおよび動物の健康を促進する大きな可能性を秘めています。それらは、バクテリオシンを産生するので、免疫調節にも使用することができる。しかし、バクテリオシンの拮抗活性は、ヒトおよび動物の複雑な腸環境と比較して、明確ではあるが単純化された条件下で実験的バイオアッセイによって通常決定され、細菌は宿主および数百の微生物種同じニッチを鳴らしている。この作業は、効果を評価するための完全で効率的な手順を記述する ネズミ系において異なる標的特異性を有する種々のバクテリオシンを検出することができる。バクテリオシン処置中の微生物学的組成の変化を、組成的16S rDNA配列決定を用いてモニターする。本発明者らのアプローチは、バクテリオシン生産体とそれらの同遺伝子性非バクテリオシン産生変異体の両方を使用し、後者はバクテリオシン関連を微生物の非バクテリオシン関連修飾と区別する能力を与える。糞便DNA抽出法と16S rDNAシーケンシング法は一貫しており、バイオインフォマティクスとともに、細菌のプロファイルの微妙な変化を発見し、細菌集団と健康マーカーの間のコレステロールおよびトリグリセリド濃度に関して相関関係を確立する強力な手順を構成します。私たちのプロトコールは一般的なもので、ホストマイクを変更する可能性のある他の化合物や栄養素を研究するために使用することができます毒物学または有益な効果を研究する場合のいずれかである。

概要

バクテリオシンは、細菌種^1、2の広い範囲によって産生さ抗菌性ペプチドです。これらの化合物およびそれらの生産者、特にLABは、食品保存および医学における潜在的な応用のために何十年にもわたって世界中で探索され、利用されている³ 。いくつかのバクテリオシンは、 Listeria、Enterococcus、StaphylococcusおよびBacillusの種を含む重要な病原体を殺すことが知られている。いくつかのバクテリオシンは、免疫応答を調節する能力を有している⁴ 。多くのバクテリオシンは比較的狭いスペクトルを有し、いくつかの用途では非常に高く評価されている。例えば、いくつかの狭スペクトルバクテリオシンは、同じニッチを共有している共生または有益なフローラに大きな障害を与えることなく、問題のある細菌の選択されたグループに対して比活性を向けるために使用することができる。これは腸内環境において特に重要である多数の有益な微生物は、インタラクティブおよび動的な方法⁵に繁栄onment、。それらは腸のホメオスタシス^6、7をアンバランスできる病原体、pathobionts、または日和見細菌の（アウト）の成長を抑制することができるようにバクテリオシンは、また、予防的またはプロバイオティクスの使用に非常に魅力的です。

バクテリオシンの性質と物理化学的性質の点で、バクテリオシンは構造、標的特異性、作用様式などが非常に多様であるため、バクテリオシンは非常に多様であり、ほとんどのバクテリオシンはin vitro環境で詳細に研究されていますが、このような動物の腸^6、10のように行列^8,9またはin vivoで、。 インビトロ特性は、インビボでの複雑さのために評価された場合、大きく異なる可能性がある腸内環境および有益な細菌に対する意図しない作用の推定にもつながる。ほとんどのプロバイオティクスはLABです。それらは宿主の生理に影響を与えることが知られている短鎖脂肪酸を含む他の代謝産物の配列を産生し、ある種の細菌に対する抗菌特性を示す。したがって、バクテリオシンを産生するプロバイオティック株の場合、正常な微生物叢を有する健康な動物のような現実的なアッセイを確立することが最善である。

本研究では、バクテリオシンが異なる阻害スペクトルを有する異なるバクテリオシン産生株の健康なマウスへの影響の評価を可能にする戦略を提供する。我々の戦略は、バクテリオシン媒介性の効果を非バクテリオシン媒介性の効果から区別することを可能にする同質遺伝子非バクテリオシン突然変異体をマウスに与えることを含む。配列決定16S rDNAは、腸内の細菌集団の動的変化に追従することを可能にする。サブ等価統計分析は、細菌種間および細菌種と測定された生理学的パラメーター（ 例えば、体重、血清生化学パラメーターなど ）との間の相関を解読する。この研究で提示されたプロトコールは、生きた動物のバクテリオシンの研究を超えて、他のプロバイオティックまたはプレバイオティクスの用途にも適用可能であると考えられる。

プロトコル

ケアおよび取扱いは専門の動物ケアユニットで実施する必要があります。ここに記載されている手順は、欧州連合法および2010/63 / EUおよびスペイン政府の動物保護に関するRD 53/2013によって義務付けられている実験動物管理の原則に従って、バレンシア大学および地方当局の対応する倫理委員会によって承認された動物実験における3R原則（Replacement、Reduction、Refinement）を尊重するために、科学的目的のために使用される。

1.マウスに接種するために使用される凍結細菌培養物

1. LABの個々の株を5mLの脳心臓注入（BHI）培地に接種し、30℃で20〜24時間（一晩）培養する。
2. 2mLの終夜培養物を200mLのBHIに移すことにより、各一晩の細菌培養物をBHI中で100倍に希釈する。 30〜30℃で20〜24時間培養する。
   注：本研究で使用した菌株を表1に示す。
3. 収穫期4℃で5,000 xgで20分間遠心分離して精製する。
4. 上清を除去し、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）100mL中の各細胞ペレットを懸濁させ、ステップ1.3のように細胞を回収することにより、細胞を2回洗浄する。
5. 2回目の洗浄後、各細胞ペレットを20mLの氷冷15％グリセロール（PBS中）に懸濁する。
6. 細胞浮遊液をチューブ内の1mL容量に分注し、使用するまで-80℃で保存します。
   注：この時点から1〜2ヶ月以内に細胞を使用する必要があります。
7. 保存前および投与前の細胞数を決定し、マウスに与えられた生存細胞の数が分かるようにする。
   1. 細胞計数のために、氷冷0.9％塩化ナトリウム（NaCl）溶液中で細胞を10倍段階希釈する。 100μLの各希釈液をBHI寒天プレート上に広げる。細胞増殖およびコロニー形成のために30℃で一晩（20〜24時間）インキュベートし、コロニー形成単位（cfu）/ mLを決定するために後者をインキュベートする。
8. 細菌含有飲料水を作るためには、滅菌濾過した飲料水100mL中の各細菌ストック培養物の細胞を、最終平均cfu = 10 ⁹ / mLの水で希釈する。細菌生存評価のために、細菌処理の最初の2週間の間に、希釈直後および24時間後に生きた細胞を週に1回カウントする。

2.マウスアッセイおよび実験設計

注：この実験には、特定病原体不使用（SPF）BALB / c若い雌マウス（6〜8週間）が必要です。ここでは、合計100匹の動物を購入した。

1. 実験を通して、マウスにペレット状の食物および水を自由に摂取させる。
2. 実験を設計し、力を計算する。
   1. 各治療に独自のコントロールがある場合は、一対のケースコントロールデザイン（t-テスト）を適用します。予備アッセイを使用して、決定される最も重要な効果の平均および標準誤差を計算する。
   2. さまざまな方法と自由に利用できるプログラムを使用して、アッセイの力とグループごとに必要な動物の数を最適化する¹¹ 。
   3. バクテリオシン生産菌と非生産菌株の影響を調べるには、実験条件ごとに9匹の動物を使用する。
      注：この数値は、実験標準誤差に基づいて決定され、満足できる出力（0.7〜1.0）および有意水準0.05未満を提供した。
      注：与えられた実施例では、ケージあたり1つずつ11群のマウスを作製した。 10個のケージは、5個のバチロシン産生株および対応する5個の同質遺伝子非産生株による処理に対応した。 11 ^番目のケージは、10匹のマウスを有し、未処理の対照を構成しました。
3. 飼育施設へのマウスの到着後、ケージにそれらを分配し、個々の追跡を可能にするために動物に耳をかける。 pより前の1週間、飼育施設および条件にマウスを順応させる。転回する。
4. ステップ1.8で説明したように、細菌含有飲料水を調製し、各ケージのマウスが同じ水ボトルを共有するように、明確に識別された対応する独立したケージに飲料水ボトルを配置する。
   注：対照群は、試験された細菌と接触しない別個のケージ内に保管しなければならない。
5. 毎日新鮮な飲料水（100 mL）で新しいボトルを準備し、霜取りしたばかりのバクテリア懸濁液を加える。これを15日間連続して行います。
6. 2週間の期間、バクテリア処理に従います。その間、マウスは無菌水を飲みます （ 図1 ）。

3.サンプルの採取

1. 糞便試料を採取する。
   1. オートクレーブされたケージ（空）と滅菌鉗子を準備し、マウスごとに滅菌1.5 mLチューブをラベルする。
   2. 日中の微生物の組成の変動を避けるために、同じ時刻にサンプルを採取する1日のコース。最適な結果を得るには、新しいサンプルを別々に採取してください。
      注：マウスが自然に排便する傾向がある午前中早期に糞便を採取することが好ましい。
   3. 空のケージを70％アルコールできれいにし、マウスを入れます。それを排便させ、滅菌鉗子を用いて2〜4個の糞便を採取し、1.5mLのチューブに入れる。
      注：時々、マウスの尾を上に保持するだけで十分です。便は肛門から直接チューブに収集することができます。
   4. 4週間の実験の間、週に1回、各マウスからの糞便サンプルを収集する（ 図1 ）。マウスを細菌に曝す直前の最初のサンプル（T0、時間ゼロ）を収集する。 7,14,21、および28日目に次の糞便試料を採取する。
   5. 試料を4℃で冷蔵保存して実験室に移し、-80℃で凍結させます。事前に計画し、十分な数の貨物の貯蔵箱を用意するcalサンプルを実験中に収集する。
2. 糞便採取日に毎週全てのマウスを体重測定する。
3. 細菌投与の最後の日である15日^目にすべてのマウスの顔面静脈から血液サンプルを採取し、トリグリセリド、総コレステロール、高密度リポタンパク質（HDL）、および低密度リポタンパク質（LDL）のレベルを決定する。血清。
   注：経験豊富な人材は、動物のストレスを軽減するために血液を収集する必要があります。

4.LABカウンティングおよびバクテリオシン活性

1. 各サンプルの1つの糞便ペレットを1.5mLチューブに入れ、適量の氷冷0.9％NaClを加えて10％（w / v）溶液を得る。糞便懸濁液をホモジナイズし、氷冷0.9％NaCl中で10倍連続希釈液を調製するために、1.5mLチューブ用の無菌マイクロペストルを使用する。
2. LABセルの総数を数えます。
   1. 予熱した馬の4mLに希釈細胞（100μL）を移すn Rogosa Sharpe（MRS）軟寒天（50℃、0.8％寒天）。細胞を固体MRS寒天プレート（1.5％寒天）に注ぐ前にボルテックスして混合する。
   2. 滅菌フード内で5〜10分間蓋を外してプレートを乾燥させてから、細胞を20〜24時間30℃でインキュベートしてから細胞増殖とコロニー形成を行ってください。
3. バクテリオシン産生細胞を数える。
   1. バクテリオシンプロデューサーの希釈細胞（100μL）を4mLの予熱したMRS軟寒天（50℃、0.8％寒天）に移し、ボルテックスで混合し、MRS寒天プレート（1.5％寒天）に注ぐ。この層は第1の層と呼ばれる。
   2. 柔らかい寒天の中にすべての細胞を埋め込むために、最初の層に無細胞MRS軟寒天（0.8％寒天）をさらに4mL移す。
      注：この層は、細胞が寒天プレートの表面にコロニーとして増殖するのを防ぐことを目的としています。インジケータセルを上に注ぐと（ステップ4.3.4）、表面上に成長する細胞は容易に移動します結果の解釈が複雑になる。この層は第2の層と呼ばれる。
   3. 細胞増殖とコロニー形成のために30℃で20〜24時間インキュベートする前に、滅菌フード内で5〜10分間蓋を外してプレートを乾燥させる。
   4. バクテリオシン産生コロニーを同定するために、 表1に示すように、適切なインジケーター株の一晩培養物40μLを、予熱した軟寒天4mLと混合する。プレート上に混合物を注ぐ。この層は第3の層と呼ばれる。
   5. 細胞増殖とコロニー形成のために30℃で20〜24時間インキュベートする前に、滅菌フード内で5〜10分間蓋を外してプレートを乾燥させる。
      注：バクテリオシン産生コロニーは、コロニーの周りに明確な（阻害）ゾーンを持っています （ 図2 ）。

5. DNA抽出、16S rDNA増幅、シークエンシング

注：手順fまたはDNA抽出は、市販のキット（ 例えば、 Realpure「SSS」キット）の使用について記載されている。

1. 300μLの溶解液中に1〜2匹の糞便マウスペレット（約200mg）を懸濁する。
2. 約0.5gのガラスビーズ（直径0.1mm）を予め入れた2mLのマイクロチューブに試料を移す。
3. 10U /μLのムタノリシン1μLと20mg / mLのリゾチーム2μLを各サンプルに加え、37℃で40〜60分間インキュベートする。糞便試料¹²からのDNA抽出のための標準プロトコルの一つを進めます。
4. ビーズ - ビーターのステップを2回、それぞれ1分ずつ行う。
5. 2μLのプロテイナーゼKを添加し、完全に混合する。
6. 5分ごとに20分間インキュベートし、ボルテックスする。
7. サンプルを37°Cに冷却し、1μLの5μg/ mL RNase Aをサンプルに添加する。徹底的に混合する。
8. 37℃で30〜60分間インキュベートする。
9. サンプルを室温に冷却し、180μLのタンパク質沈殿溶液。最高速度で20〜30秒間激しくボルテックスします。
10. 15分間16,000×gで遠心分離する。上清に浮遊している粒子がある場合は、氷上で5分間サンプルをインキュベートし、再度遠心します。
11. DNAを含む上清を300μLのイソプロパノールを含む新しい1.5mLマイクロチューブに移す。
12. チューブを20〜30回転倒混和し、-20℃で1時間インキュベートする。あるいは、チューブをより長期間（ 例えば、一晩）インキュベートする。
13. 2分間16,000×gで遠心分離する。
14. 上清を除去し、チューブを吸収紙上で乾燥させる。 DNAペレットを洗浄するために300μLの70％エタノールを加える。
15. 16,000×gで1分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを約15分間乾燥させたままにする。
16. ペレットが乾燥したら、100μLの滅菌水またはTris（10mM）/ EDTA（1mM）バッファーを添加し、ペレットを再懸濁する。
17. 阻害の可能性を排除するためその後の工程中に化合物を除去し、DNAを洗浄する。ステップ5.15の結合条件を調整するために、抽出したDNAを2倍量（200μL）の緩衝液NTIと混合する。
18. PCRクリーンアップカラムを含むシリカメンブレンをコレクションチューブ（2 mL）に入れ、サンプルをロードします。
19. 11,000×gで30秒間遠心分離する。フロースルーを捨てる。
20. 緩衝液NT3700μLでシリカ膜を洗浄し、ステップ5.16を繰り返す。
21. 11,000 xgで1分間遠心分離してシリカメンブレンを乾燥させて、残留エタノール含有洗浄緩衝液NT3を除去する。
22. カラムを新しい1.5mLマイクロチューブに移し、70℃で2〜5分間インキュベートして、エタノールを完全に除去します。
23. 30μLのPCR等級の水を添加し、70℃で5分間インキュベートする。 11,000×gで1分間遠心分離して溶出する。
24. UV / Vis分光光度計または蛍光測定法を用いてDNAを定量する。
25. 同じケージを共有するマウスからのDNAサンプルを標準化しプールする ch時点である。
26. 時間の間の個々の変動を観察するために、0日目、14日目および28日目に、コントロールおよび2つの他のランダムなケージからランダムに選択した3匹のマウスのDNAサンプルを配列決定する。

6. 16S rRNA遺伝子増幅およびシークエンシング

1. 増幅された16S rRNA遺伝子のライブラリーを調製する。適切なオーバーハングアダプターを有するフォワードおよびリバースプライマーを使用して、細菌16S rRNA遺伝子⁵のV3-V4領域を増幅する：
   5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
   5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHG GGG TAT CTA ATC C-3 '
2. 1％アガロースゲル電気泳動を用いて増幅されたバンドをチェックする。
3. アンプリコン精製のために磁気ビーズを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を浄化する。
4. 使用した大規模シーケンシングプラットフォームに従って製造業者が指示するように、以下のステップを続ける> 6。

7.データ分析と統計

1. 品質フィルタリング（通常、シーケンシング施設で行われます）。
   1. 生の読み取りデータをフィルタリングし、機器に付属のソフトウェアを使用してデマルチプレックスします。
   2. USEARCH ¹⁴ （バージョン7.0.1090）で実装されたUPARSEパイプライン¹³を使用して、ペアエンドの読み取りを処理します。ペアの端をマージし、最大期待誤差（maxee）値1.0を使用して品質フィルタリングを適用します。 150nt未満の配列を捨てる。シングルトンを破棄するシーケンスをデリプリートします。
   3. 配列を97％配列同一性の操作分類学的単位（OTU）に分類し、UCHIME ¹⁵を使用してキメラ配列をフィルターする。
2. OTUピッキング、分類学的割り当ておよび系統発生的再構成、ならびに多様性分析および視覚化。
   1. Quantitative Insights Intを使用してOTUを処理するo微生物生態学（QIIME） ¹⁶ 。
   2. 最低限75％のID（デフォルト）でPyNAST ¹⁸を使用して、代表的なOTUをGreengenesコアセットデータベース¹⁷と選択して整列させます。
   3. リボソームデータベースプロジェクト（RDP）分類プログラム^19を用いて、0.8の信頼度で整列した配列にタクソノミを割り当てる。
   4. OTUテーブルを、最小シーケンス深度を有するサンプルのシーケンスカウントに正規化する。
   5. 非常に可変な領域およびすべてのギャップである位置を除去するために、濾過工程の後にFast Tree ²⁰を用いて整列した配列から系統樹を構築する。このツリーを使用してアルファとベータの多様性を計算し、希薄曲線とシャノンインデックスを計算します。
   6. 重み付けされていないUniFrac距離メトリック²¹を生成して視覚化するには、主座標分析（PCoA）を使用します。
      注記：s統計解析では、R ²²やQIIME ¹⁶内に実装された統計ツールなど、異なるソフトウェアパッケージを使用することができる。
   7. 異なる治療間の多様性のシャノン指数の比較のために、時間をRの連続従属変数として考慮するANCOVAを使用する。
   8. ボンフェローニ補正を用いて、両面スチューデントt検定を用いてQIIMEのPCoAにおける治療間の距離を比較し、1,000モンテカルロ置換を用いてノンパラメトリックp値を計算する。
   9. ピアソン相関分析を使用して、特定のOTUの相対存在量と、コレステロール、HDL、LDL などの血清レベルなどの他の測定パラメータとの間の相関関係を分析する。この目的のために、CoNet ²³を使用して、Cytoscape 3.1.1 ²⁴を使用した相関ネットワークのその後の可視化を行います。

結果

バクテリオシンの生産は、日和見バクテリアと病原体の増殖を防止すると考えられていたため、LABの陽性のプロバイオティック特徴と考えられてきた。この研究の目的は、マウスモデルにおける腸内細菌叢集団を調節するバクテリオシンの能力を示すことであった。この目的のために、バクテリオシン産生株およびそれらの同質遺伝子非産生株の摂取の効果を比較す?...

ディスカッション

ここに記載されている手順は、微生物の変化が健康状態または年齢に関係しているかどうかを判断するために使用されています。プロトコルのさまざまな部分が重要ですが、その中で糞便のサンプリング、配列決定と分析の対象となるDNA断片の選択、DNA抽出とバイオインフォマティクス解析の実行が最も重要なポイントです。倫理的理由から、マウスにストレスを与えてはならないし、腸内?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice (female)	Harlan		Mice should be 6 - 8 weeks of age
Plastic Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
Brain-Heart-Infusion broth	Conda	1400.00
European Bacteriological Agar	Pronadisa	1800.00
Agarose D1 Low EEO	Pronadisa	8010.00
1x TAE buffer	Thermo Scientific	15558042
MRS broth	Difco	288130
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
scale	Mettler Toledo	PB602-S
sterile forceps	Levantina de Laboratorios S.L.	260-3710014
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Hermle	Z383K
sodium chloride	AppliChem Panreac	121659.1211
Realpure SSS Kit	Real Life Science Solutions, Durviz, Spain	RBME04 (300 ml)
Isopropanol	AppliChem Panreac	131090.1611
Ethanol	AppliChem Panreac	131086.1214
Qubit fluorometer	Invitrogen
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
AMPure XP beads	Beckman Coulter Genomics, USA	A63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kit	Quanta BioSciences, Maryland, USA	733-2300
MiSeq v3 reagent kit	Illumina, San Diego, California, USA	MS-102-3003
Primers for 16S rRNA gene amplification			Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kit		FC-131-1002	Indices and Illumina sequencing adaptors
Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref.	Sigma	Z317314-1PAK
Glass beads, 0.1 mm diameter	Biospec Products	11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609.25
Omni Bead Ruptor 24	Omni International Inc.	19-040
mutanolysin	Sigma	M9901-10KU
lysozyme	Roche	10837059001
proteinase K	Roche	3115887001
RNase A	Sigma	R4875